Inligting

Proteïen wat uit die sel kom - as merker

Proteïen wat uit die sel kom - as merker



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Op soek na proteïene wat ek as ekstrasellulêre merker vir soogdierselle kan gebruik. Ek moet mRNA in die sel plaas en die proteïen buite die sel (nie op membraan nie) opspoor as die mRNA suksesvol binnekom en vertaal is. (nie GFP nie, ek benodig proteïene wat in groot getalle uit die sel kom)

Dankie.


Jy kan altyd GFP of jou gunsteling proteïen in 'n sekretoriese vektor soos pSecTag of pSecTag2 van Invitrogen/Life/ThermoFisher/SuperUltraBioMegaMart. Daar is seker ander, maar dit was die eerstes wat ek raakgeloop het. Hulle bevat die muis Igκ seinvolgorde vir doeltreffende afskeiding (so sê die webwerf, ek het dit nog nooit gebruik nie).

Ek ken nie die besonderhede van jou eksperiment nie, maar is jy seker jy wil 'n afgeskeide proteïen as 'n transfeksiemerker gebruik? Onthou, dit is moontlik dat slegs 'n klein fraksie van jou selpopulasie die vektor sal opneem (of mRNA, as dit is wat jy gebruik, maar daar is probleme daarmee), maar jy sal afgeskei proteïen sien ongeag die aantal selle wat dit opneem.


SEAP, afgeskei alkaliese fosfatase en vektore wat ontwerp is om samesmeltings met hierdie verslaggewergeen uit te druk, kan dalk goed geskik wees om jou probleem op te los.


Proteïen wat uit die sel kom - as merker - Biologie

Afgeskeide proteïene, wat saam die sekretoom uitmaak, kan gedefinieer word as proteïene wat aktief uit die sel vervoer word. By mense is selle soos endokriene selle en B-limfosiete in proteïenafskeiding gespesialiseer, maar alle selle skei proteïene tot 'n sekere mate af. Proteïene wat uit die sel afgeskei word, speel 'n deurslaggewende rol in baie fisiologiese, ontwikkelings- en patologiese prosesse en is belangrik vir beide intersellulêre en intrasellulêre kommunikasie. Benewens die feit dat dit 'n ryk bron van nuwe terapeutiese middels en geneesmiddelteikens is, is 'n groot deel van die bloeddiagnostiese toetse wat in die kliniek gebruik word gerig op afgeskeide proteïene, wat die belangrikheid van hierdie klas proteïene vir medisyne en biologie beklemtoon. Medies belangrike afgeskeide proteïene sluit sitokiene, stollingsfaktore, groeifaktore en ander seinmolekules in. Ons voorspel dat 1708 proteïene, of 9% van die menslike proteoom, afgeskei sal word op grond van resultate van veelvuldige voorspellingsmetodes.

Die mees algemene afskeidingsweg is die sekretoriese weg (Figuur 1). Nuut gesintetiseerde proteïene word vanaf die endoplasmiese retikulum (ER) vervoer, verby die Golgi-apparaat en in vesikels verpak. Die vesikels word dan na die plasmamembraan vervoer. Vesikels en plasmamembraan smelt saam, waardeur proteïene in die ekstrasellulêre ruimte vrygestel word (eksositose). Die seinvolgorde wat proteïene na die ER rig, word 'n seinpeptied (SP) genoem en bestaan ​​uit 'n kort, hidrofobiese N-terminale volgorde (von Heijne G&period (1985)). Membraanproteïene kan ook 'n SP bevat, maar meestal funksioneer die N-terminale transmembraan (TM) streek as die seinvolgorde. Die seinvolgordes word herken deur chaperone-proteïene wat die sintetiseringsribosome na die growwe ER lei, waar 'n ko-translasietranslokasie van die nuut gesintetiseerde peptied plaasvind met behulp van 'n proteïenkompleks waarna verwys word as die translokon (Johnson AE et al. (1999) )). Membraanproteïene word oorgedra na die lipieddubbellaag van die ER-membraan via die translokon, terwyl sekretoriese proteïene in die ER-lumen vrygestel word na proteolitiese splitsing van die SP. Proteïene wat die kwaliteitsbeheer in die ER-lumen slaag, word via vesikels na die Golgi-apparaat vervoer, waar hulle verder gemodifiseer en gesorteer word vir vervoer na hul eindbestemming, wat meestal die plasmamembraan, lisosome of afskeiding uit die sel is.

Figuur 1. Oorsig van die sekretoriese pad.

Die funksies van afgeskeide proteïene is uiteenlopend, maar selsein is 'n belangrike voorbeeld. Sein tussen of binne selle via afgeskeide seinmolekules kan parakrien, outokrien, endokrien of neuro-endokrien wees, afhangende van die teiken. Van die belangrikste seinproteïene is sitokiene, kinases, hormone en groeifaktore (Farhan H et al. (2011)).

'n Groot fraksie van die klinies goedgekeurde behandelingsregimes gebruik vandag middels wat gerig is op (of bestaande uit) afgeskeide proteïene of seloppervlak-geassosieerde membraanproteïene. Van die 754 proteïenteikens met bekende farmakologiese werking vir goedgekeurde middels wat tans op die mark is (Wishart DS et al. (2006)), word voorspel dat 163 afgeskei word.

Afgeskeide proteïene word dikwels in die organelle van die sekretoriese weg (ER, Golgi-apparaat, vesikels) verryk voordat dit na die ekstrasellulêre matriks vrygestel word. Dit maak 'n opsporing van die proteïen deur IF moontlik, hoewel hul eindbestemming buite die sel lê. In Figuur 2 word IF-beelde van drie voorspelde afgeskeide proteïene getoon.

Figuur 2. Voorbeelde van drie verskillende voorspelde afgeskeide proteïene word in die neuronagtige SH-SY5Y-sellyn getoon: CHGB en SCG3 word in sekretoriese vesikels aangetref, terwyl NPY in die Golgi-apparaat verryk is.

Afgeskeide proteïene kan dikwels geïdentifiseer word op grond van hul SP's, wat 'n aantal kenmerke het wat geskik is vir berekeningsvoorspellingsmodelle. Die SP is tipies 15-30 aminosure lank en word hoofsaaklik herken deur 'n kort hidrofobiese en meestal positiewe N-terminale alfa-heliks (n-streek) gekombineer met 'n hidrofobiese h-streek en 'n C-terminale polêre ongelaaide c-streek (Emanuelsson) O et al. (2007)). Daar is baie algoritmes wat hierdie kenmerke gebruik om die teenwoordigheid van SP's in proteïene te voorspel, en daar is ook 'n aantal metodes wat 'n SP voorspellingsmodel in transmembraan (TM) topologie voorspellingsalgoritmes inkorporeer, om meer betroubare resultate toe te laat wanneer dit kom by 'n SP- en 'n TM-segment te onderskei.

Die menslike 'sekretoom' kan gedefinieer word as alle gene wat vir ten minste een afgeskeide proteïen kodeer en is hier ontleed deur 'n heelproteoomskandering uit te voer deur drie metodes vir SP-voorspelling uit te voer: SignalP4.0 (Petersen TN et al. (2011) Käll L et al. (2004)), Phobius en SPOCTOPUS (Viklund H et al. (2008)), wat almal getoon het om betroubare voorspellingsresultate in vergelykende ontledings te gee. 'n Meerderheidsbesluitgebaseerde metode (MDSEC) is saamgestel deur die resultate van die drie verskillende SP-voorspellingsmetodes te gebruik om 'n lys van voorspelde afgeskeide proteïene te verkry (Uhlén M et al. (2015)). Alle proteïene met 'n voorspelde SP deur ten minste twee van die drie metodes word as afgeskei beskou en dit is verder geannoteer om gene wat voorspel word om in intrasellulêre liggings soos ER of Golgi te woon, uit te sluit, ten spyte van 'n seinpeptiedvoorspelling, stel. Aangesien seinpeptiede beide in afgeskeide proteïene en in sekere tipes membraanproteïene gevind word, is die resultate gefiltreer deur gebruik te maak van die meerderheidsbesluitgebaseerde metode (MDM) vir membraanproteïentopologievoorspelling (Fagerberg L et al. (2010)). Alle proteïene met 'n voorspelde SP in kombinasie met 'n voorspelde TM-gebied volgens die MDM word beskou as membraan-omspannend en dus nie afgeskei nie. Die gevolglike getalle gene wat kodeer vir 'n voorspelde afgeskeide proteïen gebaseer op die drie metodes sowel as die meerderheidsbesluitgebaseerde metode en die resultaat van annotasie van die sekretoom word in Tabel 1 getoon. Die resulterende lyste van voorspelde afgeskeide proteïene sowel as voorspelde membraan proteïene is gebruik as 'n klassifikasie van die menslike proteoom.

Tabel 1. Voorspelling van die menslike sekretoom deur drie verskillende voorspellingsmetodes vir seinpeptiede sowel as die MDSEC en die finale voorspelling wat uit handaantekening voortspruit.

Proteïen klas Aantal gene Aantal proteïene Bron
Voorspelde afgeskei proteïene 1708 4361 HPA
Afgeskei proteïene voorspel deur MDSEC 2943 6743 HPA
SignalP het afgeskeide proteïene voorspel 2525 5816 SeinP
Phobius het afgeskei proteïene voorspel 3338 7613 Phobius
SPOCTOPUS het afgeskeide proteïene voorspel 3710 8165 SPOKTOPUS

'n Ontleding van weefselverspreidingskategorieë gebaseer op RNA-volgordedata toon dat 'n groter fraksie van die gene wat kodeer vir afgeskeide proteïene aan die weefselversterkte, weefselverrykte of groepverrykte gene behoort, in vergelyking met alle gene wat in die Sel Atlas (Uhlén M et al.) (2015)) (Figuur 3). Slegs 'n relatief klein gedeelte van die gene in die sekretoom toon lae weefselspesifisiteit. Dit stem ooreen met die weefselspesifieke funksies vir baie afgeskeide proteïene. Die afgeskeide klas bevat baie van die gene wat die meeste uitgedruk word en die hoogste uitdrukkingsvlakke van afgeskeide proteïene word in pankreas en speekselklier aangetref.

Figuur 3. Staafdiagram wat die persentasie gene in verskillende weefselspesifisiteitskategorieë vir afgeskeide proteïenkoderende gene toon, in vergelyking met alle gene in die Sel Atlas. Asterisk dui op 'n statisties beduidende afwyking (p≤0.05) in die aantal gene in 'n kategorie gebaseer op 'n binomiale statistiese toets. Elke balk is klikbaar en gee 'n soekresultaat van proteïene wat tot die geselekteerde kategorie behoort.

Parikh K et al., Kolonepiteelseldiversiteit in gesondheid en inflammatoriese dermsiekte Natuur&periode (2019)
PubMed: 30814735 DOI: 10.1038/s41586-019-0992-y

Menon M et al., Enkelsel transkriptomiese atlas van die menslike retina identifiseer seltipes wat verband hou met ouderdomsverwante makulêre degenerasie. Nat Commun&periode (2019)
PubMed: 31653841 DOI: 10.1038/s41467-019-12780-8

Wang L et al., Enkelselrekonstruksie van die volwasse menslike hart tydens hartversaking en herstel onthul die sellulêre landskap onderliggend aan hartfunksie. Nat Cell Biol&periode (2020)
PubMed: 31915373 DOI: 10.1038/s41556-019-0446-7

Wang Y et al., Enkelseltranskriptoomanalise onthul differensiële voedingstofabsorpsiefunksies in menslike ingewande. J Exp Med&periode (2020)
PubMed: 31753849 DOI: 10.1084/jem.20191130

Liao J et al., Enkelsel-RNA-volgordebepaling van menslike nier&periode Wetenskaplike data&periode (2020)
PubMed: 31896769 DOI: 10.1038/s41597-019-0351-8

MacParland SA et al., Enkelsel-RNA-volgordebepaling van menslike lewer openbaar duidelike intrahepatiese makrofaagpopulasies. Nat Commun&periode (2018)
PubMed: 30348985 DOI: 10.1038/s41467-018-06318-7

Vieira Braga FA et al., 'n Sellulêre sensus van menslike longe identifiseer nuwe seltoestande in gesondheid en in asma Nat Med&periode (2019)
PubMed: 31209336 DOI: 10.1038/s41591-019-0468-5

Vento-Tormo R et al., Enkelsel rekonstruksie van die vroeë moeder-fetale koppelvlak in mense Natuur&periode (2018)
PubMed: 30429548 DOI: 10.1038/s41586-018-0698-6

Qadir MMF et al., Enkel-sel resolusie analise van die menslike pankreas ductale progenitor sel nis Proc Natl Acad Sci U S A&periode (2020)
PubMed: 32354994 DOI: 10.1073/pnas.1918314117

Solé-Boldo L et al., Enkelseltranskriptome van die menslike vel openbaar ouderdomverwante verlies van fibroblast-priming&periode Commun Biol&periode (2020)
PubMed: 32327715 DOI: 10.1038/s42003-020-0922-4

Henry GH et al., 'n Sellulêre anatomie van die normale volwasse menslike prostaat en prostaat-uretra Sel Rep&periode (2018)
PubMed: 30566875 DOI: 10.1016/j.celrep.2018.11.086

Chen J et al., PBMC-fiksasie en verwerking vir Chroom-enkelsel-RNA-volgordebepaling J Transl Med&periode (2018)
PubMed: 30016977 DOI: 10.1186/s12967-018-1578-4

Guo J et al., Die volwasse menslike testis transkripsionele sel atlas. Sel Res. (2018)
PubMed: 30315278 DOI: 10.1038/s41422-018-0099-2

Uhlen M et al., 'n Voorstel vir validering van teenliggaampies. Nat Metodes. (2016)
PubMed: 27595404 DOI: 10.1038/nmeth.3995

Stadler C et al., Sistematiese validering van teenliggaambinding en proteïen subsellulêre lokalisering met behulp van siRNA en konfokale mikroskopie. J Proteomika. (2012)
PubMed: 22361696 DOI: 10.1016/j.jprot.2012.01.030

Poser I et al., BAC TransgeneOmics&colon 'n hoë-deursetmetode vir die verkenning van proteïenfunksie in soogdiere&periode Nat Metodes&periode (2008)
PubMed: 18391959 DOI: 10.1038/nmeth.1199

Skogs M et al., Teenliggaamvalidering in biobeeldingstoepassings gebaseer op endogene uitdrukking van gemerkte proteïene. J Proteome Res. (2017)
PubMed: 27723985 DOI: 10.1021/acs.jproteome.6b00821

Takahashi H et al., 5'-eindgesentreerde uitdrukkingsprofiel deur gebruik te maak van cap-analise geenuitdrukking en volgende generasie volgordebepaling&periode Nat Protoc&periode (2012)
PubMed: 22362160 DOI: 10.1038/nprot.2012.005

Lein ES et al., Genoomwye atlas van geenuitdrukking in die volwasse muisbrein Natuur&periode (2007)
PubMed: 17151600 DOI: 10.1038/nature05453

Kircher M et al., Dubbele indeksering oorkom onakkuraathede in multipleks-volgordebepaling op die Illumina-platform&periode Nukleïensure Res&periode (2012)
PubMed: 22021376 DOI: 10.1093/nar/gkr771

Pollard TD et al., Actin&comma 'n sentrale speler in selvorm en beweging&periode Wetenskap&periode (2009)
PubMed: 19965462 DOI: 10.1126/science.1175862

Mitchison TJ et al., Aktiengebaseerde selmotiliteit en selbeweging Sel&periode (1996)
PubMed: 8608590

Pollard TD et al., Molekulêre Meganisme van Sitokinese&periode Annu Rev Biochem&periode (2019)
PubMed: 30649923 DOI: 10.1146/annurev-biochem-062917-012530

dos Remedios CG et al., Aktienbindende proteïene en kolonregulering van sitoskeletale mikrofilamente Fisiol Rev&periode (2003)
PubMed: 12663865 DOI: 10.1152/physrev.00026.2002

Campellone KG et al., 'n Kern-wapenwedloop en kolon sellulêre beheer van aktiensamestelling Nat Rev Mol Cell Biol&period (2010)
PubMed: 20237478 DOI: 10.1038/nrm2867

Rottner K et al., Aktiensamestellingsmeganismes in 'n oogopslag&periode J Cell Sci&periode (2017)
PubMed: 29032357 DOI: 10.1242/jcs.206433

Voël RP&periode, Waarneming en kwantifisering van afwykende kripte in die muriene kolon behandel met 'n kolon karsinogeen en kolon voorlopige bevindings en periode Kanker Lett&periode (1987)
PubMed: 3677050 DOI: 10.1016/0304-3835(87)90157-1

HUXLEY AF et al., Strukturele veranderinge in spiere tydens sametrekking en semi-interferensie mikroskopie van lewende spiervesels Natuur&periode (1954)
PubMed: 13165697

HUXLEY H et al., Veranderinge in die dwarsstrepe van spiere tydens sametrekking en strek en hul strukturele interpretasie&periode Natuur&periode (1954)
PubMed: 13165698

Svitkina T&periode, Die Actin Sitoskelet en Actin-Based Motility&period Cold Spring Harb Perspect Biol&periode (2018)
PubMed: 29295889 DOI: 10.1101/cshperspect.a018267

Kelpsch DJ et al., Kernaktien & kolon Van ontdekking tot funksie&periode Anat Rec &lparHoboken&rpar&periode (2018)
PubMed: 30312531 DOI: 10.1002/ar.23959

Malumbres M et al., Selsiklus & komma CDK's en kanker & kolon 'n veranderende paradigma&periode Nat Rev Kanker&periode (2009)
PubMed: 19238148 DOI: 10.1038/nrc2602

Massagué J&period, G1 selsiklus beheer en kanker&periode Natuur&periode (2004)
PubMed: 15549091 DOI: 10.1038/nature03094

Hartwell LH et al., Selsiklusbeheer en kanker&periode Wetenskap&periode (1994)
PubMed: 7997877 DOI: 10.1126/science.7997877

Barnum KJ et al., Selsiklusregulering deur kontrolepunte&periode Metodes Mol Biol&periode (2014)
PubMed: 24906307 DOI: 10.1007/978-1-4939-0888-2_2

Weinberg RA&periode, Die retinoblastoom proteïen en selsiklus beheer&periode Sel&periode (1995)
PubMed: 7736585 DOI: 10.1016/0092-8674(95)90385-2

Morgan DO&periode, Beginsels van CDK-regulering&periode Natuur&periode (1995)
PubMed: 7877684 DOI: 10.1038/374131a0

Teixeira LK et al., Ubiquitin-ligases en selsiklusbeheer&periode Annu Rev Biochem&periode (2013)
PubMed: 23495935 DOI: 10.1146/annurev-biochem-060410-105307

King RW et al., Hoe proteolise die selsiklus dryf&periode Wetenskap&periode (1996)
PubMed: 8939846 DOI: 10.1126/science.274.5293.1652

Cho RJ et al., Transkripsionele regulering en funksie gedurende die menslike selsiklus&periode Nat Genet&periode (2001)
PubMed: 11137997 DOI: 10.1038/83751

Whitfield ML et al., Identifikasie van gene wat periodiek in die menslike selsiklus uitgedruk word en hul uitdrukking in gewasse Mol Biol Sel&periode (2002)
PubMed: 12058064 DOI: 10.1091/mbc.02-02-0030.

Boström J et al., Vergelykende selsiklus-transkriptomika openbaar sinchronisasie van ontwikkelings-transkripsiefaktornetwerke in kankerselle. PLoS Een. (2017)
PubMed: 29228002 DOI: 10.1371/journal.pone.0188772

Lane KR et al., Selsiklus-gereguleerde proteïenoorvloedveranderinge in sinchronies prolifererende HeLa-selle sluit regulering van pre-mRNA-splytingsproteïene in. PLoS One&periode (2013)
PubMed: 23520512 DOI: 10.1371/journal.pone.0058456

Ohta S et al., Die proteïensamestelling van mitotiese chromosome bepaal met behulp van multiklassifiseerder kombinatoriese proteomika&periode Sel&periode (2010)
PubMed: 20813266 DOI: 10.1016/j.cell.2010.07.047

Ly T et al., 'n Proteomiese chronologie van geenuitdrukking deur die selsiklus in menslike myeloïde leukemie selle&periode Elife&periode (2014)
PubMed: 24596151 DOI: 10.7554/eLife.01630

Pagliuca FW et al., Kwantitatiewe proteomika onthul die basis vir die biochemiese spesifisiteit van die selsiklusmasjinerie. Mol Sel&periode (2011)
PubMed: 21816347 DOI: 10.1016/j.molcel.2011.05.031

Ly T et al., Proteomiese analise van die reaksie op selsiklus-arrestasies in menslike myeloïede leukemie-selle Elife&periode (2015)
PubMed: 25555159 DOI: 10.7554/eLife.04534

Dueck H et al., Variasie is funksie&kolon Is enkelselverskille funksioneel belangrik&quest&kolon Toets die hipotese dat enkelselvariasie nodig is vir totale funksie&periode Bio-opstelle&periode (2016)
PubMed: 26625861 DOI: 10.1002/bies.201500124

Snijder B et al., Oorsprong van gereguleerde sel-tot-sel-veranderlikheid&periode Nat Rev Mol Cell Biol&period (2011)
PubMed: 21224886 DOI: 10.1038/nrm3044

Thul PJ et al., 'n Subsellulêre kaart van die menslike proteoom. Wetenskap. (2017)
PubMed: 28495876 DOI: 10.1126/science.aal3321

Cooper S et al., Membraan-elutie-analise van inhoud van sikliene A&komma B1&komma en E gedurende die onverstoorde soogdierselsiklus&periode Sel Div&periode (2007)
PubMed: 17892542 DOI: 10.1186/1747-1028-2-28

Davis PK et al., Biologiese metodes vir selsiklussinchronisasie van soogdierselle Biotegnieke&periode (2001)
PubMed: 11414226 DOI: 10.2144/01306rv01

Domenighetti G et al., Effek van inligtingsveldtog deur die massamedia op histerektomiesyfers&periode Lancet&periode (1988)
PubMed: 2904581 DOI: 10.1016/s0140-6736(88)90943-9

Scialdone A et al., Rekenkundige toewysing van selsiklusstadium vanaf enkelseltranskriptoomdata&periode Metodes&periode (2015)
PubMed: 26142758 DOI: 10.1016/j.ymeth.2015.06.021

Sakaue-Sawano A et al., Visualisering van tydruimtelike dinamika van multisellulêre selsiklusprogressie&periode Sel&periode (2008)
PubMed: 18267078 DOI: 10.1016/j.cell.2007.12.033

Grant GD et al., Identifikasie van selsiklus-gereguleerde gene wat periodiek in U2OS-selle uitgedruk word en hul regulering deur FOXM1- en E2F-transkripsiefaktore. Mol Biol Sel&periode (2013)
PubMed: 24109597 DOI: 10.1091/mbc.E13-05-0264

Semple JW et al., 'n Noodsaaklike rol vir Orc6 in DNA-replikasie deur instandhouding van pre-replikatiewe komplekse EMBO J&periode (2006)
PubMed: 17053779 DOI: 10.1038/sj.emboj.7601391

Kilfoil ML et al., Stogastiese variasie & kolon van enkelselle tot superorganismes&periode HFSP J&periode (2009)
PubMed: 20514130 DOI: 10.2976/1.3223356

Ansel J et al., Sel-tot-sel stogastiese variasie in geenuitdrukking is 'n komplekse genetiese eienskap&period PLoS Genet&periode (2008)
PubMed: 18404214 DOI: 10.1371/journal.pgen.1000049

Colman-Lerner A et al., Gereguleerde sel-tot-sel variasie in 'n sel-lot besluit stelsel&periode Natuur&periode (2005)
PubMed: 16170311 DOI: 10.1038/nature03998

Liberali P et al., Enkelsel- en meerveranderlike benaderings in genetiese versteuringsskerms&periode Nat Ds Genet&periode (2015)
PubMed: 25446316 DOI: 10.1038/nrg3768

Elowitz MB et al., Stogastiese geenuitdrukking in 'n enkele sel&period Wetenskap&periode (2002)
PubMed: 12183631 DOI: 10.1126/science.1070919

Kaern M et al., Stogastisiteit in geenuitdrukking & kolon van teorieë tot fenotipes&periode Nat Ds Genet&periode (2005)
PubMed: 15883588 DOI: 10.1038/nrg1615

Bianconi E et al., 'n Skatting van die aantal selle in die menslike liggaam&period Ann Hum Biol&periode (2013)
PubMed: 23829164 DOI: 10.3109/03014460.2013.807878

Malumbres M&periode, Siklien-afhanklike kinases&periode Genoom Biol&periode (2014)
PubMed: 25180339

Collins K et al., Die selsiklus en kanker&period Proc Natl Acad Sci U S A&periode (1997)
PubMed: 9096291

Zhivotovsky B et al., Selsiklus en seldood in siekte & kolon verlede&komma hede en toekoms&periode J Intern Med&periode (2010)
PubMed: 20964732 DOI: 10.1111/j.1365-2796.2010.02282.x

Cho RJ et al., 'n Genoomwye transkripsie-analise van die mitotiese selsiklus&periode Mol Sel&periode (1998)
PubMed: 9702192

Spellman PT et al., Omvattende identifikasie van selsiklus-gereguleerde gene van die gis Saccharomyces cerevisiae deur mikroskikking hibridisasie. Mol Biol Sel&periode (1998)
PubMed: 9843569

Orlando DA et al., Globale beheer van selsiklus transkripsie deur gekoppelde CDK en netwerk ossillators&period Natuur&periode (2008)
PubMed: 18463633 DOI: 10.1038/nature06955

Rustici G et al., Periodieke geenuitdrukkingsprogram van die splitsingsgis-selsiklus&periode Nat Genet&periode (2004)
PubMed: 15195092 DOI: 10.1038/ng1377

Uhlén M et al., Weefselgebaseerde kaart van die menslike proteoom. Wetenskap (2015)
PubMed: 25613900 DOI: 10.1126/science.1260419

Nigg EA et al., Die sentrosoomsiklus & kolon Centriole biogenese & kommaduplisering en inherente asimmetrieë&periode Nat Cell Biol&periode (2011)
PubMed: 21968988 DOI: 10.1038/ncb2345

Doxsey S&periode, Herevaluering van sentrosoomfunksie&periode Nat Rev Mol Cell Biol&period (2001)
PubMed: 11533726 DOI: 10.1038/35089575

Bornens M&periode, Sentrosoomsamestelling en mikrotubuli-ankermeganismes&periode Curr Opin Cell Biol&periode (2002)
PubMed: 11792541

Conduit PT et al., Sentrosoomfunksie en samestelling in dierselle&periode Nat Rev Mol Cell Biol&period (2015)
PubMed: 26373263 DOI: 10.1038/nrm4062

Tollenaere MA et al., Sentriolêre satelliete en kolonsleutelbemiddelaars van sentrosoomfunksies&periode Cell Mol Life Sci&periode (2015)
PubMed: 25173771 DOI: 10.1007/s00018-014-1711-3

Prosser SL et al., Sentriolêre satelliet biogenese en funksie in gewerwelde selle&periode J Cell Sci&periode (2020)
PubMed: 31896603 DOI: 10.1242/jcs.239566

Rieder CL et al., Die sentrosoom in vertebrate en kolon meer as 'n mikrotubuli-organiserende sentrum&periode Tendense Cell Biol&periode (2001)
PubMed: 11567874

Badano JL et al., Die sentrosoom in menslike genetiese siekte&periode Nat Ds Genet&periode (2005)
PubMed: 15738963 DOI: 10.1038/nrg1557

Clegg JS&periode, Eienskappe en metabolisme van die waterige sitoplasma en sy grense Am J Physiol&periode (1984)
PubMed: 6364846

Luby-Phelps K&periode, Die fisiese chemie van sitoplasma en die invloed daarvan op selfunksie & kolon 'n opdatering&periode Mol Biol Sel&periode (2013)
PubMed: 23989722 DOI: 10.1091/mbc.E12-08-0617

Luby-Phelps K&period, Sitoargitektuur en fisiese eienskappe van sitoplasma & kolon volume & komma viskositeit & komma diffusie & komma intrasellulêre oppervlak area & periode Int Rev Cytol&periode (2000)
PubMed: 10553280

Ellis RJ&periode, Makromolekulêre druk en kolon duidelik maar onderwaardeer&periode Tendense Biochem Sci&periode (2001)
PubMed: 11590012

Bright GR et al., Fluoresensieverhouding beeldmikroskopie & kolon temporale en ruimtelike metings van sitoplasmiese pH & periode J Sel Biol&periode (1987)
PubMed: 3558476

Kopito RR&periode, Aggresomes&komma-insluitingsliggame en proteïenaggregasie&periode Tendense Cell Biol&periode (2000)
PubMed: 11121744

Aizer A et al., Intrasellulêre handel en dinamika van P-liggame en periode Prion&periode (2008)
PubMed: 19242093

Carcamo WC et al., Molekulêre selbiologie en immunobiologie van soogdierstaaf en solringstrukture&periode Int Rev Cell Mol Biol&period (2014)
PubMed: 24411169 DOI: 10.1016/B978-0-12-800097-7.00002-6

Lang F&periode, Meganismes en betekenis van selvolumeregulering&periode J Am Coll Nutr&periode (2007)
PubMed: 17921474

Schwarz DS et al., Die endoplasmiese retikulum & kolonstruktuur & kommafunksie en reaksie op sellulêre sein Cell Mol Life Sci&periode (2016)
PubMed: 26433683 DOI: 10.1007/s00018-015-2052-6

Friedman JR et al., Die ER in 3D&kolon 'n multifunksionele dinamiese membraannetwerk&periode Tendense Cell Biol&periode (2011)
PubMed: 21900009 DOI: 10.1016/j.tcb.2011.07.004

Travers KJ et al., Funksionele en genomiese ontledings toon 'n noodsaaklike koördinasie tussen die ontvoude proteïenrespons en ER-geassosieerde degradasie. Sel&periode (2000)
PubMed: 10847680

Roussel BD et al., Endoplasmiese retikulum disfunksie in neurologiese siekte Lancet Neurol&periode (2013)
PubMed: 23237905 DOI: 10.1016/S1474-4422(12)70238-7

Neve EP et al., Sitochroom P450 proteïene & kolon retensie en verspreiding vanaf die endoplasmiese retikulum & periode Curr Opin Drug Discov Devel&periode (2010)
PubMed: 20047148

Kulkarni-Gosavi P et al., Vorm en funksie van die Golgi apparaat & kolon steiers & komma sitoskelet en seinering & periode FEBS Lett&periode (2019)
PubMed: 31378930 DOI: 10.1002/1873-3468.13567

Short B et al., Die Golgi-apparaat&periode Curr Biol&periode (2000)
PubMed: 10985372 DOI: 10.1016/s0960-9822(00)00644-8

Wei JH et al., Ontrafel die Golgi-lint&periode Verkeer&periode (2010)
PubMed: 21040294 DOI: 10.1111/j.1600-0854.2010.01114.x

Wilson C et al., Die Golgi-apparaat & kolon 'n organel met veelvuldige komplekse funksies&periode Biochem J&periode (2011)
PubMed: 21158737 DOI: 10.1042/BJ20101058

Farquhar MG et al., Die Golgi-apparaat & kolon 100 jaar van vooruitgang en kontroversie&periode Tendense Cell Biol&periode (1998)
PubMed: 9695800

Brandizzi F et al., Organisasie van die ER-Golgi-koppelvlak vir membraanverkeerbeheer&periode Nat Rev Mol Cell Biol&period (2013)
PubMed: 23698585 DOI: 10.1038/nrm3588

Potelle S et al., Golgi post-translasionele wysigings en gepaardgaande siektes J Erf Metab Dis&periode (2015)
PubMed: 25967285 DOI: 10.1007/s10545-015-9851-7

Leduc C et al., Intermediêre filamente in selmigrasie en indringing & kolon die ongewone verdagtes&periode Curr Opin Cell Biol&periode (2015)
PubMed: 25660489 DOI: 10.1016/j.ceb.2015.01.005

Lowery J et al., Intermediêre filamente speel 'n deurslaggewende rol in die regulering van selargitektuur en -funksie J Biol Chem&periode (2015)
PubMed: 25957409 DOI: 10.1074/jbc.R115.640359

Robert A et al., Intermediêre filamentdinamika&kolon Wat ons nou kan sien en hoekom dit saak maak&periode Bio-opstelle&periode (2016)
PubMed: 26763143 DOI: 10.1002/bies.201500142

Fuchs E et al., Intermediêre filamente & kolonstruktuur & kommadinamika & kommafunksie & komma en siekte&periode Annu Rev Biochem&periode (1994)
PubMed: 7979242 DOI: 10.1146/annurev.bi.63.070194.002021

Janmey PA et al., Viskoelastiese eienskappe van vimentien in vergelyking met ander filamentagtige biopolimeernetwerke J Sel Biol&periode (1991)
PubMed: 2007620

Köster S et al., Intermediêre filamentmeganika in vitro en in die sel en kolon van opgerolde spoele tot filamente en kommavesels en netwerke. Curr Opin Cell Biol&periode (2015)
PubMed: 25621895 DOI: 10.1016/j.ceb.2015.01.001

Herrmann H et al., Intermediêre filamente en kolon van selargitektuur tot nanomeganika&periode Nat Rev Mol Cell Biol&period (2007)
PubMed: 17551517 DOI: 10.1038/nrm2197

Gauster M et al., Keratiene in die menslike trofoblast&periode Histol Histopathol&periode (2013)
PubMed: 23450430 DOI: 10.14670/HH-28.817

Janke C&periode, Die tubulienkode&kolonmolekulêre komponente&komma-uitleesmeganismes&komma en funksies&periode J Sel Biol&periode (2014)
PubMed: 25135932 DOI: 10.1083/jcb.201406055

Goodson HV et al., Mikrotubuli en mikrotubuli-geassosieerde proteïene&periode Cold Spring Harb Perspect Biol&periode (2018)
PubMed: 29858272 DOI: 10.1101/cshperspect.a022608

Wade RH&periode, Op en rondom mikrotubuli&kolon 'n oorsig&periode Mol Biotegnologie&periode (2009)
PubMed: 19565362 DOI: 10.1007/s12033-009-9193-5

Desai A et al., Mikrotubulus polimerisasie dinamika&periode Annu Rev Cell Dev Biol&period (1997)
PubMed: 9442869 DOI: 10.1146/annurev.cellbio.13.1.83

Conde C et al., Mikrotubuli-samestelling en komma-organisasie en dinamika in aksone en dendriete Nat Rev Neurosci&periode (2009)
PubMed: 19377501 DOI: 10.1038/nrn2631

Wloga D et al., Post-translasie-modifikasies van mikrotubuli&periode J Cell Sci&periode (2010)
PubMed: 20930140 DOI: 10.1242/jcs.063727

Schmoranzer J et al., Rol van mikrotubuli in samesmelting van post-Golgi vesikels na die plasmamembraan. Mol Biol Sel&periode (2003)
PubMed: 12686609 DOI: 10.1091/mbc.E02-08-0500

Skop AR et al., Disseksie van die soogdier-middelliggaamproteoom openbaar bewaarde sitokinese-meganismes&period Wetenskap&periode (2004)
PubMed: 15166316 DOI: 10.1126/science.1097931

Waters AM et al., Ciliopathieë & kolon 'n groeiende siektespektrum&periode Pediatr Nephrol&periode (2011)
PubMed: 21210154 DOI: 10.1007/s00467-010-1731-7

Matamoros AJ et al., Mikrotubuli in gesondheid en degeneratiewe siekte van die senuweestelsel Brain Res Bull&periode (2016)
PubMed: 27365230 DOI: 10.1016/j.brainresbull.2016.06.016

Jordaan MA et al., Mikrotubuli as 'n teiken vir kankermedisyne&periode Nat Rev Kanker&periode (2004)
PubMed: 15057285 DOI: 10.1038/nrc1317

Nunnari J et al., Mitochondria & kolon in siekte en in gesondheid&periode Sel&periode (2012)
PubMed: 22424226 DOI: 10.1016/j.cell.2012.02.035

Friedman JR et al., Mitochondriale vorm en funksie&periode Natuur&periode (2014)
PubMed: 24429632 DOI: 10.1038/nature12985

Calvo SE et al., Die mitochondriale proteoom en menslike siekte Annu Rev Genomics Hum Genet&period (2010)
PubMed: 20690818 DOI: 10.1146/annurev-genom-082509-141720

McBride HM et al., Mitochondria & kolon meer as net 'n kragbron&periode Curr Biol&periode (2006)
PubMed: 16860735 DOI: 10.1016/j.cub.2006.06.054

Schäfer AM et al., Die epidemiologie van mitochondriale versteurings - verlede & komma hede en toekoms & periode Biochim Biophys Acta&period (2004)
PubMed: 15576042 DOI: 10.1016/j.bbabio.2004.09.005

Lange A et al., Klassieke kernlokaliseringseine&dubbelpuntdefinisie&kommafunksie&komma en interaksie met invoer in alfa&periode J Biol Chem&periode (2007)
PubMed: 17170104 DOI: 10.1074/jbc.R600026200

Ashmarina LI et al., 3-hidroksi-3-metielglutariel koënsiem 'n liase en kolon teiken en verwerking in peroksisome en mitochondria. J Lipied Res&periode (1999)
PubMed: 9869651

Wang SC et al., Kerntranslokasie van die epidermale groeifaktorreseptorfamilie membraan tyrosienkinasereseptore&periode Clin Cancer Res&periode (2009)
PubMed: 19861462 DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-08-2813

Jeffery CJ&periode, Maanligproteïene&periode Tendense Biochem Sci&periode (1999)
PubMed: 10087914

Jeffery CJ&periode, Waarom maanligproteïene&quest bestudeer Front Genet&periode (2015)
PubMed: 26150826 DOI: 10.3389/fgene.2015.00211

Pancholi V&periode, Multifunksionele alfa-enolase en kolon sy rol in siektes en periode Cell Mol Life Sci&periode (2001)
PubMed: 11497239 DOI: 10.1007/pl00000910

Chapple CE et al., Uiterste multifunksionele proteïene geïdentifiseer uit 'n menslike proteïen interaksie netwerk&period Nat Commun&periode (2015)
PubMed: 26054620 DOI: 10.1038/ncomms8412

Dechat T et al., Kernlamine en kolon belangrikste faktore in die strukturele organisasie en funksie van die kern en chromatien Gene Dev&periode (2008)
PubMed: 18381888 DOI: 10.1101/gad.1652708

Gruenbaum Y et al., Die kernlamina word mondig&period Nat Rev Mol Cell Biol&period (2005)
PubMed: 15688064 DOI: 10.1038/nrm1550

Stuurman N et al., Kernlamine&dubbelpunt hul struktuur&kommasamestelling&komma en interaksies&periode J Struct Biol&periode (1998)
PubMed: 9724605 DOI: 10.1006/jsbi.1998.3987

Paine PL et al., Kernomhulsel deurlaatbaarheid&periode Natuur&periode (1975)
PubMed: 1117994

Reichelt R et al., Korrelasie tussen struktuur en massaverspreiding van die kernporiekompleks en van afsonderlike poriekomplekskomponente&periode J Sel Biol&periode (1990)
PubMed: 2324201

CALLAN HG et al., Eksperimentele studies oor amfibiese oösietkerne&periode I&periode Ondersoek van die struktuur van die kernmembraan deur middel van die elektronmikroskoop&periode Proc R Soc Lond B Biol Sci&periode (1950)
PubMed: 14786306

WATSON ML&periode, Die kernomhulsel en half sy struktuur en verhouding tot sitoplasmiese membrane J Biophys Biochem Cytol&period (1955)
PubMed: 13242591

BAHR GF et al., Die fyn struktuur van die kernmembraan in die larwale speekselklier en middelderm van Chironomus&period Exp Sel Res&periode (1954)
PubMed: 13173504

Terasaki M et al., 'n Nuwe model vir kernomhulselafbreking&periode Mol Biol Sel&periode (2001)
PubMed: 11179431

Dultz E et al., Sistematiese kinetiese analise van mitotiese dis- en hersamestelling van die kernporie in lewende selle. J Sel Biol&periode (2008)
PubMed: 18316408 DOI: 10.1083/jcb.200707026

Salina D et al., Sitoplasmiese dyneïn as 'n fasiliteerder van kernomhulselafbreking Sel&periode (2002)
PubMed: 11792324

Beaudouin J et al., Kernomhulselafbreking vind plaas deur mikrotubuli-geïnduseerde skeur van die lamina&period Sel&periode (2002)
PubMed: 11792323

Gerace L et al., Die kernomhulsellamina word omkeerbaar gedepolimeriseer tydens mitose&period Sel&periode (1980)
PubMed: 7357605

Ellenberg J et al., Kernmembraandinamika en hersamestelling in lewende selle en kolon-teikening van 'n binne-kernmembraanproteïen in interfase en mitose. J Sel Biol&periode (1997)
PubMed: 9298976

Yang L et al., Integrale membraanproteïene van die kernomhulsel word deur die endoplasmiese retikulum versprei tydens mitose&periode J Sel Biol&periode (1997)
PubMed: 9182656

Bione S et al., Identifikasie van 'n nuwe X-gekoppelde geen verantwoordelik vir Emery-Dreifuss spierdistrofie Nat Genet&periode (1994)
PubMed: 7894480 DOI: 10.1038/ng1294-323

Boisvert FM et al., Die multifunksionele nukleolus&period Nat Rev Mol Cell Biol&period (2007)
PubMed: 17519961 DOI: 10.1038/nrm2184

Scheer U et al., Struktuur en funksie van die nukleolus&periode Curr Opin Cell Biol&periode (1999)
PubMed: 10395554 DOI: 10.1016/S0955-0674(99)80054-4

Németh A et al., Genoomorganisasie in en om die nukleolus&periode Tendense Genet&periode (2011)
PubMed: 21295884 DOI: 10.1016/j.tig.2011.01.002

Cuylen S et al., Ki-67 dien as 'n biologiese oppervlakaktiewe middel om mitotiese chromosome te versprei Natuur&periode (2016)
PubMed: 27362226 DOI: 10.1038/nature18610

Stenström L et al., Kartering van die nukleolêre proteoom openbaar 'n tydruimtelike organisasie wat verband hou met intrinsieke proteïenversteuring. Mol Syst Biol. (2020)
PubMed: 32744794 DOI: 10.15252/msb.20209469

Derenzini M et al., Kerngrootte dui die vinnigheid van selproliferasie in kankerweefsels aan J Pathol&periode (2000)
PubMed: 10861579 DOI: 10.1002/(SICI)1096-9896(200006)191:2<181::AID-PATH607>3.0.CO2-V

Visintin R et al., Die nukleolus & kolon die towenaar se hoed vir selliklus truuks&periode Curr Opin Cell Biol&periode (2000)
PubMed: 10801456

Marciniak RA et al., Nukleolêre lokalisering van die Werner-sindroomproteïen in menslike selle Proc Natl Acad Sci U S A&periode (1998)
PubMed: 9618508

Tamanini F et al., Die brose X-verwante proteïene FXR1P en FXR2P bevat 'n funksionele nukleolêre teikensein gelykstaande aan die MIV-1 regulatoriese proteïene. Hum Mol Genet&periode (2000)
PubMed: 10888599

Willemsen R et al., Assosiasie van FMRP met ribosomale voorloperdeeltjies in die nukleolus Biochem Biophys Res Commun&periode (1996)
PubMed: 8769090 DOI: 10.1006/bbrc.1996.1126

Isaac C et al., Karakterisering van die nukleolêre geenproduk&komma treacle&comma in Treacher Collins-sindroom&periode Mol Biol Sel&periode (2000)
PubMed: 10982400

Drygin D et al., Die RNA polimerase I transkripsie masjinerie en kolon 'n opkomende teiken vir die behandeling van kanker Annu Rev Pharmacol Toxicol&periode (2010)
PubMed: 20055700 DOI: 10.1146/annurev.pharmtox.010909.105844

Spector DL&periode, Makromolekulêre domeine binne die selkern&period Annu Rev Cell Biol&periode (1993)
PubMed: 8280462 DOI: 10.1146/annurev.cb.09.110193.001405

Lamond AI et al., Struktuur en funksie in die kern&periode Wetenskap&periode (1998)
PubMed: 9554838

SWIFT H&periode, Studies oor fyn kernstruktuur&periode Brookhaven Symp Biol&periode (1959)
PubMed: 13836127

Lamond AI et al., Kernspikkels & kolon 'n model vir kernorganelle&periode Nat Rev Mol Cell Biol&period (2003)
PubMed: 12923522 DOI: 10.1038/nrm1172

Thiry M&periode, Die interchromatienkorrels&period Histol Histopathol&periode (1995)
PubMed: 8573995

Sleeman JE et al., Nuut saamgestelde snRNP's assosieer met opgerolde liggame voor spikkels&komma wat 'n kern snRNP rypwordingspad voorstel&periode Curr Biol&periode (1999)
PubMed: 10531003

Darzacq X et al., Cajal-liggaamspesifieke klein kern-RNA's en kolon 'n nuwe klas van 2'-O-metilering en pseudouridileringsgids-RNA's. EMBO J&periode (2002)
PubMed: 12032087 DOI: 10.1093/emboj/21.11.2746

Jády BE et al., Modifikasie van Sm klein kern-RNA's vind plaas in die nukleoplasmiese Cajal-liggaam na invoer vanaf die sitoplasma. EMBO J&periode (2003)
PubMed: 12682020 DOI: 10.1093/emboj/cdg187

Liu Q et al., 'n Nuwe kernstruktuur wat die oorlewing van motorneurone proteïen bevat&period EMBO J&periode (1996)
PubMed: 8670859

Lefebvre S et al., Identifikasie en karakterisering van 'n spinale spieratrofie-bepalende geen Sel&periode (1995)
PubMed: 7813012

Fischer U et al., Die SMN-SIP1-kompleks speel 'n noodsaaklike rol in spliceosomale snRNP-biogenese. Sel&periode (1997)
PubMed: 9323130

Lallemand-Breitenbach V et al., PML-kernliggame&periode Cold Spring Harb Perspect Biol&periode (2010)
PubMed: 20452955 DOI: 10.1101/cshperspect.a000661

Booth DG et al., Ki-67 en die chromosoomperiferie-kompartement in mitose&period Tendense Cell Biol&periode (2017)
PubMed: 28838621 DOI: 10.1016/j.tcb.2017.08.001

Ljungberg O et al., 'n Saamgestelde follikulêre-parafollikulêre selkarsinoom van die skildklier en kolon 'n nuwe tumor-entiteit en soeke Kanker&periode (1983)
PubMed: 6136320 DOI: 10.1002/1097-0142(19830915)52:6<1053::aid-cncr2820520621>3.0.co2-q

Melcák I et al., Kern pre-mRNA kompartementalisering en kolonhandel van vrygestelde transkripsies na splitsingsfaktor reservoirs en periode Mol Biol Sel&periode (2000)
PubMed: 10679009

Spector DL ​​et al., Assosiasies tussen duidelike pre-mRNA-splytingskomponente en die selkern EMBO J&periode (1991)
PubMed: 1833187

