Inligting

Wat is die transmembraan 'Positive-Inside Rule' deesdae? Het die definisie met verloop van tyd verander?

Wat is die transmembraan 'Positive-Inside Rule' deesdae? Het die definisie met verloop van tyd verander?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Eerste definisie.

Twee publikasies deur von Heijne in 1989 en 1992 het die 'Positive-Inside-reël' geskep en die praktiese waarde daarvan in topologievoorspelling van transmembraanhelikse getoon. Dit is duidelik omskryf en bewys dat in bakterieë die positief gelaaide residue meer algemeen aan die "binnekant" van 'n membraan (die sitoplasma eerder as die periplasma) gevind word.

Onlangse literatuur.

Dit blyk egter dat die veld wegbeweeg het van die idee van "binne die kompartement" na "binne die sitoplasma" soos meer data beskikbaar geword het. In 'n 2006-oorsig beskryf selfs von Heijne sommige transmembraan-helikse as om aan die positiewe binne-reël te voldoen omdat hul positief gelaaide residue binne die sitoplasma was, hoewel dit nooit eksplisiet terugspoor op die oorspronklike definisie nie. 'n Soortgelyke resensie in 2007 deur von Heijne bied 'n meer definitiewe verfyning van die reël, maar verwyder die konsep van toepassing op subsellulêre membrane.

… die lusse wat die helikse verbind, verskil in aminosuursamestelling, afhangende van of hulle na die binnekant of buitekant van die sel kyk (die “positiewe-binne”-reël).

Ons word nou gekonfronteer met 'n ongemaklike reël wat nie rekening hou met proteïene elders in die sekretoriese pad of in die ander organelle nie. Al daardie proteïene is binne die sel.

Meer onlangs nog grootskaalse ontleding van transmembraanhelikse vanaf verskillende biologiese membraanoppervlaktes, Sharpe et al., 2010 en Baeza-Delgado et al., 2013, wys die groepering van positiewe lading wat sitosolies is eerder as om dit in terme van die binnekant van die kompartement te bespreek. Beide hierdie vraestelle sê steeds dat hulle met die positiewe binne-reël staaf.

Vraag.

Vir my blyk dit dat die definisie ietwat slordig is en breedweg gebruik kan word om "binne die sitoplasma" te sê, alhoewel publikasies huiwerig is om die reël duidelik te definieer. Is die definisie ooit eksplisiet verander, of het die veld stilweg verander wat "binne" beteken?… Of het ek iets heeltemal verkeerd geïnterpreteer? Hoe pas die organelle in by enige van hierdie definisies?


Ek dink jy het die "binne"-deel van die "positiewe-binne-reël" verkeerd verstaan. Miskien omdat "binne" inderdaad 'n onakkurate term is (maar nou is dit geskiedenis en kan dit nie verander word nie ;) ). Om dit 'n bietjie beter te verstaan, help dit om na te dink oor die topologie van die membraan. Tydens sintese word die meeste membraanproteïene (met die ignorering van peroksisomale en mitochondriale proteïene, wat 'n heel ander onderwerp is) in die ER-membraan ingevoeg deur die Sec-translokon. Die dele van die membraanproteïen wat aan die lumen blootgestel word, word deur die ER- en Golgi-apparaat verouder om op die ekstrasellulêre oppervlak aangebied te word. Sekretoriese proteïene (dié wat uiteindelik uit die sel uitgevoer sal word) word op soortgelyke wyse gemaak, behalwe dat hulle heeltemal deur die translokon gaan en in die ER-lumen beland. Daarom is die lumen van die ER (en gevolglik die lumen van ander endomembraankompartemente) topologies in ooreenstemming met die ekstrasellulêre ruimte, "buite", en nie die "binne" van die sel nie. Miskien is dit die maklikste om in 'n prentjie te sien (geleen van hier: http://www.bioon.com/book/biology/mboc/chapter12/figure12-4.gif"> Gekleur in pienk is kompartemente waarvan die topologie ooreenstem met die "buitekant" en gekleurde grys is kompartemente waarvan die topologie ooreenstem met die "binne". Dus, vir membraanproteïene wat byvoorbeeld in die endosoom gevind word, is aminosuurreste in die lumen eintlik "buite" nie "binne". Dit is waar dat dit dalk nie onmiddellik duidelik is vir diegene wat nie diep in die veld deurdrenk is nie. Aangesien die aanvanklike studies bakterieë gebruik het, wat nie membraan-ingeslote subsellulêre kompartemente het nie, was "binne" eenvoudig en sinvol. Miskien sou "positief-in-die-sitoplasma-reël" meer akkuraat gewees het. Hoop dit help!


Membraan-proteïen topologie

Die topologie van 'n integrale membraanproteïen beskryf die aantal en benaderde liggings in die volgorde van die transmembraansegmente, sowel as die algehele oriëntasie van die proteïen in 'n membraan.

Topologie word hoofsaaklik beheer deur die hidrofobisiteit en lengte van transmembraanhelikse sowel as die verspreiding van positief gelaaide residue in die lusse wat die helikse verbind.

In die meeste gevalle word topologie ko-translasie bepaal tydens die translokoon-gemedieerde invoeging van 'n polipeptied in 'n membraan.

Topologieë waarin beide die N-terminus en die C-terminus van 'n proteïen in die sitoplasma is, is oorheersend in beide prokariotiese en eukariotiese selle.

Membraanproteïene ontwikkel hoofsaaklik deur geenduplisering en geenfusie. Baie membraanproteïene vorm dimere waarin die twee homoloë kettings dieselfde topologie (parallelle dimeer) of teenoorgestelde topologieë (antiparallelle dimeer) het. Geensamesmeltings skep intern gedupliseerde strukture waarin die twee helftes van 'n proteïen óf parallel óf antiparallel georiënteer is.


Onlangse vooruitgang in die begrip van membraanproteïensamestelling en struktuur

Om 'n verskeidenheid redes - nie die minste van biomediese belang nie - is integrale membraanproteïene nou baie in fokus op baie gebiede van molekulêre biologie, biochemie, biofisika en selbiologie. Ons begrip van die basiese prosesse van membraanproteïensamestelling, vou en struktuur het die afgelope tyd aansienlik gegroei, beide as gevolg van nuwe metodologiese ontwikkelings, meer hoë-resolusie struktuurdata, en die moontlikheid om membraanproteïene op 'n genoomwye te ontleed. skaal.

So wat is nuut in die membraanproteïenveld? Verskeie aspekte van membraanproteïensamestelling en -struktuur is oor die afgelope paar jaar hersien (Cowan & Rosenbusch, 1994 Hegde & Lingappa, 1997 Lanyi, 1997 von Heijne, 1997 Bernstein, 1998) hier sal ek probeer om 'n aantal opwindende bymekaar te bring. onlangse verwikkelinge. Veral opmerklik is die ontdekkings wat verband hou met die meganismes van membraanproteïensamestelling in die binnemembraan van E. coli, die binnemembraan van mitochondria, en die manier waarop transmembraansegmente deur die ER-translokoon hanteer word.

Ander vooruitgang sluit in gedetailleerde studies van die interaksie tussen transmembraanhelikse en die lipieddubbellaag, en van heliks-heliks pakkingsinteraksies in die membraanomgewing. Die beskikbaarheid van volledige genomiese volgordes het dit moontlik gemaak om membraanproteïene op 'n genoomwye skaal te bestudeer. Ten slotte het 'n handjievol nuwe hoë-resolusie 3D-strukture verskyn.


MATERIALE EN METODES

DNA-konstrukte en chemikalieë

Die ekstrasellulêre drievoudige hemagglutinien (3HA) merker, bestaande uit aminosuurreste van SLEYPYDVPDY-ASYPYDVPDYAYPYDVPD, is in die vierde ekstrasellulêre lus ingevoeg na residu 897 in die G551D CFTR, soos beskryf vir die wild-tipe (wt) en ΔTRF5S0ma et al., 2004 Pedemonte et al., 2005). Die G551D CFTR cDNA is vriendelik verskaf deur Dr. J. Rommens (Hospitaal vir Siek Kinders, Toronto). Alle chemikalieë van die hoogste beskikbare suiwerheid is verkry vanaf Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Kanada) behalwe wanneer aangedui. Bafilomycin A1 (Baf) was van LC Laboratories (Woburn, MA).

Selle

HeLa, Madin-Darby honde nier (MDCK) en RAW264.7 selle is gekweek in Dulbecco se gemodifiseerde Eagle's medium (DMEM) wat 10% fetale bees serum (FBS) bevat in 'n termostate selkultuur broeikas in 5% CO2 by 37°C. Baba hamster nier (BHK) selle is gegroei in DMEM/F12 wat 5% FBS bevat. IB3-selle (vriendelik verskaf deur Dr. P. Zeitlin, Johns Hopkins Universiteit) is gekweek in LHC-8 basale medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) wat 5% FBS bevat. Die IB3-selle het ΔF508/W1282X genotipe (Zeitlin et al., 1991). Die menslike brongiale epiteel sellyn afkomstig van 'n CF pasiënt met 'n ΔF508F508 genotipe (CFBE41o-, aangewys as CFBE) is gekarakteriseer (Cozens et al., 1994) en is in MEM gekweek met GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) aangevul met 10% FBS-serum by 37°C in 'n 5% CO2-bevochtigde broeikas soos beskryf (Gruenert et al., 1995). Om differensiasie van die MDCK en CFBE moontlik te maak, is epiteelselle by samevloeiing vir 3-5 dae gekweek. Primêre makrofage is verkry deur intraperitoneale en brongoalveolêre spoelings soos voorheen beskryf (Guilbault et al., 2008). Makrofage is geïsoleer deur sentrifugering en hersuspendeer in RPMI 1640 met 10% FBS en gesaai op polilisine (Sigma)-bedekte glas dekstrokies. