Inligting

Is virale proteïenuitdrukking belangrik vir peptied-entstof?

Is virale proteïenuitdrukking belangrik vir peptied-entstof?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek wil graag weet of proteïene wat in groter hoeveelhede uitgedruk word, soos DNA-polimerase, beter entstofkandidate vir 'n T-sel-gebaseerde entstof sou wees.


Om kandidaatproteïene te vind wat as peptied-entstof gebruik kan word, moet hierdie aan sekere kriteria voldoen:

  • Die belangrikste is dat die peptied (of proteïen) gebruik word vir
    inenting sal nie 'n nouverwante volgorde hê in die organisme waarin die inenting sal plaasvind nie. Andersins kan óf geen reaksie (as gevolg van immunologiese verdraagsaamheid teenoor self) óf 'n outo-immuunreaksie plaasvind nie.
  • Die peptied/proteïen moet op die oppervlak van die mikrobe (óf virus of bakterieë) uitgedruk word, aangesien dit anders nie deur die immuunstelsel herken sal word nie. Ook domeine van 'n potensiële entstofkandidaat wat binne-in membraan is, is nie bruikbaar nie.
  • Die epitoop moet stabiel genoeg wees om as 'n entstof gebruik te word en ook op die mikrobe teenwoordig wees (anders is daar geen immuunreaksie nie).

As jy verder oor hierdie onderwerp wil lees, is daar 'n interessante Referaat van die WGO beskikbaar, wat 'n goeie inleiding gee:

Om jou vraag te beantwoord: Nee, hierdie proteïene kan nie vir hierdie doel gebruik word nie, aangesien hulle relatief nou verwant is aan dieselfde proteïene in die menslike liggaam. Dit sal waarskynlik tot geen immunologiese reaksie lei nie. Boonop is hierdie proteïene binne-in selle geleë en word dus nie aan die immuunstelsel blootgestel nie.


Die oorspronklike vraag vra oor entstofontwikkeling teen 'n virus. Mees doeltreffende anti-virale entstowwe ontlok teenliggaamreaksies wat vermoedelik beskerm deur neutralisering van virusse soos hulle die liggaam binnedring. Bob Seder het 'n goeie resensie hieroor - jy kan 'n bespreking vind wat relevant is vir hierdie onderwerp in die afdeling getiteld "Virale teikens vir die induksie van humorale immuniteit". Hierdie entstowwe sal nie noodwendig lei tot die vernietiging van besmette selle nie, aangesien dit 'n STL-funksie is.

Ek dink die hype waarna biotegnologie verwys, is in verband met terapeutiese entstowwe teen kanker, ens. wat CTL-reaksies uitlok wat kankerselle kan vernietig. Dit is egter ook belangrik om in gedagte te hou dat beide CTL's en B-selle CD4 T-selhulp nodig het om te ontwikkel - niks staan ​​alleen in die immuunstelsel nie.


Grense in Chemie

Die redakteur en beoordelaars se affiliasies is die nuutste wat op hul Loop-navorsingsprofiele verskaf word en sal moontlik nie hul situasie ten tyde van hersiening weerspieël nie.



DEEL OP

Inleiding

'n Ongekende longontsteking-uitbraak is aan die einde van Desember 2019 aangemeld, nadat verskeie sterftes in Wuhan, China, aangeteken is [1]. Daar was 'n vinnige verspreiding van die siekte vanaf die stad Wuhan na baie lande, insluitend die Verenigde State, met duisende besmet en baie sterf binne maande na aanvanklike verspreiding [1, 2]. Op 31 Desember 2019 is die siekte-uitbraak opgespoor na Coronavirus se nuwe stam [1]. Dit is later deur die WGO as SARS-CoV-2 en die siekte COVID-19 genoem [3, 4]. Verslae het getoon dat vanaf 16 Junie 2020, ten minste 440,421 bevestigde sterftes en meer as 8,144,359 bevestigde gevalle, en die huidige statistieke op 27 November tans op 1,4 miljoen sterftes is met 61,2 miljoen gevalle van infeksie [1, 5]. Die SARS-CoV-2 is geïdentifiseer as 'n nuwe stam van groep 2B Coronaviruses, met ongeveer 70% genetiese ooreenkoms met SARS-CoV, vanaf die 2003-uitbraak [4]. Die virus het 'n 96% ooreenkoms met 'n vlermuis-koronavirus, so dit word algemeen vermoed dat dit van vlermuise afkomstig is [6, 7]. Die pandemie het gelei tot reisbeperkings en landwye inperkings in verskeie lande en het gelei tot ekonomiese chaos [1]. Genoomvolgordes is in verskeie saamgestelde aanlyn biorepositories gedeponeer in die soeke na oplossings en die ontwikkeling van 'n universeel beskikbare entstof is van kritieke belang.

Koronavirusse is 'n groep virusse wat gewoonlik siektes by soogdiere en Aves veroorsaak. In mense se geval is koronavirusse verantwoordelik vir lugweginfeksies wat kan wissel van ligte, soos gevalle van verkoue en lae koors, en ander wat dodelik kan wees, soos SARS, MERS en COVID-19 [4]. Gevalle het getoon dat simptome kan verskil na gelang van die gasheer, byvoorbeeld, is siektes van die boonste lugweg by hoenders gevind en diarree by koeie en varke [6]. Die Coronavirus word onder die subfamilie gegroepeer Orthocoronavirinae, in die familie Coronaviridae, orde Nidovirales [5, 6]. Hulle is positiewe-sin enkelstrengige RNA-virusse met 'n nukleokapsied van heliese simmetrie. Hulle is ook omhul met spykerproteïene en die genoomgrootte van baie van die koronavirusse wissel van 27-34 kilobasisse, die grootste onder bekende retrovirusse [8]. Die huidige soönotiese sprong na mense is kommerwekkend aangesien die boonste lugweginfeksie by sommige individue tot dodelike siektes kan lei. Daar is nog nie 'n doeltreffende entstof om enige menslike koronavirusinfeksies te voorkom of te behandel nie [4].

Strukturele analise het aan die lig gebring dat die Spike-proteïen S1 die aanhegting van die virion aan die selmembraan fasiliteer deur interaksie met beide die ACE2- en CLEC4M/DC-SIGNR-reseptore [9]. 'n Konformasieverandering van die S-glikoproteïen word geïnduseer by die virale patogeen se internalisering in die endosomale kompartement van die gasheer [9]. Proteolise deur groep lisosomale katepsien L-families kan die samesmeltingpeptied van S2 ontmasker en membranesamesmelting binne gasheer-endosome aktiveer. Die piekproteïen S2, wat as 'n klas I virale samesmeltingsproteïen optree, bemiddel die samesmelting van die virion en sellulêre membraan. Daar is drie konformasie-eienskappe van die proteïen: pre-fusie inheemse toestand, voor-haarnaald intermediêre en post-fusie haarnaald toestand [9]. Tydens virale en teikenselmembraanfusie neem die opgerolde streke (heptad-herhalings) 'n trimeer-van-haarnaaldstruktuur aan, wat die samesmeltingpeptied naby die C-terminale gebied van die ektodomein plaas. [10]. Hierdie strukturele vorming fasiliteer die daaropvolgende samesmelting van die virale proteïen en sy teikenselmembraan [10]. By endositose tree die piekproteïen S2 op as virale samesmeltingpeptied en dit word ontmasker na S2-splyting wat tydens virusendositose plaasvind [10]. Die reseptorbindende domein (RBD) op die piekproteïen tesame met die sellulêre ACE2-reseptor wat 'n deel van die molekulêre meganisme rondom die virale toetrede en infeksie kenmerk, is geïdentifiseer [11, 12]. Studies het getoon dat die induksie van neutraliserende teenliggaampies en angiotensien-omskakelende ensiem 2 (ACE2) bindingsproses wat help met die virale toetrede, bemiddel word deur die RBD van die S1-gebied van die S-proteïen [13]. Eksperimentele studies het ook getoon dat die voortdurende uitputting van die RBD-teenliggaampies van sera-komponente die serum-neutraliserende vermoë verminder het, wat aandui dat hierdie domein dominant is in die neutraliserende teenliggaam-induksie [14]. Die S-proteïen se deurslaggewende rol in virale infeksie het dit 'n topkandidaat vir entstofproduksie gemaak. Daar is tans meer as 90 SARS-CoV-2-entstofkandidate [1], en 'n epitoop-gebaseerde entstof kan 'n nuttige komplimentêre benadering bied wat immuniteit teen immunogeniese epitope op die S-proteïen sal stuur. Met die immuno-informatika is dit nou moontlik om proteïene se immunogeniese eienskappe te evalueer deur middel van berekeningsmetodes (in silico) met hoë doeltreffendheid [15–17]. Ons het dus die In silico kontrolepunt om 'n epitoop-peptied-gebaseerde entstof teen die SARS-CoV-2-piek-glikoproteïen te ontwerp en ook die reeks reaksies in 'n prima-hupstoot-scenario na te boots.


Spike-proteïenfunksie

Die CoV's is wydverspreid in die natuur en hul soönotiese oordrag na menslike bevolkings kan epidemiese siektes veroorsaak. Nadat hulle in respiratoriese of spysverteringskanale ingegaan het, vestig hierdie virusse hulself deur lumenale makrofage en epiteelselle binne te gaan en te besmet. Die seltoegangsprogramme vir hierdie virusse word georkestreer deur die virale spike (S) proteïene wat sellulêre reseptore bind en ook virus-sel membraan samesmeltings bemiddel. Neem SARS-CoV byvoorbeeld. Die piekproteïen (S-proteïen) van SARS-CoV speel deurslaggewende rolle in virale infeksie en patogenese. S1 herken en bind aan gasheerreseptore, en daaropvolgende konformasieveranderinge in S2 fasiliteer samesmelting tussen die virale omhulsel en die gasheerselmembraan.

Modelle wat die S-gemedieerde membraanfusiegebeurtenis uitbeeld, het uitgebrei vanaf kennis van S-proteïenstrukture en -funksies. Hierdie modelle word gedeeltelik as redelik geag omdat die postfusie 6-HB-konformasies in SARS en MHV S-proteïene so treffend soortgelyk is aan postfusievorme van influensa HA2, paramyxovirus F2, Ebolavirus GP2 en MIV gp41. In analogie met hierdie meer wyd bestudeerde en goed verstaanbare virale samesmeltingsproteïene, word die CoV S-gemedieerde membraansamesmeltingsproses oor die algemeen gesien as geskematiseer in Figuur 3.

Figuur 3. Skematiese van CoV piek proteïen gemedieerde membraan samesmelting. Die illustrasies verteenwoordig verskeie stappe van S-proteïen-konformasieveranderinge wat tydens membraanfusie kan plaasvind. In die eerste stap veroorsaak reseptorbinding, pH-vermindering en/of S-proteïenproteolise dissosiasie van S1 van S2. Hierdie stap is gedokumenteer vir sommige MHV's. In die tweede stap word die samesmeltingpeptied (FP) in die gasheerselmembraan geïnterkaleer. Dit is die samesmelting-tussenstadium. In die derde stadium vou die deel van die S-proteïen naaste aan die virusmembraan weer op 'n heptad-herhaling 1 (HR1)-kern om die ses-heliks-bundel (6-HB) te vorm, wat die finale postfusie-konfigurasie van die S2-proteïen is.


Bespreking

SARS-CoV-2, die virus met 'n hoë soönotiese belang en oordragtempo, het vinnig oor die wêreld versprei en veroorsaak lewensgevaarlike COVID-19 (Gorbalenya et al., 2020). Die aantal SARS-CoV-2-infeksies en daaropvolgende sterftes neem dag vir dag toe (Tai et al., 2020), en dus is COVID-19-uitbreking as 'n openbare gesondheidsnoodgeval verklaar deur die Internasionale Kommer (Hui et al. , 2020 Zhou et al., 2020a). Wetenskaplike gemeenskap regoor die wêreld probeer om 'n doeltreffende en veilige entstof teen hierdie vinnig opkomende SARS-CoV-2 te ontwikkel (Abdelmageed et al., 2020). Alhoewel 'n groot aantal entstofkandidate vir COVID-19 nou onder toetse is, sommige van hulle is gevorderd na menslike proewe (Lane, 2020), is geeneen nog as doeltreffend en veilig verklaar vir die voorkoming van SARS-CoV-2-infeksies nie. Opvallend genoeg is daar nog geen effektiewe terapeutiese middels of entstowwe beskikbaar vir die behandeling van SARS-CoV-2-pasiënte nie (Hoque et al., 2020a). Deur 'n omvattende genomiese en proteomiese studie poog ons om 'n antigeniese multi-epitope (immunodominante) chimeriese entstof vir SARS-CoV-2 te ontwerp, genaamd CoV-RMEN (417 aa), wat die betrokkenheid van laboratoriumontsnapping virale oordrag tot niet sal maak. , verminder die koste, en kan immuniteit ontlok deur antigeen-spesifieke B- en T-selle selektief te stimuleer.

Die nuwe benadering van multi-epitope-gebaseerde (sluit geconserveerde veelvuldige epitope in) ontwerp van entstowwe verteenwoordig die indusering van spesifieke sellulêre immuniteit, en hoogs kragtige neutraliserende teenliggaampies teen infeksies (Dawood et al., 2019 Yong et al., 2019 Gralinski & Menachery, 2020 Kibria, Ullah & Miah, 2020). Hierdie epitoop-gebaseerde entstowwe bied ook verhoogde veiligheid en het die vermoë om te fokus op volhoubare immuunresponse as gevolg van die insluiting van bewaarde veelvuldige epitope. Anders as die vollengte S-proteïen, besit die RBD- en NTD-segmente kritieke neutraliserende domeine sonder enige nie-neutraliserende immunodominante streek (Ul Qamar et al., 2019 Gralinski & Menachery, 2020 Shang et al., 2020 Wrapp et al., 2020) . Mutasies op die RBD kan die nuwe stamme in staat stel om neutralisasie te ontsnap deur gevestigde RBD-gerigte teenliggaampies, vandaar dat ander funksionele streke, veral die NTD, ook oorweeg moet word vir die ontwikkeling van 'n effektiewe entstof (Wang et al., 2019 Zhou et al., 2019). Boonop het gekombineerde toediening van RBD- en NTD-proteïene hoogs kragtige neutraliserende teenliggaampies en langtermyn beskermende immuniteit in dieremodelle geïnduseer (Song et al., 2018). As die veiligheids- en doeltreffendheidsperspektiewe in ag geneem word, is die RBD en NTD meer belowende kandidate in die ontwikkeling van SARS-CoV-2-entstowwe oor die vollengte S-proteïen. Die teenwoordigheid van E- en M-proteïene op die koevert kan die immuunrespons teen SARS-CoV versterk (Millet & Whittaker, 2015 Almofti et al., 2018) en dus oorweeg word vir geskikte kandidaat vir entstofontwikkeling (Yong et al., 2020 Ahmed. , Quadeer & McKay, 2020 Gralinski & Menachery, 2020). Dus, teenliggaampies teen die immunologies aansienlike epitope van S-, M- en E-proteïene van SARS-CoV-2 sal beskermende immuniteit teen die infeksie verskaf (Yong et al., 2020 Ahmed, Quadeer & amp McKay, 2020 Gralinski & amp Menachery, 2020 Shang et al. ., 2020). Daarom sal die immuunrespons wat die RBD en/of NTD van die S-glikoproteïen-, M- en E-proteïene van SARS-CoV-2 teiken 'n belangrike profilaktiese en terapeutiese ingryping wees, wat verder in geskikte modelle getoets kan word voor kliniese proewe (Chan et al. al., 2020).

Effektiewe immuniteit teen virale infeksies is aansienlik afhanklik van aktivering van beide B- en T-selle (Shi et al., 2015 Shey et al., 2019). Daarom, wat spesifieke humorale of sellulêre immuniteit teen patogene veroorsaak, moet 'n ideale entstof beide B-sel en T-sel epitope bevat. Ons ontledings het aan die lig gebring dat geselekteerde RBD- en NTD-streke van die CoV-RMEN 'n groot hoeveelheid hoë-affiniteit B-sel, MHC Klas I, MHC Klas II en interferon-γ (IFN-γ) epitope bevat met hoë antigenisiteit tellings. Verder het membraan B-sel epitoop (MBE) en omhulsel B-sel epitoop (EBE) die algehele stabiliteit, immunogenisiteit en antigenisiteit van die CoV-RMEN verbeter. Die ontwikkeling van geheue B-selle en T-selle was duidelik, met geheue in B-selle wat vir etlike maande geduur het. Hierdie bevinding was in teenstelling met verskeie vroeëre verslae waar T-sel-gemedieerde immuunrespons as 'n langdurige reaksie beskou is in vergelyking met B-selle (Abdelmageed et al., 2020 Wrapp et al., 2020). Nog 'n boeiende bevinding van hierdie studie was die ontwikkeling van Th1-reaksie wat die groei en proliferasie van B-selle verhoog wat die aanpasbare immuniteit versterk (Carvalho et al., 2002). As 'n sterk B-selreaksie in diereproewe (muise of konyne) voorgekom het, kan hierdie teenliggaampies in diagnostiese doeleindes gebruik word, aangesien hulle die prominente antigene op die virale oppervlak moet herken (Kibria, Ullah & Miah, 2020). Boonop speel CD8+ en CD4+ T-selreaksies 'n groot rol in antivirale immuniteit (Abdelmageed et al., 2020). Nog 'n belangrike feit is dat tolagtige reseptore (TLR's) effektief kan bind met piekproteïene van die CoV (Totura et al., 2015 Zander et al., 2017), en kan 'n belangrike rol speel in die aangebore immuunrespons op SARS- CoV-2-infeksie (Shahabi et al., 2020).

Die fisies-chemiese eienskappe het ook die chimera as 'n basiese of alkaliese proteïen (pI = 8.71) onthul en sou termostabiel wees by uitdrukking, en dus sou ons voorgestelde entstof CoV-RMEN die beste geskik wees vir wêreldwye gebruik in verskillende endemiese gebiede (Shey et al. , 2019 Ul Qamar et al., 2019). Die strukturele vorms (sekondêr en tersiêr) van die CoV-RMEN, toe getoets as die sintetiese peptiede, het die vermoë getoon om in hul inheemse struktuur in te vou, en kan dus die natuurlike infeksie deur SARS-CoV-2 naboots (Almofti et al., 2018) ). Die verfynde tersiêre (3D) struktuur van die finale entstofkonstruksie het die gewenste strukturele kenmerke merkbaar aangebied, gebaseer op Ramachandran plot voorspellings (Shey et al., 2019 Srivastava et al., 2019). Molekulêre koppelanalise het getoon dat voorspelde chimeriese proteïen stabiele proteïen-proteïen-interaksies met TLR'e (TLR-2, TLR-3, TLR-4) kan vestig (Totura et al., 2015). 'n Doeltreffende aktivering van oppervlakmolekules van die CoV-RMEN is baie noodsaaklik vir immuunaktivering van dendritiese selle, en daaropvolgende antigeenverwerking en aanbieding aan CD4+ en CD8+ T-selle via MHC-II en MHC-1, onderskeidelik (Shi et al., 2015 Shey et al., 2019 Shang et al., 2020). Die molekulêre dinamika-simulasie het ook aan die lig gebring dat die gedokte CoV-RMEN-TLRs-komplekse stabiel was en meer bindingsaffiniteit TLR-3 en TLR-4 gehad het (Abraham et al., 2015). Verder het die CoV-RMEN goeie antigenisiteit-tellings op Vaxijen v2.0 en ANTIGENpro getoon, wat aandui dat hierdie peptiedvolgordes veronderstel is om hoogs antigenies van aard te wees (Shey et al., 2019). Die nie-allergene eienskappe van die CoV-RMEN versterk sy potensiaal as 'n entstofkandidaat verder (Shey et al., 2019 Ul Qamar et al., 2019).

Immuunsimulasie van die CoV-RMEN het verwagte resultate getoon wat ooreenstem met tipiese immuunresponse, en daar was 'n groeiende immuunrespons na die herhalende antigeenblootstellings (Fig. 6). Die antivirale sitokien IFN-γ en selstimulerende IL-2 vlak het aansienlik toegeneem, wat ook bydra tot die daaropvolgende immuunrespons na inenting in gasheer (Almofti et al., 2018). Dit dui op hoë vlakke van helper-T-selle en gevolglik doeltreffende teenliggaampieproduksie, wat 'n humorale reaksie ondersteun (Shey et al., 2019). 'n Laer IC50 waarde dui hoër bindingsaffiniteit van die epitope met die MHC klas I en II molekules aan. Terwyl die meeste van die vorige studies (Sakib et al., 2014 Adhikari, Tayebi & Rahman, 2018) gerapporteer het dat 'n bindende affiniteit (IC)50) drumpel van 250 nM identifiseer peptiedbinders wat deur T-selle herken word, en hierdie drempel kan gebruik word om peptiede te selekteer, ons het bindingsaffiniteit binne 50 nM gehou om beter vertrouensvlak te kry in die voorspelling van epitope vir MHC-I en MHC-II allele. Simpson-indeks beraamde klonale spesifisiteit het 'n moontlike diverse immuunrespons voorgestel en dit is aanneemlik in ag genome die gegenereerde chimeriese peptied is saamgestel uit voldoende B- en T-sel epitope (Fig. 6).

Die interaksie tussen T-sel-epitope en hul onderskeie HLA-allele het beduidende bindingsaffiniteit geopenbaar wat die immuunaktivering van B- en T-selle weerspieël soos ondersteun deur ander verslae (Srivastava et al., 2019 Jaimes et al., 2020). T-sel-epitope van RBD- en NTD-streke wat hoë interaksie met HLA-allele toon, het meer as 98% van die wêreldbevolking met verskillende etniese groepe gedek, en hierdie bevindinge het met baie van vroeëre studies bevestig (Huang et al., 2007 Jaimes et al., 2020 Ul Qamar et al., 2019). Die inkorporering van GG- en EGGE-skakelaars tussen die voorspelde epitope van die CoV-RMEN het reekse met geminimaliseerde verbindingsimmunogenisiteit geproduseer, en het die rasionele ontwerpkonstruksie van 'n kragtige multi-epitoop-entstof moontlik gemaak (Huang et al., 2007 Badawi et al., 2016 Shey et al., 2019 Srivastava et al., 2019). Die glikosilering van die oppervlakantigene help die omhulde virusse om herkenning deur die gasheer se immuunstelsel te ontduik, en kan die gasheer se vermoë beïnvloed om 'n effektiewe aanpasbare immuunrespons op te wek (Pereira et al., 2018) of selfs deur die virus uitgebuit te word om te verbeter aansteeklikheid (Wolfert & Boons, 2013). Boonop het sommige teenliggaampies soos mAb 8ANC195 ontwikkel om peptiedepitope te herken sonder afhanklikheid van glikaanbinding (Kong et al., 2015). Daar is egter geen data beskikbaar vir teenliggaampies wat spesifiek is vir piekglikoproteïene van SARS-CoV-2 nie, of hul herkenning deur die glikosilering van piek belemmer word of óf versterk kan word deur suikers naby die peptied-epitoop, óf nie deur suikermodifikasie belemmer word nie ( Zhou et al., 2020b). Verder bevat die meeste van die epitope van die CoV-RMEN geen glikosied behalwe die NTD-streek nie (Watanabe et al., 2020). Verder is die meeste van die glikane van die NTD-epitope teenwoordig by die terminii van die vermeende HLA-antigene, en mag nie inmeng met die antigeenaanbieding in 'n HLA-kompleks nie (Grant et al., 2020). Integriteit van die ACE2-reseptor van die RBD, omhulselproteïen B-sel epitoop (EBE) en membraanproteïen B-sel epitoop (MBE) in die CoV-RMEN dui daarop dat die entstof doeltreffendheid kan behou ten spyte van antigeniese drywing en glikosileringsverskynsels, solank as wat die virus teiken steeds dieselfde gasheerreseptor (Grant et al., 2020).

Een van die eerste stappe in die validering van 'n kandidaat-entstof is om deur middel van serologiese analise vir immunoreaktiwiteit te kyk. Dit vereis die uitdrukking van die rekombinante proteïen in 'n geskikte gasheer. Aangesien ons gefokus het op die epitope sonder die glikosilering of nie-beduidende glikosilering, is hoëvlak uitdrukking van die entstof geoptimaliseer in goed gevestigde en koste-effektiewe prokariotiese uitdrukkingstelsel E coli K-12-stam as die eerste keuse met behulp van die plasmied pETite wat SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier)-merker en 6x-His-merker bevat, het beide die solubilisering en affiniteitsuiwering van die rekombinante proteïen vergemaklik (Biswal et al., 2015). Kodonoptimering van die CoV-RMEN het sy hoëvlakuitdrukking in E coli (stam K12). Stabiele mRNA-struktuur, kodonaanpasbaarheidsindeks (0.87) en die GC-inhoud (50.26%) was gunstig vir hoëvlak uitdrukking van die proteïen in die bakterie. Na suksesvolle kloning van die geen, kan die rekombinante plasmied doeltreffend gepropageer word deur gebruik te maak van E coli selle, en daaropvolgende proteïenuitdrukking kan uitgevoer word in E coli K-12-stam met behulp van IPTG (Isopropyl β-d-1-tiogalaktopiranoside) induksie, en verbouing by 28 °C soos ook vroeër gerapporteer (Biswal et al., 2015).

As alternatief vir E coli, eukariotiese sellyn, HEK-293 is oorweeg vir CoV-RMEN uitdrukking. Die kodonaanpassingsindeks (CAI), GC-inhoud was onderskeidelik 1.0 en 61.60, wat 'n hoë vlak van uitdrukking van entstofkonstruksie in die HEK-293-sellyn aandui. In hierdie geval kan pSec Tag2 soogdier uitdrukkingsvektor gebruik word, wat sekresie sein het van die V-J2-C streek van die muis Ig kappa-ketting vir doeltreffende afskeiding van die rekombinante proteïen, C-terminale poli-histidien (6xHis) merker vir vinnige suiwering met C-termnale c-myc epitoop vir opsporing met 'n anti-myc teenliggaam. Om die affiniteit- en opsporingsmerkers (His tag en c-myc epitoop) na suiwering te verwyder, kan Faktor Xa-splitsingsplek (LVPR↓GS) by die C-terminaal van die CoV-RMEN gevoeg word (Waugh, 2011).


Gevektoreerde entstowwe teen koronavirus

Verskeie groepe het prekliniese evaluering gerapporteer van entstowwe wat ander virusse as vektore vir SARS-CoV-proteïene gebruik, insluitend 'n chimeriese parainfluensavirus, MVA, hondsdolheidvirus, vesikulêre stomatitisvirus (VSV) en adenovirus. Chimeriese bees/mens parainfluenza virus 3 (BHPIV3), 'n lewende verswakte parainfluenza virus entstof kandidaat, is gebruik as 'n vektor vir die SARS-CoV strukturele proteïene insluitend S, N, matriks (M) en omhulsel (E), alleen of in kombinasie. Studies met gevektoreerde entstowwe toon verder dat induksie van S-proteïenspesifieke NAbs voldoende is om beskerming te verleen.


Gevolgtrekkings

Samevattend bied ons werk die mees uitgebreide stel van beide CD4+ en CD8+ T-sel-epitope wat oor die hele SARS-CoV-2-genoom strek en 'n wye stel HLA-I- en HLA-II-allele bind. Deur hierdie epitooplys te kombineer met inagneming van proteïenuitdrukkingsvlakke, bevolkingsdekking en virale volgordebewaring sal lei tot die generering van 'n kortlys van entstof-epitope-kandidate wat waarskynlik immunogenies is in die meerderheid van die bevolking. Ons voorspelde lys van CD4+ en CD8+ T-sel-epitope sal B-sel-epitope komplementeer en dien as 'n hulpbron vir die wetenskaplike gemeenskap om kragtige SARS-CoV-2-entstof-epitope te genereer en langdurige T-sel-immuniteit te genereer.


Bespreking

Daar is byna 200 kandidaat-entstowwe onder ontwikkeling, gebaseer op 6 tegnologieplatforms: geïnaktiveerde entstowwe, proteïensubeenheid-entstowwe, mRNA-entstowwe, DNA-entstowwe, nie-repliserende/repliserende virale vektor-entstowwe, en virale-agtige deeltjie-entstof, (WGO-landskapverslag teen 3 November , 2020) (13). Onder hierdie betree 47 kandidate kliniese ontwikkeling (fase 1–3). Die voorlopige resultate van hierdie entstowwe het bevredigende immuunresponse in beide prekliniese en vroeë kliniese proeffases getoon. Byvoorbeeld, 'n mRNA-entstof wat deur Moderna ontwikkel is, wat hele piek met 2-prolienmutasies (mRNA-1273) uitdruk om die piekproteïen in voorfusievorm te stabiliseer [28, 29], het 'n robuuste NAb-reaksie en beskerming getoon na virale uitdaging in muisstamme en nie-menslike primate. CD4 + T-sel- en T-follikulêre helperselreaksies is ook opgespoor [29]. Wildtipe weergawe van spykerproteïen wat in virale vektorentstowwe gebruik word, soos ChAdOx1 nCoV-19, wat deur die Universiteit van Oxford en AstraZeneca ontwikkel is, is ook getoets. Geïmmuniseerde makake het NAb- en Th1-reaksies ontwikkel en is meestal beskerm teen virale replikasie nadat hulle uitgedaag is [30]. Ander spike-weergawes soos RBD-trimeriseringsdomein met behulp van mRNA-platform (BNT162b1) wat deur BioNTech-Pfizer ontwikkel is, is ook geëvalueer. Onlangs het Pfizer 'n direkte vergelyking tussen BNT162b1 met BNT162b2 gerapporteer wat 'n vollengte piekproteïen met di-prolienmutasies kodeer. Resultate het vergelykbare teenliggaampies getoon, maar BNT162b2 het 'n gunstiger veiligheidsprofiel verskaf [31]. Alhoewel die NAb-titers in alle entstofkandidate gerapporteer is, is die resultate moeilik om te vergelyk as gevolg van verskillende tegnieke en uitlesings in NAb-meting [32].

In hierdie studie het ons DNA-entstofplatform gekies aangesien die voordeel daarvan is dat dit in 'n beperkte kort tyd geproduseer kan word [33]. Die plasmiedruggraat en uitdrukkingstelsel wat hierin gebruik is, was voorheen bewys vir die doeltreffendheid daarvan in dengue DNA-entstof [25, 34]. Die doelwit was om die immunogenisiteit van SARS-CoV-2-piek te ondersoek, hetsy as 'n vollengte-wildtipe of afgekap as S1 of S2 in hierdie DNA-entstofontwerpplatform in muriene model.

Hier het ons getoon dat SARS-CoV-2 DNA-entstofkandidate beduidende virale spesifieke humorale en sel-gemedieerde immuunresponse ontlok het. Alhoewel RBD tans die hoofteikenantigeen in veelvuldige entstofkandidate is, het ons S of S1 eerder as RBD gekies omdat daar voorheen gerapporteer is dat die kragtige SARS-CoV-2 neutraliserende epitope ook buite die RBD-streek geleë is. Byvoorbeeld, ontleding van COVID-19 pasiënte sera het aan die lig gebring dat neutraliserende teenliggaampies ook gerig was teen epitope in N-terminaal [35] en C-terminaal [36, 37] domein van S1 proteïen. Vorige studie het ook saamgestem met hierdie bevinding dat die rekombinante S1-proteïen meer immunogenies is as die RBD wanneer totale IgG, IgA en NAb ontleed is [38]. Ontleding van IgG-subklas in alle entstofkonstrukte het 'n gemengde reaksie van IgG2a en IgG1 geopenbaar (Fig 3B). Dit het geïmpliseer dat ons SARS-CoV-2 DNA-entstofkandidate 'n gebalanseerde Th1/Th2-reaksies geïnduseer het wat die bekommernis van entstof-geassosieerde verbeterde respiratoriese siekte (VAERD) wat deur Th2-vooroordeel-entstofmodaliteit geïnduseer word, kan vermy [21].

Alhoewel die totale piekproteïenbindende teenliggaampie op 'n soortgelyke vlak in muise gevind is toe S-, S1- of S2-DNA-entstofkandidate toegedien is (Fig 3), is die betekenisvol hoogste lewende virusneutralisasie-aktiwiteit gevind in die S-DNA-entstofgroep . Laer neutraliserende aktiwiteit was waarskynlik te wyte aan die gebrek aan trimeriese struktuur van die S1-konstruk [11, 39]. Aan die ander kant vorm S-konstruksie moontlik 'n trimeriese struktuur soortgelyk aan dié van die piek op die virale struktuur [11, 39]. Boonop kan die superioriteit van S bo S1-konstrukte ook bemiddel word deur die insluiting van S2-streek [11, 40]. Soos getoon in die resultaat, is S2 hoogs immunogeen wanneer dit deur ELISA en ELISpot ontleed word, maar lae vlakke NAb is opgespoor. Gevolglik kan teenliggaampies teen S2 ten minste help om virale neutralisasie-aktiwiteit te verbeter. Byvoorbeeld, teenliggaampies gerig op samesmeltingpeptiede kan virus-selfusie voorkom [41]. Neutraliserende aktiwiteit van die teenliggaam teen samesmeltingpeptiede is geopenbaar uit COVID-19 pasiënt sera [42]. Boonop het teenliggaampies teen die verbindende heptad-herhaling (HR) 1 en HR2 (aminosuur 1148-1159) op die S2-subeenheid ook virale neutralisasie gemedieer [37].

Sel-gemedieerde immuunrespons speel ook 'n kritieke rol in virale beheer aangesien die sellulêre immuunrespons sonder teenliggaamreaksie gevind is in asimptomatiese en ligte simptome COVID-19 diagnose bevestig individue [43]. Boonop het 'n vorige studie getoon dat die meeste pasiënte wat van COVID-19 herstel het, S-proteïenspesifieke CD4 + en CD8 + T-selle in die perifere bloed gehad het [44]. Nietemin, die rol daarvan in beskerming teen SARS-CoV-2-infeksie moes nog uitgeklaar word. 'N Vorige studie van 'n SARS-CoV-1-entstofstudie in muise het 'n beskermende rol van T-selle ondersteun [45]. In hierdie studie het ons gevind dat die hoogste omvang van SARS-CoV-2-spesifieke T-selle-reaksies waargeneem is in wild-tipe S-spike DNA immunisering. Die volopste response was gerig op RBD en HR1peptiedpoele. Hierdie bevinding stem ooreen met die resultate van 'n fase 1 kliniese proef dat deelnemers wat geïmmuniseer is met 'n di-proline spike mRNA-entstofkandidaat goeie CD4 + T-selle reaksies gegenereer het teen beide S1 en S2 saamgevoegde peptiede [16]. Verder, vorige studies oor T-selle epitoop kartering beide in vivo en in silico het aan die lig gebring dat die immunodominante T-selle-epitope ook in RBD- en HR1-streke gevind word [46, 47].

In ons studie, wat egter slegs algehele splenosiet-reaksies verskaf het, sal gedetailleerde ondersoek na reaksies van verskillende helper-T-sel-subgroepe meer presiese inligting verskaf oor DNA-entstof-geïnduseerde T-sel-immuniteit. Die sitokienprofielanalise in die supernatant van gekweekte splenosiete wat met SARS-CoV-2-oorvleuelende peptiede geherstimuleer is, het die Th1-skewe reaksie in hierdie S-DNA-entstofkandidaat aan die lig gebring. Hierdie bevinding kan dus die kommer verminder wat die immunopatologie veroorsaak word deur Th2-vooroordeel-reaksie wat voorheen in MERS- en SARS CoV-1-entstowwe gevind is [48-50].

Soos gerapporteer in MERS en SARS CoV-1, teenliggaamafhanklike verbetering, is ADE een van die bekommernisse in entstofgeïnduseerde teenliggaampeaksies [51-53]. Onlangse studies het egter getoon dat anders as in MERS en SARS CoV-1, die volle lengte S of RBD van SARS CoV-2 'n robuuste neutraliserende teenliggaampeaksie ontlok het sonder om ADE in diere-immuniseringstudies te veroorsaak [54, 55]. Om hierdie kommer te bevestig, is ontleding van ADE-verskynsel geregverdig, veral in kliniese proefstudies.

Die vollengte-wildtipe-pen wat in hierdie studie gebruik is, het voorheen bewys dat dit 'n trimeriese struktuur identies aan dié van 2-prolienmutasies kan vorm [56]. Die immunogenisiteit sowel as beskermende doeltreffendheid van vollengte wildtipe spyker is ook in verskeie diermodelle gedemonstreer [30, 57, 58]. Die studie in fase I kliniese proef het getoon dat DNS-entstof met behulp van vollengte wildtipe spyker veilig was en beide teenliggaampies en T-selle-reaksies kan veroorsaak [59]. ChAdOx1 nCoV-19, die mees gevorderde entstofkandidaat wat vollengte-wildtipe aar as 'n antigeen gebruik het, word in fase III kliniese proewe (ISRCTN89951424, NCT04516746) getoets. Onlangs het tussentydse ontleding van ChAdOx1 nCoV-19-entstofproewe getoon dat die algehele doeltreffendheid van ChAdOx1 nCoV-19 70.4% was [60]. Dit het gelei tot die goedkeuring van noodgebruik van ChAdOx1 nCoV-19 in Brittanje, Indië en ander lande. Hierdie bevindinge het dus bevestig dat die vollengte wildtipe aar ook gedien word as 'n goeie kandidaat-antigeen wat 'n hoë vlak van beskerming in groot kliniese proewe kan bied.

Weens die beperking van die ABSL-3-fasiliteit kon 'n uitdagingstudie van hierdie entstofkandidate nie in hierdie studie uitgevoer word nie. Deur egter te vergelyk met die studie wat die uitlees van NAb-vlakke na PRNT-titers kan omskakel, is die PRNT-titer gemiddeld 3log10 kan muise teen lugweginfeksie beskerm [61]. This implies that the NAb titers induced by pCMVkan-S DNA immunization in this study is potentially sufficient to provide protection. However, as the correlated protective immunity has not been established for COVID-19, a challenge study in animal model to provide efficacy data is still required.

In conclusion, this study provides crucial information regarding selection of antigens for SARS-CoV-2 vaccine development. SARS-CoV-2 full length S (S1+S2) is more potent in induction of both NAb and T cells responses than the truncated S1 or S2 immunogen. This finding could be further applied for development of other vaccine modalities.


Hoofgebiede van navorsing

  • Virale toegang tot selle
  • Regulering van virale en gasheer geenuitdrukking
  • Meganismes van virale DNA replikasie
  • Biogenese van virale proteïene en deeltjies
  • Werking van virale groeifaktore en immuunverdedigingmolekules
  • Determinante van virale virulensie en patogenisiteit
  • Generasie van MHC klas I peptiede
  • Spesifisiteit en funksie van antivirale teenliggaampies
  • Ontwikkeling van rekombinante uitdrukkingsvektore, kandidaat-entstowwe en antivirale middels
  • Wye reeks DNA- en RNA-virusse, insluitend menslike/simian immuniteitsgebreksvirusse, pokkevirusse, herpesvirusse, papillomavirusse, koronavirusse, griepvirusse, alfavirusse en flavivirusse
  • Wye verskeidenheid kundigheid, insluitend molekulêre biologie, selbiologie, sellulêre immunologie, humorale immunologie, karsinogenese, rekombinante virusse, entstowwe, virale patogenese en die mikrobioom

Applications of Cell-Free Protein Expression Systems

As our knowledge of cell-free expression systems and their capabilities has continuously expanded, researchers have been able to exploit the various advantages of these systems to develop novel protein technologies. We explore some of these unique applications below.

Functional Genome and Proteome Analysis

Cell-free protein synthesis provides a basic, straightforward tool to aid in the identification of protein and molecular interactions, such as protein-protein, protein-nucleic acid, and protein-ligand. In order to characterize these interactions, one of the desired entities (nucleotide/ligand/protein etc.) is labelled, then incubated in a CFPS system with the other desired entity. The resulting complex is then either isolated utilizing a technique like immunoprecipitation, or detected directly by a electrophoretic mobility-shift assay (EMSA), in which protein interaction complexes are slowed when compared to their unbound counterparts (5).

Cell-free protein expression systems are also valuable tools for manufacturing protein arrays. Protein microarrays are solid-phase ligand binding assay systems that are utilized to track protein activity and interaction, and to determine protein function in a high-throughput format. Traditional cell-based generation of these protein chips is a labor-intensive process which requires expression and purification of each individual protein to be arrayed. Another drawback is long-term functional stability of the immobilized proteins is usually limited. The use of CFPS can circumvent these challenges, through the parallel synthesis of multiple proteins directly in situ (on-chip).

There are several different types of protein microarrays being utilized in current research, including PISA (Protein In Situ Array), NAPPA (Nucleic Acid Programmable Protein Array) and DAPA (DNA Array to Protein Array) .

Figuur 5. Proteins produced in vitro in cell-free systems exhibit varying degrees of protein function or activity, depending on the factors necessary for correct synthesis, folding and cofactor incorporation. In this illustration the protein demonstrates luminescence once the essential cofactor ATP is present.

The PISA method, the first well-known cell-free in situ protein microarray technology, involves the rapid production of tagged proteins directly from DNA fragments by cell-free expression in solution. The individual DNA constructs that encode for the protein of interest contain a T7 promoter, sequences for translation initiation and termination, as well as an N- or C-terminal tag sequence. The DNA constructs are generated via PCR or RT-PCR utilizing a high fidelity TAQ polymerase, then cell-free coupled transcription and translation expresses the desired tagged proteins (25). Following synthesis, the proteins are simultaneously captured and immobilized in situ, by the tag-capturing coating on the surface of the slide (26).

NAPPA

NAPPA is a label-based technology, in which the DNA template is biotinylated and immobilized onto a slide pre-coated with avidin and an anti-GST antibody that functions as the protein capture reagent (27). The array can then be used for to express targeted proteins in situ by using rabbit reticulocyte lysate or similar CFPS system. Following translation, the targeted proteins are captured by the immobilized antibody in each spot, resulting in a protein array in which each protein is co-localized with its corresponding expression plasmid (28).

The NAPPA method has demonstrated particular value in the characterization of disease biomarkers and study of autoimmune disease. NAPPA-generated microarrays have been used to help identify new antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome, effectively pinpointing 8 proteins with tuberculosis biomarker value (29). NAPPA has also been utilized to characterize autoantibody response in patients with the autoimmune rheumatic disease Ankylosing spondylitis (30), to profile circulating and synovial antibodies in patients with juvenile idiopathic arthritis (31), and to detect antibodies that bind tumor antigens in breast cancer (32).

The DNA array to protein array (DAPA) method was developed as a means of producing protein arrays on demand by printing them from a single DNA array template. In this method, a slide containing an array of immobilized PCR-amplified fragments encoding for a set of tagged proteins is assembled face-to-face with a second slide, pre-coated with a protein tag-capturing reagent. A permeable membrane containing a cell-free lysate is then sandwiched between the two slide surfaces, enabling coupled transcription and translation. Protein synthesis originates from the spots of the immobilized DNA, and the synthesized proteins diffuse through the membrane and are immobilized on the capture slide surface, creating the protein array (33).

Expression of Difficult-to-Express Proteins

Cell-free protein expression systems provide a means to produce functional proteins that are typically difficult to express, such as membrane proteins, toxic proteins and viral proteins. Using a coupled CFPS system, a complex heterotetrameric and multiple disulfide-bridged IgG molecule has been assembled successfully and completely under suitable oxidation and folding conditions (34). Various cell-free systems have also successfully been used to synthesize membrane proteins in vitro, including G-protein-coupled receptors, epidermal growth factor receptor and ATP synthase (35).

In vitro translation systems have also been used to successfully express viral proteins, virus-like particles (VLPs) and vaccine antigens. In one study, 124 P. falciparum genes of interest were synthesized in vitro as potential malaria vaccine candidates, resulting in the successful synthesis of 75% of the products in soluble form, without the need for codon optimization. Cell-free E coli extract systems have been applied to synthesize both VLPs and vaccines, including anti-influenza VLPs, a B-cell lymphoma vaccine and anti-hepatitis B VLPs (35).

In vitro systems have effectively produced infectious encephalomyocarditis virus (EMCV), and the entire open reading frame of hepatitis C virus RNA has been correctly translated and processed when supplemented with canine microsomal membranes (5). These studies demonstrate the enormous potential of cell-free expression systems not only as valuable tools for understanding the mechanisms of viral replication, but also as a means for vaccine discovery and prospective platform for large-scale production of vaccines (5 35).

Protein Evolution and Enzyme Engineering

Proteins are complex, versatile molecules that serve a variety of functions in the cell. Directed protein evolution is a cyclic process of alternating between the selection of functional gene variants and gene diversification, that can be utilized as a means of improving certain types of protein functions, like catalytic activity, binding affinity and thermostability (4 36). Several unique protein technologies in directed evolution, including ribosome display, mRNA display and in vitro compartmentalization, have been developed in the last thirty years using in vitro translation systems. In comparison to cell-based methods, these in vitro technologies offer several advantages, including efficient linking of genetic information (genotype) to their encoded proteins (phenotype) and broader range of library sizes.

Ribosome Display

The ribosome display method involves isolating individual proteins from polypeptide DNA sequence libraries. During in vitro translation, protein-ribosome-mRNA (PRM) complexes are established by connecting the nascent polypeptide to its encoding mRNA (1).

This PRM of interest can then be captured through affinity binding via immobilized ligand, from which the mRNA can then be recovered and reverse transcribed back into cDNA to be mutated as desired. This process can also be repeated without mutating the recovered cDNA as a means of enriching target proteins from large populations (5).

The ribosome display technology (Figure 6) has been a popular method for in vitro selection and evolution of antibodies, as well as transcription factors, receptors, proteases, enzymes, novel peptides, tag sequences and ligand-binding domains and motifs (5). Ribosome display has also been utilized in proteomics applications, leading to the identification of a sequence of 5'-untranslated region that promotes translation efficiency (37), as well as comprehensive determination of antigenic proteins for a cDNA library of Staphylococcus aureus that could be used as potential vaccine candidates (38).

Figuur 6. This illustration depicts antibody-ribosome-mRNA (ARM) complexes, which have been used as display selection particles in an in vitro eukaryotic method for selection of antibody-combining sites. An important feautre of the ARM method is that it preserves the link between the peptide of interest and the gene that encodes it.

In mRNA display technology, a large DNA library encoding the polypeptide of interest is transcribed into mRNA. The 3’ end of mRNA is ligated to a short, single-strand DNA oligonucleotide which carries an adaptor molecule, typically puromycin. The modified mRNA product is translated via cell-free protein synthesis the puromycin enters the ribosome and forms a peptide bond with the nascent polypeptide chain. Then cDNA is generated via reverse transcription to stabilize the nucleic acid component and facilitate recovery of the genetic information following selection. This cDNA can then be amplified via PCR for further study or other use (39).

This mRNA display technology has been employed in the successful directed evolution of ligases as well as ATP-binding domains from artificial random-sequence libraries (40 41). mRNA display has also been applied to obtain antigen-binding proteins that were based on the scaffold fibronectin type III, resulting in production of high-affinity molecules capable of binding TNF-alpha (42) and recognition of specific endogenous phosphorylated IkBalpha (43).

In Vitro Compartmentalization

In vitro compartmentalization (IVC) is a method of directed evolution where the objective is to split up a large reaction into many microscopic compartments, which encapsulate DNA and its associated mRNA and protein(s), in either water-in-oil emulsion microdroplets or on the surface of microbeads. Each of these droplets contain a single gene, in addition to all the necessary molecular components required, which are then transcribed and translated. Proteins that express the desired activity convert substrate into a product that will remain linked to the gene, as they are completely confined to the microdroplet. Genes that are linked to the product are either selectively enriched, amplified and characterized, or linked back to the substrate and subjected to additional rounds of selection via compartmentalization. The IVC strategy has successfully been applied in the engineering of several enzymes, including methyltransferases, polymerase and restriction endonucleases (5 44).

Screenings

Incorporating cell-free expression systems into high-throughput screening applications enables both in situ and on-demand expression of proteins and peptides. These cell-free expression high-throughput screening applications can be categorized broadly into on-chip technologies and in vitro displays, several selection methods previously discussed in the Protein Evolution and Enzyme Engineering section.

In the in vitro display selection technologies, the expressed complexes are directly screened and tested for activity, and the linked genetic sequence is used in successive rounds of enrichment. On-chip selection technologies immobilize expressed proteins in treated surfaces without their source DNA or RNA (45).

There are a variety of high-throughput screening methods currently available, all of which are capable of streamlining the traditional screening process. These screening methods include microtiter plates, digital imaging, fluorescence-activated cell sorting (FACS), cell surface display, IVTC and resonance energy transfer (46).

In vitro translation followed by screening has largely been employed in medical applications, enabling the development of the Protein Truncated Test (PTT) (Figure 7) which utilizes open reading frames of genetic diseases caused by translation-terminating mutations as diagnostics (5). Cell-free protein expression systems have also enabled screening of toxic reagents (47) and identification of translation inhibitors as potential drugs (48). Screening and production of potential vaccine candidates via in vitro protein expression led to the identification of some effective vaccines that protected mice against tumors with the same efficacy as those produced in a mammalian cell (49).

Figuur 7. This diagram illustrates production of a truncated protein (right) as compared to a normal length protein (left) using the Protein Truncation Test. This test has been used, in vitro, to determine whether a gene mutation results in a shortened translation product that may lead to a cancerous cell.

Protein Labeling and Detection

Detection of proteins expressed using cell-free systems is necessary for most applications such as protein:protein interaction and protein:nucleic acid interaction studies. Traditionally, radioactive [ 35 S]methionine has been added to cell-free expression reactions, and the methionine is incorporated into the expressed protein, allowing detection by autoradiography. Many researchers are moving away from radioactivity due to high costs, regulations, radioactive exposure and waste disposal issues. Traditional Western blot analysis provided researchers with a non-radioactive method for detection but, if performed improperly, could result in high backgrounds. However, detection methods such as FluoroTect™ GreenLys in vitro Translation Labeling System (Cat.# L5001) and the Transcend™ Non-Radioactive Translation Detection System (Cat.# L5070, L5080) allow Western blotting with sensitive detection and low backgrounds (50).

The FluoroTect™ System employs a tRNA charged with a lysine that is labeled at the e position with the BODIPY ® -FL fluorophore. These fluorescently labeled lysine residues are incorporated into synthesized proteins during in vitro translation. The Transcend™ System relies on incorporation of biotinylated lysine residues into nascent proteins during translation. The biotinylated lysine is added to the translation reaction as a charged e-labeled biotinylated-lysine:tRNA complex (Transcend™ tRNA) rather than a free amino acid. After SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and electroblotting, biotinylated proteins can be visualized by binding Streptavidin-AP or Streptavidin-HRP, followed by colorimetric or chemiluminescent detection, respectively. Typically, these methods can detect 0.5–5ng of protein, with a sensitivity equivalent to that achieved with [ 35 S]methionine incorporation and autoradiographic detection.

Transcend&trade Non-Radioactive Translation Detection Systems

The Transcend&trade Non-Radioactive Translation Detection Systems enable non-radioactive detection of proteins synthesized in vitro. Using this system, biotinylated lysine residues are incorporated into nascent proteins during translation, eliminating the need for labeling with [ 35 S]methionine or other radioactive amino acids. Biotinylated lysine is added to the translation reaction as a pre-charged e-labeled biotinylated lysine-tRNA complex (Transcend&trade tRNA) rather than a free amino acid. After SDS-PAGE and electroblotting, the biotinylated proteins can be visualized by binding either Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Streptavidin-AP) or Streptavidin-Horseradish Peroxidase (Streptavidin-HRP), followed either by colorimetric or chemiluminescent detection. Typically, 0.5&ndash5ng of protein can be detected within 3&ndash4 hours after gel electrophoresis. This sensitivity is equivalent to that achieved with [ 35 S]methionine incorporation and autoradiographic detection 6&ndash12 hours after gel electrophoresis. For a detailed protocol and background information, please see Technical Bulletin #TB182 .

Figuur 8. Schematic representation of Transcend&trade tRNA structure.

The use of Transcend™ tRNA offers several advantages:

  • No radioisotope handling, storage or disposal is needed.
  • The biotin tag allows detection (0.5–5ng sensitivity).
  • The biotin tag is stable for 12 months, both as the Transcend™ tRNA Reagent and within the labeled proteins. It is not necessary to periodically resynthesize biotin-labeled proteins, unlike [ 35 S]-labeled proteins, whose label decays over time.
  • Labeled proteins are detected as sharp gel bands, regardless of the intensity of labeling or amount loaded on the gel, thus allowing the detection of poorly expressed gene products.
  • Results can be visualized quickly, using either colorimetric or chemiluminescent detection.

The precharged E coli lysine tRNAs provided in this system have been chemically biotinylated at the e-amino group using a modification of the methodology developed by Johnson et al. (1976). The biotin moiety is linked to lysine by a spacer arm, which greatly facilitates detection by avidin/streptavidin reagents (Figure 8). The resulting biotinylated lysine tRNA molecule (Transcend™ tRNA) can be used in either eukaryotic or prokaryotic in vitro translation systems such as the T N T ® Coupled Transcription/Translation Systems, Rabbit Reticulocyte Lysate, Wheat Germ Extract or E coli S30 Extract (52). Lysine is one of the more frequently used amino acids. On average, lysine constitutes 6.6% of a protein’s amino acids, whereas methionine constitutes only 1.7% (53).

Effects of Biotinylated Lysine Incorporation on Expression Levels and Enzyme Activity

Lysine residues are common in most proteins and usually are exposed at the aqueous-facing exterior. The presence of biotinylated lysines may or may not affect the function of the modified protein. In gel shift experiments, c-Jun synthesized in T N T ® Reticulocyte Lysate reactions and labeled with Transcend™ tRNA performed identically to unlabeled c-Jun (54).

Estimating Incorporation Levels of Biotinylated Lysine

Incorporation of radioactively labeled amino acids into proteins typically is quantitated as percent incorporation of the label added. This value can include incorporation of radioactivity into spurious gene products such as truncated polypeptides. Thus, percent incorporation values provide only a rough estimate of the amount of full-length protein synthesized and do not provide any information on translation fidelity. With Transcend™ tRNA reactions, it is difficult to directly determine the percent incorporation of biotinyl-lysines into a translated protein. An alternative means of estimating translation efficiency and fidelity in Transcend™ tRNA reactions is to determine the minimum amount of products detectable after SDS-PAGE. In all cases tested, we detected translation products in 1µl of a 50µl translation reaction using as little as 0.5µl of Transcend™ tRNA (Figure 9). The amount of biotin incorporated increases linearly with the amount of Transcend™ tRNA added to the reaction, up to a maximum at approximately 2µl.

Figure 9. Effects of Transcend&trade tRNA concentration on detection of proteins synthesized in vitro. Coupled transcription/translation reactions were performed. The indicated amounts of Transcend&trade tRNA (equivalent to 2.0, 1.0, 0.5 or 0µl) were added to the translation reactions prior to incubation at 30°C for 1 hour. One microliter of the reaction was used for SDS-PAGE. The separated proteins were transferred to PVDF membrane (100V for 1 hour). The membrane was blocked in TBS + 0.5% Tween ® 20 for 15 minutes, probed with Streptavidin-AP (45 minutes), washed twice with TBS + 0.5% Tween ® 20 and twice with TBS, and incubated with Western Blue ® Substrate for 2 minutes.

Capture of Biotinylated Proteins

Biotinylated proteins can be removed from the translation reaction using biotin-binding resins such as SoftLink™ Soft Release Avidin Resin (Cat.# V2011, V2012). Nascent proteins containing multiple biotins bind strongly to SoftLink™ Resin and cannot be eluted using “soft-release” nondenaturing conditions. SoftLink™ Resin is useful, however, as a substitute for immunoprecipitation.

Colorimetric and Chemiluminescent Detection of Translation Products

Biotin-containing translation product can be analyzed in either of two ways. The product can be resolved directly by SDS-PAGE, transferred to an appropriate membrane and detected by either a colorimetric or chemiluminescent reaction (Figure 10). Alternatively, biotinylated protein can be captured from the translation mix using a biotin-binding resin such as SoftLink™ Resin. This approach is useful as a replacement for immunoprecipitation of protein complexes.

Figuur 10. Schematic of colorimetric and chemiluminescent detection of translation products.

The FluoroTect™ Green Lys in vitro Translation Labeling System

The FluoroTect™ GreenLys in vitro Translation Labeling System uses a charged lysine tRNA molecule labeled with the fluorophore BODIPY ® -FL at the epsilon (e) amino acid position of lysine (Figure 11). For the FluoroTect™ System, lysine was chosen as the labeled amino acid because it is one of the more frequently used amino acids, comprising, on average, 6.6% of a protein’s amino acids. Detection of the labeled proteins is accomplished in 2–5 minutes directly “in-gel” by use of a laser-based fluorescent gel scanner. This eliminates any requirement for protein gel manipulation such as fixing/drying or any safety, regulatory or waste disposal issues such as those associated with the use of radioactively labeled amino acids. The convenience of non-isotopic “in-gel” detection also avoids the time-consuming electroblotting and detection steps of conventional non-isotopic systems. For a detailed protocol and background information about this system, please see Technical Bulletin #TB285.

Figuur 11. Structure of FluoroTect&trade Green Lys tRNA.


Kyk die video: Vaccinologe Isabel Leroux-Roels over AstraZeneca en vaccinatie tegen COVID-19 (September 2022).


Kommentaar:

  1. Takus

    Ek sluit aan. So gebeur. Kom ons bespreek hierdie vraag.

  2. Prescott

    Ek dink dat u verkeerd is. Ek kan die posisie verdedig. Skryf vir my in PM, sal ons bespreek.

  3. Abell

    Ek is jammer dat hy 'n ander oplossing wil voorstel om in te gryp.

  4. Michon

    Ek is spyt dat ek jou nie kan help nie. Ek dink, u sal hier die regte besluit vind.

  5. Mezitilar

    Die geheel kan wees



Skryf 'n boodskap