Misteli T et al., Proteïenfosforilering en die kernorganisasie van pre-mRNA-splyting Tendense Cell Biol&periode (1997)
PubMed: 17708924 DOI: 10.1016/S0962-8924(96)20043-1

Cmarko D et al., Ultrastrukturele analise van transkripsie en splitsing in die selkern na bromo-UTP mikro-inspuiting. Mol Biol Sel&periode (1999)
PubMed: 9880337

Van Hooser AA et al., Die perichromosomale laag&period Chromosoom&periode (2005)
PubMed: 16136320 DOI: 10.1007/s00412-005-0021-9

Booth DG et al., Ki-67 is 'n PP1-interaksie proteïen wat die mitotiese chromosoom periferie organiseer&periode Elife&periode (2014)
PubMed: 24867636 DOI: 10.7554/eLife.01641

Kau TR et al., Kernvervoer en kanker&dikderm van meganisme tot ingryping&periode Nat Rev Kanker&periode (2004)
PubMed: 14732865 DOI: 10.1038/nrc1274

Laurila K et al., Voorspelling van siekteverwante mutasies wat proteïenlokalisering beïnvloed BMC Genomics&periode (2009)
PubMed: 19309509 DOI: 10.1186/1471-2164-10-122

Park S et al., Proteïenlokalisering as 'n hoofkenmerk van die etiologie en comorbiditeit van genetiese siektes Mol Syst Biol&periode (2011)
PubMed: 21613983 DOI: 10.1038/msb.2011.29

Christoforou A et al., 'n Konsepkaart van die muis pluripotente stamsel-ruimtelike proteoom&period Nat Commun&periode (2016)
PubMed: 26754106 DOI: 10.1038/ncomms9992

Itzhak DN et al., Globale&komma kwantitatiewe en dinamiese kartering van proteïen subsellulêre lokalisering&periode Elife&periode (2016)
PubMed: 27278775 DOI: 10.7554/eLife.16950

Roux KJ et al., 'n Promiskue biotien-ligase-fusieproteïen identifiseer proksimale en interaksie proteïene in soogdierselle. J Sel Biol&periode (2012)
PubMed: 22412018 DOI: 10.1083/jcb.201112098

Lee SY et al., APEX-vingerafdruk onthul die subsellulêre lokalisering van proteïene van belang&period Sel Rep&periode (2016)
PubMed: 27184847 DOI: 10.1016/j.celrep.2016.04.064

Huh WK et al., Globale ontleding van proteïenlokalisering in ontluikende gis&periode Natuur&periode (2003)
PubMed: 14562095 DOI: 10.1038/nature02026

Simpson JC et al., Sistematiese subsellulêre lokalisering van nuwe proteïene geïdentifiseer deur grootskaalse cDNA-volgordebepaling. EMBO Rep&periode (2000)
PubMed: 11256614 DOI: 10.1093/embo-reports/kvd058

Stadler C et al., Immunofluoressensie en fluoresserende-proteïenmerking toon hoë korrelasie vir proteïenlokalisering in soogdierselle. Nat Metodes. 2013 Apr10(4):315-23 (2013)
PubMed: 23435261 DOI: 10.1038/nmeth.2377

Barbe L et al., Na 'n konfokale subsellulêre atlas van die menslike proteoom. Mol Cell Proteomics. (2008)
PubMed: 18029348 DOI: 10.1074/mcp.M700325-MCP200

Stadler C et al., 'n Enkele fiksasieprotokol vir proteoomwye immunofluoressensie-lokaliseringstudies. J Proteomika. (2010)
PubMed: 19896565 DOI: 10.1016/j.jprot.2009.10.012

Fagerberg L et al., Kartering van die subsellulêre proteïenverspreiding in drie menslike sellyne. J Proteome Res. (2011)
PubMed: 21675716 DOI: 10.1021/pr200379a

Baker M&periode, Reproduceerbaarheidskrisis&kolon Blameer dit op die teenliggaampies&periode Natuur&periode (2015)
PubMed: 25993940 DOI: 10.1038/521274a

Jacobson K et al., Die laterale organisasie en mobiliteit van plasmamembraankomponente&periode Sel&periode (2019)
PubMed: 31051105 DOI: 10.1016/j.cell.2019.04.018

Kobayashi T et al., Transdubbellaag lipied asimmetrie&periode Curr Biol&periode (2018)
PubMed: 29689220 DOI: 10.1016/j.cub.2018.01.007

Krapf D&periode, Kompartementalisering van die plasmamembraan&period Curr Opin Cell Biol&periode (2018)
PubMed: 29656224 DOI: 10.1016/j.ceb.2018.04.002

Garcia MA et al., Sel-sel-aansluitings organiseer strukturele en seinnetwerke&periode Cold Spring Harb Perspect Biol&periode (2018)
PubMed: 28600395 DOI: 10.1101/cshperspect.a029181

Orlando K et al., Membraanorganisasie en dinamika in selpolariteit&periode Cold Spring Harb Perspect Biol&periode (2009)
PubMed: 20066116 DOI: 10.1101/cshperspect.a001321

Eaton RC et al., D2-reseptore in die paraventrikulêre kern reguleer genitale reaksies en kopulasie in manlike rotte. Pharmacol Biochem Gedrag&periode (1991)
PubMed: 1833780 DOI: 10.1016/0091-3057(91)90418-2

Simons K et al., Cholesterol&komma-lipiedvlotte&komma en siekte&periode J Clin Invest&periode (2002)
PubMed: 12208858 DOI: 10.1172/JCI16390

von Heijne G&periode, Seinreekse&periode Die grense van variasie&periode J Mol Biol&periode (1985)
PubMed: 4032478

Johnson AE et al., Die translokoon&kolon 'n dinamiese poort by die ER-membraan&period Annu Rev Cell Dev Biol&period (1999)
PubMed: 10611978 DOI: 10.1146/annurev.cellbio.15.1.799

Farhan H et al., Sein na en van die sekretoriese pad&periode J Cell Sci&periode (2011)
PubMed: 21187344 DOI: 10.1242/jcs.076455

Wishart DS et al., DrugBank & kolon 'n omvattende hulpbron vir in silico dwelm ontdekking en eksplorasie Nukleïensure Res&periode (2006)
PubMed: 16381955 DOI: 10.1093/nar/gkj067

Emanuelsson O et al., Opspoor van proteïene in die sel met behulp van TargetP&comma SignalP en verwante gereedskap&period Nat Protoc&periode (2007)
PubMed: 17446895 DOI: 10.1038/nprot.2007.131

Petersen TN et al., SeinP 4&period0&kolondiskriminerende seinpeptiede van transmembraanstreke&periode Nat Metodes&periode (2011)
PubMed: 21959131 DOI: 10.1038/nmeth.1701

Käll L et al., 'n Gekombineerde transmembraantopologie en seinpeptiedvoorspellingsmetode&periode J Mol Biol&periode (2004)
PubMed: 15111065 DOI: 10.1016/j.jmb.2004.03.016

Viklund H et al., SPOCTOPUS & kolon 'n gekombineerde voorspeller van seinpeptiede en membraanproteïentopologie&periode Bioinformatika&periode (2008)
PubMed: 18945683 DOI: 10.1093/bioinformatics/btn550

Fagerberg L et al., Voorspelling van die menslike membraanproteoom. Proteomika. (2010)
PubMed: 20175080 DOI: 10.1002/pmic.200900258


NIH-wetenskaplikes ontdek sleutelweg in lisosome wat koronavirusse gebruik om selle te verlaat

Die teiken van selle se 'asblikverpakter' kan lei tot 'n nuwe antivirale strategie om COVID-19 te beveg.

Illustrasie toon komponente van die lisosoom-eksositose-weg, wat koronavirusse gebruik om selle te verlaat. Ook getoon is komponente van die normale biosintetiese sekretoriese weg. NIH

Navorsers by die National Institutes of Health het 'n biologiese pad ontdek wat die nuwe koronavirus blykbaar gebruik om selle te kaap en te verlaat soos dit deur die liggaam versprei. 'n Beter begrip van hierdie belangrike pad kan noodsaaklike insig verskaf om die oordrag van die virus - SARS-CoV-2 - wat COVID-19-siekte veroorsaak, te stop.

In selstudies het die navorsers vir die eerste keer getoon dat die koronavirus besmette selle kan verlaat deur die lisosoom, 'n organel wat bekend staan ​​as die selle se "asblikverdichter". Normaalweg vernietig die lisosoom virusse en ander patogene voordat hulle die selle verlaat. Die navorsers het egter gevind dat die koronavirus die lisosoom se siektebestrydingsmasjinerie deaktiveer, sodat dit vrylik deur die liggaam kan versprei.

Om hierdie lisosomale pad te rig, kan lei tot die ontwikkeling van nuwe, meer effektiewe antivirale terapieë om COVID-19 te beveg. Die bevindinge is vandag in die joernaal gepubliseer Sel, kom op 'n tyd dat nuwe koronavirusgevalle wêreldwyd toeneem, met verwante Amerikaanse sterftes wat byna 225,000 is.

Wetenskaplikes weet al geruime tyd dat virusse selle binnedring en infekteer en dan die sel se proteïenmaakmasjinerie gebruik om veelvuldige kopieë van hulself te maak voordat hulle uit die sel ontsnap. Navorsers het egter net 'n beperkte begrip van presies hoe virusse selle verlaat.

Konvensionele wysheid het lank geglo dat die meeste virusse - insluitend griep, hepatitis C en Wes-Nyl - deur die sogenaamde biosintetiese sekretoriese pad uittree. Dit is 'n sentrale pad wat selle gebruik om hormone, groeifaktore en ander materiale na hul omliggende omgewing te vervoer. Navorsers het aangeneem dat koronavirusse ook hierdie pad gebruik.

Maar in 'n deurslaggewende eksperiment het Nihal Altan-Bonnet, Ph.D., hoof van die Laboratorium vir Gasheer-Patogeendinamika by die NIH se Nasionale Hart-, Long- en Bloedinstituut (NHLBI) en haar postdoktorale genoot Sourish Ghosh, Ph. D., die studie se hoofskrywers, het iets anders gevind. Sy en haar span het koronavirus-geïnfekteerde selle (spesifiek muishepatitisvirus) blootgestel aan sekere chemiese inhibeerders wat bekend is om die biosintetiese pad te blokkeer.

"Tot ons skok het hierdie koronavirusse goed uit die selle gekom," het Altan-Bonnet gesê. "Dit was die eerste leidraad dat koronavirusse miskien 'n ander pad gebruik."

Om na daardie pad te soek, het die navorsers bykomende eksperimente ontwerp met behulp van mikroskopiese beelding en virusspesifieke merkers wat menslike selle betrek. Hulle het ontdek dat koronavirusse op een of ander manier die lisosome, wat hoogs suur is, teiken en daar saamdrom.

Hierdie bevinding het nog 'n vraag vir Altan-Bonnet se span laat ontstaan: As koronavirusse in lisosome ophoop en lisosome suur is, hoekom word die koronavirusse nie vernietig voordat hulle uitgaan nie?

In 'n reeks gevorderde eksperimente het die navorsers getoon dat lisosome in koronavirus-geïnfekteerde selle ontsuur word, wat die aktiwiteit van hul vernietigende ensieme aansienlik verswak. As gevolg hiervan bly die virusse ongeskonde en gereed om ander selle te besmet wanneer hulle uitgaan.

"Hierdie koronavirusse is baie skelm," het Altan-Bonnet gesê. "Hulle gebruik hierdie lisosome om uit te kom, maar hulle ontwrig ook die lisosoom sodat dit nie sy werk of funksie kan doen nie."

Die navorsers het ook ontdek dat die ontwrigting van normale lisosoomfunksie blykbaar die selle se immunologiese masjinerie benadeel. "Ons dink hierdie baie fundamentele selbiologie-bevinding kan help om sommige van die dinge wat mense in die kliniek sien met betrekking tot immuunstelsel-abnormaliteite by COVID-pasiënte te verduidelik," het Altan-Bonnet gesê. Dit sluit sitokienstorms in, waarin 'n oormaat sekere pro-inflammatoriese proteïene in die bloed van COVID-pasiënte die immuunstelsel oorweldig en hoë sterftesyfers veroorsaak.

Noudat hierdie meganisme geïdentifiseer is, kan navorsers moontlik maniere vind om hierdie pad te ontwrig en te verhoed dat lisosome virusse na die buitekant van die sel aflewer of lisosome weer versuur om hul normale funksies in koronavirus-geïnfekteerde selle te herstel, sodat hulle kan COVID beveg. Die skrywers het reeds een eksperimentele ensiem-inhibeerder geïdentifiseer wat koronavirusse kragtig verhinder om uit die sel te kom.

"Die lisosoomweg bied 'n heel ander manier van dink oor geteikende terapeutika," het sy gesê, en bygevoeg dat verdere studies nodig sal wees om te bepaal of sulke intervensies doeltreffend sal wees en of bestaande middels kan help om hierdie pad te blokkeer. Sy merk op dat die bevindings baie kan help om toekomstige pandemies te stuit wat veroorsaak word deur ander koronavirusse wat kan opduik.

Navorsing wat in hierdie studie gerapporteer is, is befonds deur die Afdeling Intramurale Navorsing van NHLBI, deel van die National Institutes of Health. Daarbenewens is die navorsing ondersteun deur NIH-toekennings, insluitend NIH R01 AI091985-05 NIH R01 NS36592 F32-AI113973 NIH R37GM058615 en NIH R01AI135270. Alle ander mede-outeurs is ondersteun deur binnemuurse NIH- en National Cancer Institute-fondse.

Studie: β-Coronavirusse gebruik lisosome vir uitgang in plaas van die biosintetiese sekretoriese weg DOI: 10.1016/j.cell.2020.10.039

Hierdie nuusvrystelling beskryf 'n basiese navorsingsbevinding. Basiese navorsing verhoog ons begrip van menslike gedrag en biologie, wat die basis is vir die bevordering van nuwe en beter maniere om siektes te voorkom, te diagnoseer en te behandel. Wetenskap is 'n onvoorspelbare en inkrementele proses - elke navorsingsvordering bou op vorige ontdekkings, dikwels op onverwagte maniere. Die meeste kliniese vooruitgang sou nie moontlik wees sonder die kennis van fundamentele basiese navorsing nie.


Skrywer Opsomming

Enterovirusse is beduidende menslike patogene, wat miokarditis, aseptiese meningitis en enkefalitis veroorsaak. Die meganismes van enterovirus verspreiding in die gasheer en sel-tot-sel verspreiding kan kritieke faktore wees wat virale patogenese beïnvloed. Hier het ons 'n rekombinante coxsackievirus gegenereer wat "fluoressensie timer" proteïen (Timer-CVB3) uitdruk wat help om die vordering van infeksie binne die gasheer te volg. Onverwags het ons die afskeiding van mikrovesikels wat virus bevat in gedeeltelik-gedifferensieerde stamvaderselle wat met Timer-CVB3 besmet is, waargeneem. Hierdie ekstrasellulêre mikrovesikels (EMV's) is in hoë vlakke vrygestel na sellulêre differensiasie, en kan 'n rol speel in virusverspreiding. Timer-CVB3 sal 'n waardevolle hulpmiddel wees om virusverspreiding in die besmette gasheer te monitor.

Aanhaling: Robinson SM, Tsueng G, Sin J, Mangale V, Rahawi S, McIntyre LL, et al. (2014) Coxsackievirus B verlaat die gasheersel in skuur mikrovesikels wat outofagosomale merkers vertoon. PLoS Pathog 10(4): e1004045. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004045

Redakteur: Ted C. Pierson, National Institutes of Health, Verenigde State van Amerika

Ontvang: 26 Oktober 2012 Aanvaar: 17 Februarie 2014 Gepubliseer: 10 April 2014

Kopiereg: © 2014 Robinson et al. Hierdie is 'n ooptoegang-artikel wat versprei word onder die bepalings van die Creative Commons Erkenningslisensie, wat onbeperkte gebruik, verspreiding en reproduksie in enige medium toelaat, mits die oorspronklike outeur en bron gekrediteer word.

Befondsing: Hierdie werk is ondersteun deur National Institutes of Health (NIH) R01-toekenning NS054108 (aan RF), NIH R01-toekennings AI042314 en HL093177 (aan JLW), NIH R01-toekenning HL092136 (aan JOOL) 'n NIH-navorsingsaanvulling om diversiteit in gesondheid te bevorder-R Navorsingstoekenning 3R01NS054108-01A2S1 (aan RF en SMR), 'n SDSU Universiteitstoelae-programtoekenning (aan RF), 'n Nasionale Instituut vir Geestesgesondheid (NIMH) Minderheidsnavorsingsinfrastruktuurondersteuningsprogram (M-RISP) R24 Fakulteitsgenoot-toekenning MH065515 (aan RF ), en 'n NIH F32 Ruth L. Kirschstein Nasionale Navorsingsdiens-toekenning AI-065095 (aan CTC). GT is 'n ontvanger van 'n Prestasiebelonings vir Kollege Wetenskaplikes (ARCS) Foundation Scholarship, die Inamori Fellowship en die Gen-Probe Fellowship. SMR is 'n ontvanger van die Rees-Stealy Research Foundation en die San Diego State University Heart Institute Fellowship. SR is 'n ontvanger van die SDSU McNair Scholars Program en die National Science Foundation S-STEM Scholars Program. CC en AMS is gedeeltelik ondersteun deur NSF DEB 1046413: Dimensions: Viral Diversity in Coral Reef Ecosystems. TEM-toerusting is gekoop met ondersteuning deur die National Science Foundation-toekenning DBI-030829. Die befondsers het geen rol in studie-ontwerp, data-insameling en -analise, besluit om te publiseer of voorbereiding van die manuskrip gehad nie. Geen botsing van belange bestaan ​​tussen die onderwerp en die outeurs wat in die manuskrip ingesluit is nie.

Mededingende belange: Die skrywers het verklaar dat geen mededingende belange bestaan ​​nie.


10 moet-hê-merkers vir verouderingsnavorsing

Stel u belang om veroudering te bestudeer? Om te verstaan ​​wanneer en waarom selsiklus-arrestasie plaasvind, is van kritieke belang vir baie velde van navorsing, insluitend (maar nie beperk nie tot) studies van ontwikkeling, veroudering en kanker. Ons weet almal dat die beste gereedskap die beste resultate lewer, so maak seker dat jy al jou basisse gedek het met hierdie lys van die top 10 teikens vir jou verouderingsnavorsing!

Dit is bekend dat verouderde selle β-Galaktosidase op 'n pH-afhanklike wyse uitdruk, spesifiek waarneembaar by pH 6 (1). Hierdie handige kleurstel bevat alles wat jy nodig het om β-galaktosidase-aktiwiteit by pH 6 in selle op te spoor - of selfs bevrore weefsel! Perfek om vinnig en maklik verskeie selpopulasies of weefselmonsters te toets, die aanwysings is eenvoudig, en die blou kleuring is helder en duidelik.

β-Galaktosidase kleuring by pH 6 op normale WI38 selle by populasie verdubbeling 29 (links) en senescent WI38 selle by populasie verdubbeling 36 (regs).

p53 is so goed bestudeer dat dit amper geen bekendstelling nodig het nie! 'n Belangrike speler in die DNA Damage Response (DDR) weë, p53 is ook 'n kritieke reguleerder van die selsiklus, waar opgehoopte gefosforileerde p53 aktivering van siklienafhanklike kinase-inhibeerders (CDKI's) sal dryf en uiteindelik sal lei tot selsiklus-stilstand.

Konfokale Immunofluorescent analise van HT-29 selle met behulp van p53 (7F5) Konyn mAb (groen). Aktienfilamente is gemerk met DY-554 falloidien (rooi).

Soos hierbo genoem, berus verouderde selsiklus arrestasie sterk op fosfo-53, wat verskeie verskillende CDKI's ophoop en aktiveer. Vergelykende analise tussen p53 en fosfo-p53 vlakke is dikwels 'n kritieke stap in die bestudering van die DDR pad en veroudering.

Konfokale immunofluorescerende analise van MCF-7-selle, onbehandeld (links) of etoposied-behandeld (regs), met behulp van Phospho-p53 (Ser46) teenliggaampie (groen). Aktienfilamente is gemerk met DY-554 falloidien (rooi).

Een van die mees gevestigde verouderingsmerkers, p21 is 'n CDKI stroomaf van fosfo-p53. p21 tree op as 'n inhibeerder van die selsiklus deur vordering deur G1/S te blokkeer wanneer dit met CDK2 geassosieer word (1).

Konfokale immunofluorescent analise van MCF7 selle met behulp van p21 Waf1/Cip1 (12D1) Konyn mAb (rooi) en Fosfo-Histoon H3 (Ser10) (6G3) Muis mAb #9706 (groen). Blou pseudokleur = DRAQ5® #4084 (fluoresserende DNA-kleurstof).

Nog 'n algemene en betroubare verouderingsmerker, uitdrukking van p16 word vermoedelik selle in veroudering dryf (2). p16 is 'n lid van die INK4-familie van CDKI's, wat saam met CDK4 en CDK6 optree om die selsiklus in G1 (3) te stop.

Western klad analise van uittreksels uit HeLa en HUVEC selle met behulp van p16 INK4A (D3W8G) Konyn mAb (boonste) of β-Actin (D6A8) Konyn mAb #8457 (onder).

Verouderde selle vertoon dikwels morfologiese veranderinge, wat LaminB1 nog 'n nuttige aanduiding van veroudering maak. 'n Merker vir kernmorfologie, LaminB1-uitdrukking gaan verlore in senescent menslike en muriene selle (4). Verlies van LaminB1 en verhoogde akkumulasie van p21 en p16 is almal belangrike, klassieke kenmerke van veroudering.

Konfokale immunofluorescent analise van HT-29 selle met behulp van Lamin B1 (119D5-F1) Muis mAb (groen) en β-Actin (13E5) Konyn mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #8584 (rooi). Blou pseudokleur = Propidiumjodied (PI)/RNase-kleuroplossing #4087 (fluoresserende DNA-kleurstof).

Bejaarde selle het baie gemeenskaplike eienskappe, maar hulle is geensins identies nie. Elke senesente populasie word gekenmerk deur unieke vlakke van sitokiene, groeifaktore en proteases, dit word die senesensie-geassosieerde sekretoriese fenotipe (SASP) genoem. Die SASP-teenliggaammonsterstel bevat 'n robuuste versameling teenliggaampies vir verskeie proteïene om verouderde selle te bestudeer. Hierdie versameling sal jou toelaat om die SASP spesifiek vir jou selpopulasie te bepaal.

Western klad analise van rekombinante Menslike Interleukin-1β (hIL-1β) #8900 met behulp van IL-1β (D3U3E) Konyn mAb.

Tipies is fosforilering van Rb nodig om die onderdrukking van transkripsionele teikens te verlig en die selsiklus te vorder. Inhibisie van die selsiklus deur verskeie CDKI's, insluitend p21 en p16, lei tot hiperaktivering van Rb dit bevorder uiteindelik die arrestasie van die selsiklus en veroudering (4).

Konfokale immunofluorescerende beeld van SH-SY5Y-selle, met behulp van RB (4H1) muis mAb (groen). Aktienfilamente is gemerk met Alexa Fluor® 555 falloidien (rooi).

Aangesien Rb gefosforileer moet word om die selsiklus te vorder, word fosfo-Rb nie in senesente selle gevind nie. Soos p53, is vergelykende analise van Rb en ​​fosfo-Rb uiters belangrik wanneer veroudering ondersoek word.

Konfokale immunofluoresserende analise van MCF7 (links) en BT-549 (regs) selle, onbehandelde (boonste) of λ fosfatase-behandelde (onderste) met behulp van Phospho-Rb (Ser807/Ser811) (D20B12) XP® Rabbit mAb (groen). Aktienfilamente is gemerk met DY-554 falloïdien (rooi). Blou pseudokleur = DRAQ® #4084 (fluoresserende DNA-kleurstof).

gamma-H2A.X is 'n klassieke merker van die DDR-pad. DNA-skade lei tot 'n vinnige en robuuste reaksie waar H2A.X gefosforileer word by Ser139, wat gamma H2A.X (5) vorm, wat dit 'n kragtige instrument maak om die DDR-weg en veroudering te bestudeer.

Immunohistochemiese analise van paraffien-ingebedde HT-29-selle onbehandeld (links) of UV-behandeld (regs), met behulp van Phospho-Histone H2A.X (Ser139) (20E3) Konyn mAb.

53BP1 is oorspronklik geïdentifiseer as 'n bindende vennoot vir p53, en voorgestel om sy transkripsionele aktiwiteit te verbeter (6, 7). 53BP1 speel 'n noodsaaklike rol in DNA-herstel dit is bekend dat dit gewerf word na plekke van DNA-skade, en die behoud van 53BP1 by hierdie plekke is afhanklik van gamma-H2A.X (8).

Konfokale immunofluorescerende analise van HeLa-selle met behulp van 53BP1-teenliggaampie (groen). Aktienfilamente is gemerk met Alexa Fluor® 555 falloidien (rooi).

Soms is die beste manier om iets op te spoor om vas te stel wat dit nie doen nie. Ki67 is 'n kernproteïen wat 'n gereelde merker van prolifererende selle is. Hierdie opsporing wissel oral van G1 tot die einde van mitose, maar is nie waarneembaar wanneer selle in G0-rusfase is nie (9). 'n Kenmerk van senesente selle is 'n permanente uitgang uit die selsiklus, en dus druk bejaarde selle nie Ki67 uit nie.

Immunohistochemiese analise van paraffien-ingebedde menslike borskarsinoom met behulp van Ki-67 (8D5) muis mAb.

*Pro wenk! Daar is baie merkers van verouderde selle, so hoekom kies net een? Ons beveel aan om te begin met die Senescence Marker Antibody Sampler Kit, wat verskeie van hierdie fundamentele merkers bevat, wat dit perfek maak om jou senescent selle te begin identifiseer!


Verwante skakels

Verwysings: β-Coronavirusse gebruik lisosome vir uitgang in plaas van die biosintetiese sekretoriese pad. Ghosh S, Dellibovi-Ragheb TA, Kerviel A, Pak E, Qiu Q, Fisher M, Takvorian PM, Bleck C, Hsu VW, Fehr AR, Perlman S, Achar SR, Straus MR, Whittaker GR, de Haan CAM, Kehrl J , Altan-Bonnet G, Altan-Bonnet N. Sel. 2020 27 Okt:S0092-8674(20)31446-X. doi: 10.1016/j.cell.2020.10.039. Aanlyn voor druk. PMID: 33157038.

Befondsing: NIH se Nasionale Hart-, Long- en Bloedinstituut (NHLBI), Nasionale Instituut vir Allergie en Aansteeklike Siektes (NIAID), Nasionale Instituut vir Neurologiese Afwykings en Beroerte (NINDS), Nasionale Instituut vir Algemene Mediese Wetenskappe (NIGMS) en Nasionale Kankerinstituut ( NCI).


Monoklonale teenliggaampies ingesluit in die organelmerkerpaneel

Hierdie organel merker paneel van muis monoklonale teenliggaampies teen 'n seleksie van belangrike subsellulêre liggings vir kartering, karakterisering en onthulling van die rol van die proteïen in sellulêre prosesse, kan gebruik word as 'n verwysing om te kleur en die ligging van die proteïen van belang te bevestig. Die paneellede is gekies vir hoë RNA-vlakke in soveel sellyne as moontlik en word in ICC-IF in tot vyf sellyne bekragtig. Die meeste van hulle word ook in IHC en WB bekragtig. Alle paneellede behoort aan die Prestige Antibody-handelsmerk en is ontwikkel onder dieselfde streng voorwaardes, met 'n veilige kontinuïteit en stabiele aanbod.


RESULTATE

'n Mutante lusiferase-proteïen word gesekwestreer aan Hsp42-SPG's in chronologies verouderde gisselle

Voorheen is gevind dat Hsp42-SPG's verryk is in langlewende rustige gisselle (Lee et al., 2016 Liu et al., 2012), wat daarop dui dat die vorming van Hsp42-SPGs selfisiologie tydens chronologiese veroudering beïnvloed. Wanneer die lewensvatbaarheid van stasionêre fase selle ondersoek is in rebudding assays, het selle sonder Hsp42-SPGs aansienlik verminderde lewensvatbaarheid in 1-maand kulture getoon (46±1.6% van wilde-tipe selle vs 26±0.3% van hsp42Δ selle, tweestert t-toets, P=0,0049) (Fig. 1A). Om egter die biochemiese toestande van Hsp42-SPG-komponente tydens korrelvorming te verstaan, is 'n sensitiewe funksionele toets van proteïenvou en ensiematiese aktiwiteite nodig.

Vorming van Hsp42-bevattende korrels reguleer ensiemaktiwiteite tydens stilstaande fase. (A) Selle sonder Hsp42-SPGs is minder lewensvatbaar na 30 dae in stilstaande fase. Selrebudstempo is gebruik om die sellewensvatbaarheid van wildtipe en hsp42Δ-selle (sien Materiale en Metodes vir besonderhede). Die eksperimente is herhaal met behulp van ten minste drie onafhanklike kolonies en >100 selle is in elke herhaling getel. ***P<0,005, tweestertstudente t-toets. Foutstawe verteenwoordig s.e.m. (B) Korrels gevorm deur luciferase-EGFP (groen) kolokaliseer met Hsp42-BFP korrels (rooi) in stilstaande fase selle. Selle is gegroei in SC-URA medium by 28°C vir 5 dae voor beelde geneem is. Skaalstaaf: 5 μm. (C) Korrelvorming van luciferase-EGFP hang af van Hsp42. Wild-tipe en hsp42Δ-selle wat luciferase-EGFP dra, is versamel van 1-dag, 4-dag, 7-dag en 14-dae oue kulture, en beelde is geneem. Skaalstaaf: 5 μm. (D) Vorming van Hsp42-SPGs fasiliteer afregulering van lusiferase-aktiwiteit tydens chronologiese veroudering. Gemiddelde lusiferase-aktiwiteit per mg totale sellisaat is uit drie herhalings bereken. P waardes is bereken met behulp van twee-stert Student's t-toets. *P<0,05,***P<0,005. Foutstawe verteenwoordig s.e.m. (E) Die proteïen hoeveelheid lusiferase in die hsp42Δ mutant (–) is nie hoër in vergelyking met dié in die wild-tipe stam (+). Totale sellisete is ontleed deur western blotting en luciferase, Hsp42 en G6PDH is opgespoor deur anti-GFP (vir luciferase-EGFP), anti-Hsp42 en anti-G6PDH (vir laai beheer) teenliggaampies te gebruik. (F) Luciferase-aktiwiteit in wildtipe selle herstel vinnig sonder nuwe proteïensintese wanneer selle die stilstaande fase verlaat. Om vouveranderinge makliker te sien, is die lusiferase-aktiwiteit van verfrisde selle genormaliseer na dié van dieselfde selkultuur voor verversing. Stasionêre fase selle is verfris met vars medium vir 1 uur in die teenwoordigheid van 100 μg/ml sikloheksimied en dan gelys om lusiferase aktiwiteit te meet. 14-dae oue wildtipe selle het die grootste vouverandering gehad omdat die meeste van die lusiferase-proteïen op hierdie tydstip in Hsp42-SPG's gestoor is.

Vorming van Hsp42-bevattende korrels reguleer ensiemaktiwiteite tydens stilstaande fase. (A) Selle sonder Hsp42-SPGs is minder lewensvatbaar na 30 dae in stilstaande fase. Selrebudstempo is gebruik om die sellewensvatbaarheid van wild-tipe en hsp42Δ-selle (sien Materiale en Metodes vir besonderhede). Die eksperimente is herhaal met behulp van ten minste drie onafhanklike kolonies en >100 selle is in elke herhaling getel. ***P<0,005, tweestertstudent's t-toets. Foutstawe verteenwoordig s.e.m. (B) Korrels gevorm deur luciferase-EGFP (groen) kolokaliseer met Hsp42-BFP korrels (rooi) in stilstaande fase selle. Selle is gegroei in SC-URA medium by 28°C vir 5 dae voor beelde geneem is. Skaalstaaf: 5 μm. (C) Korrelvorming van luciferase-EGFP hang af van Hsp42. Wild-tipe en hsp42Δ-selle wat luciferase-EGFP dra, is van 1-dag, 4-dag, 7-dag en 14-dae oue kulture versamel, en beelde is geneem. Skaalstaaf: 5 μm. (D) Vorming van Hsp42-SPGs fasiliteer afregulering van lusiferase-aktiwiteit tydens chronologiese veroudering. Gemiddelde lusiferase-aktiwiteit per mg totale sellisaat is uit drie herhalings bereken. P waardes is bereken met behulp van twee-stert Student's t-toets. *P<0,05,***P<0,005. Foutstawe verteenwoordig s.e.m. (E) Die proteïen hoeveelheid lusiferase in die hsp42Δ mutant (–) is nie hoër in vergelyking met dié in die wild-tipe stam (+). Totale sellisete is ontleed deur western blotting en luciferase, Hsp42 en G6PDH is opgespoor deur anti-GFP (vir luciferase-EGFP), anti-Hsp42 en anti-G6PDH (vir laai beheer) teenliggaampies te gebruik. (F) Luciferase-aktiwiteit in wildtipe selle herstel vinnig sonder nuwe proteïensintese wanneer selle die stilstaande fase verlaat. Om vouveranderinge makliker te sien, is die lusiferase-aktiwiteit van verfrisde selle genormaliseer na dié van dieselfde selkultuur voor verversing. Stasionêre fase selle is verfris met vars medium vir 1 uur in die teenwoordigheid van 100 μg/ml sikloheksimied en dan gelys om lusiferase aktiwiteit te meet. 14-dae oue wildtipe selle het die grootste vouverandering gehad omdat die meeste van die lusiferase-proteïen op hierdie tydstip in Hsp42-SPG's gestoor is.

Ons het gevind dat 'n mutante vorm van die vuurvliegie-luciferase-EGFP-fusieproteïen as 'n model-ensiem kan dien om hierdie probleem aan te pak (Gupta et al., 2011). Hierdie lusiferase mutant het spontaan sitosoliese korrels gevorm wat saam met Hsp42-SPG's in stilstaande fase kulture kolokaliseer, selfs sonder hitteskok (Fig. 1B). Daarteenoor is die wilde-tipe lusiferase selde na die korrel gewerf (3.3±0.9% in vergelyking met 81.3±3.4% in die selle wat die lusiferase-mutant dra). Verder, die korrelvorming van luciferase was streng afhanklik van Hsp42, die luciferase-proteïen was eweredig in die sitosol in die stilstaande fase versprei hsp42Δ selle (Fig. 1C). Die gedrag van luciferase is soortgelyk aan die voorheen geïdentifiseerde Hsp42-SPG-komponente Hos2 en Mca1 (Liu et al., 2012). Aangesien hierdie luciferase mutasies bevat wat geredelik proteïen verkeerd vou sal veroorsaak, verhoog dit die moontlikheid dat slegs proteïene wat geneig is tot wanvouing versamel is na Hsp42-SPGs. Dit bly nietemin onduidelik of die gesekwestreerde proteïene permanent beskadig is of later heraktiveer kan word.

Die vorming van Hsp42-SPGs laat selle toe om proteïenaktiwiteite in stilstaande fase te reguleer

Aangesien die mutante luciferase geleidelik na Hsp42-SPGs versamel is (Fig. 1C), is dit moontlik dat Hsp42-SPGs slegs die luciferase-GFP-proteïen sekwestreer wat heeltemal verkeerd gevou of beskadig is tydens stilstaande fase. Om hierdie hipotese te toets, het ons korrelloos gegroei hsp42Δ mutant en wild-tipe selle en het die aktiwiteit van luciferase op verskillende tydpunte gemonitor. As dit net heeltemal verkeerd gevou of beskadig is en dus onaktiewe proteïene versamel word na Hsp42-SPG's, wildtipe en hsp42Δ mutante selle moet soortgelyke lusiferase-aktiwiteite vertoon. In teenstelling hiermee sal wilde-tipe selle baie laer lusiferase-aktiwiteite toon as Hsp42-SPG's aktief ten volle of gedeeltelik funksionele proteïene kan versamel. In 1-dag selkulture, beide stamme het soortgelyke vlakke van totale sellulêre luciferase aktiwiteit (Fig. 1D). Maar die verskil in luciferase aktiwiteite tussen hsp42Δ en wild-tipe selle het geleidelik toegeneem op latere tye wanneer luciferase korrels begin vorm het (Fig. 1C en D, ~3-voudige en ~10-voudige verskille in onderskeidelik 7-dag-oue en 14-dae-oue selle ).

Ons het ook western blots uitgevoer om die totale hoeveelheid lusiferase-proteïen te ondersoek. In beide wild-tipe en hsp42Δ mutante selle, is die vlakke van lusiferase-proteïen geleidelik verminder – moontlik as gevolg van die geaktiveerde outofagie in stilstaande faseselle (Wang et al., 2001). Nietemin, 'n oorvloed van lusiferase-proteïen in hsp42Δ-mutante was effens minder in vergelyking met dié in die wilde-tipe stam (Fig. 1E), wat die moontlikheid ontken dat verminderde luciferase-aktiwiteite in die wilde-tipe selle deur verminderde proteïenhoeveelhede veroorsaak is. Nog 'n moontlike verklaring vir die hoër lusiferase-aktiwiteit in hsp42Δ-selle is dat meer molekulêre chaperone beskikbaar was in die sitosol van mutante selle. Ons het 'n in vitro luciferase hervoutoets om hierdie moontlikheid te toets (Glover en Lindquist, 1998). Sellisate voorberei van 14 dae oue wildtipe en hsp42Δ-selle, wat nie die luciferase-GFP-konstruksie gedra het nie, is gemeet vir hul vermoë om gedenatureerde luciferase te heraktiveer. Die resultaat het dit gewys hsp42Δ-selle het 'n effens laer vlak van hervouaktiwiteit gehad as wildtipe selle (Fig. S1), wat aandui dat hsp42Δ-selle het nie meer chaperones in die sitosol gehad nie. Saamgevat toon ons resultate dat die sekwestrering van 'n spesifieke proteïen aan Hsp42-SPG's 'n sel in staat stel om sy ensiematiese aktiwiteit af te reguleer sonder om die proteïenvlak te verlaag.

In stilstaande fase kom selle baie uitdagings teë wat soortgelyk is aan strestoestande. Studies in logfaseselle het aan die lig gebring dat selle beskadigde of verkeerd gevoude proteïene in spesifieke kompartemente, soos IPOD, CytoQ of Q-body, onder strestoestande kan versamel, en dat hierdie proteïene daarna afgebreek word sodra die stres verlig is (Escusa-Toret et al. al., 2013 Kaganovich et al., 2008 Miller et al., 2015). Ons het getoets of die proteïenkomponente in Hsp42-SPG's geteiken is vir degradasie of teruggevou kan word in funksionele konformasie wanneer selle die rustige toestand verlaat. Stasionêre fase selle is voorsien van vars medium wat sikloheksimied bevat om translasie van nuwe proteïene te inhibeer. Sikloheksimiedbehandeling het verseker dat die bespeurde lusiferase-aktiwiteit afkomstig was van voorafbestaande lusiferase in stilstaande faseselle. Ons vorige studie het getoon dat Hsp42-SPG's onder hierdie toestand hul komponente uitmekaar haal en vrystel (Liu et al., 2012). Interessant genoeg, sitosoliese lusiferase-aktiwiteit drasties toegeneem toe die proteïen vrygestel is van Hsp42-SPGs (Fig. 1F). Daarteenoor het lusiferase-aktiwiteit op 'n soortgelyke vlak in die korrellose gebly hsp42Δ mutante voor en na voedingsvoeding. Hierdie data verskaf direkte bewyse dat spesifieke proteïene wat in Hsp42-SPGs gestoor is, hervou en heraktiveer kan word vir latere gebruik by herbetreding tot die selsiklus.

Identifikasie van die proteïenkomponente in bekende korrelstrukture binne stilstaande faseselle

Ons resultaat, wat toon dat proteïene wat aan Hsp42-SPGs gesekwestreer is, op latere stadiums heraktiveer kan word, het ons aangespoor om na die endogene komponente van Hsp42-SPGs te soek. Om 'n omvattende lys van Hsp42-SPG-komponente te verkry, het ons 'n genoomwye skerm van die subsellulêre lokalisering van gisproteïene in stilstaande fase uitgevoer met behulp van die gis GFP-fusieversameling (Huh et al., 2003). In die eerste rondte is 4071 stamme uit die versameling vir 5 dae in YPD gekweek om stilstaande fase te betree, en fluoressensiebeelde van selle in beide log en stilstaande fase is ontleed (sien Materiale en Metodes vir besonderhede). Die lokaliseringspatrone van GFP-fusieproteïene in stilstaande fase is met die hand in ses kategorieë verdeel, dit wil sê geen spesifieke patroon, korrel, puntvormig, selperiferie, kernperiferie en fibril nie (Tabel 1 en Fig.S2A sien ook data oor FigShare beskikbaar by https://doi.org/10.6084/m9.figshare.6958307). Die meeste van die proteïene was eweredig versprei in die sitosol, kern of vakuool in stilstaande fase selle en het dus in die kategorie geen spesifieke patroon geval nie. Interessant genoeg het meer as 600 gisproteïene kolagtige strukture in stilstaande fase gevorm, wat in die kategorie puntvormig of korrel val (Tabel 1).

Subsellulêre lokalisering van gisproteïene

e4D53AwjWzTX2F3ldvuOcfsGfeAIMki4itkelG7vw-YBhtpqO6oquhbUo2cVCKrIhkVQnzbFgBld6OWFFEJ2vEiqvIkHgP3vlRbyGNBXrpxrAqvWgM-6FfIysTL3WeD75tlrKeXPrw9O9T65ykB7k7iw0-SAqiRGK7S9A3XGmFl-1kLWtNNOFcxil80THD8isd5XymaA8q7RCbQq4rUNj2SCCLidG8YcSSwTplkpzKOtMLyPyvLHDA __ & ampKey-Pair-id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA "/>

Vervolgens het ons gefokus op die 307 proteïene wat slegs een of twee individuele sitosoliese kolletjies gevorm het, aangesien hierdie kategorie Hsp42 ingesluit het en omdat ander proteïene binne dieselfde kategorie meer geneig was om Hsp42-SPG-komponente te wees (Fig. S2C). Toe die log-fase lokaliseringspatrone van hierdie korrelvormende proteïene ondersoek is, het slegs 'n klein deel van hulle (17.9%) puntvormige patrone getoon en die meerderheid was eweredig in die sitosol (45.0%) of die kern (31.6%) versprei ( Fig. S2D). In totaal het meer as 200 gisproteïene hul oorspronklike lokalisering radikaal verander om sitosoliese korrels te vorm tydens stilstaande fase, wat daarop dui dat korrelvorming 'n spesifieke reaksie is op hongerstres of verouderingseffekte in stilstaande faseselle.

Om die Hsp42-SPG-komponente verder te identifiseer, is mCherry-gemerkte Hsp42 gebruik as 'n merker van Hsp42-SPG's om te sien of dit saam met ander proteïene gekolokaliseer is (sien Materiale en Metodes vir besonderhede). 'n Plasmied wat die mCherry-gemerk bevat HSP42 geen is eers getransformeer in elk van die 307 stamme wat GFP-fusie korrelvormende proteïene dra, en die transformante is in stilstaande fase geïnduseer om die lokaliseringspatrone van mCherry en GFP seine te ondersoek (Fig. S3A). Van die 307 stamme, 61 vertoon colocalization van GFP en Hsp42-mCherry seine (een voorbeeld word getoon in Fig. 2A), en is gedefinieer as komponente van Hsp42-SPGs (Tabel 2 en Tabel S1). Interessant genoeg is verskillende komponente van Hsp42-SPG's versamel na korrels in volgorde (Fig. S3B en Tabel S2), wat daarop dui dat die Hsp42-SPG 'n spesifieke struktuur het.


Vloeisitometrie-protokol

Terwyl laboratoriums regoor die wêreld voortgaan om vloeisitometrie-protokol te optimaliseer, dit sluit gewoonlik die volgende stappe in:

  1. Selle word met formaldehied gefixeer om die proteïene van belang en hul verbygaande seingebeurtenisse te immobiliseer. of skoonmaakmiddel word by die proefbuis gevoeg om selle deurlaatbaar te maak vir teenliggaampies wat dan hul intrasellulêre spasies kan binnedring. word bygevoeg en moet versigtig gekies word om optimale teiken van die epitope en behoorlike antigeen-opsporing moontlik te maak wanneer verskeie oppervlak- en intrasellulêre proteïene gelyktydig gekleur word.
  2. Die proefbuis word in die vloeisitometer geplaas en die vloeistof word toegelaat om – te bereik en dan uit te gaan deur – die vloeikamer, een sel op 'n slag.
  3. Soos elke sel die laserstraal kruis, word die lig wat daarvan weerkaats na lig/kleurverklikkers oorgedra.
  4. Die data wat uit hierdie eksperiment verkry word, kan uiteindelik ontleding ondergaan om die unieke fasette van die selle self en hul patrone van selsein te ontrafel.

Die teenliggaamkleuring kan ook verskil:

  • Met direkte kleuring, word selle geïnkubeer met 'n teenliggaam wat direk aan 'n fluorochroom gekonjugeer is (bv. FITC). Dit is 'n eenstap-inkubasie en is veral nuttig vir intrasellulêre kleuring.
  • In indirekkleuring, is die primêre teenliggaam nie gemerk nie, maar word eerder opgespoor deur 'n fluorochroom-gemerkte sekondêre teenliggaam. Hierdie metode beteken dat ongekonjugeerde primêre teenliggaampies teen baie verskillende teikens opgewek kan word, wat die keuse van teikenproteïene vir die navorser verbreed.
  • Intrasellulêre kleuring verwys na 'n vlek van intrasellulêre antigene.
  • Laastens kan proteïene wat deur 'n sel afgeskei word, gemerk en opgespoor word met 'n Golgi-blok, gevolg deur intrasellulêre kleuring.

Kursus beskrywing

Die endoplasmiese retikulum (ER) orkestreer verskillende sellulêre prosesse waardeur proteïene gesintetiseer, korrek gevou, verander en uiteindelik na hul eindbestemmings vervoer word. As deel van hierdie deurslaggewende biosintetiese proses word proteïene wat nie behoorlik gevou is nie en gevolglik nadelig vir normale sellulêre funksie voortdurend gegenereer. 'n Algemene kenmerk van baie neurodegeneratiewe siektes, insluitend Alzheimer's en Parkinson's, is ophoping en afsetting van verkeerd gevoude proteïene wat ontstaan ​​wanneer die vermoë van selle om die las van verkeerd gevoude proteïene te hanteer, benadeel word. In hierdie kursus sal ons ondersoek hoe die ER-kwaliteitbeheermasjinerie verseker dat slegs behoorlik saamgestelde proteïene die ER verlaat, terwyl ons onderskei tussen ontluikende proteïene op pad na hul biologies aktiewe gevoude toestand van dié wat terminaal verkeerd gevou is.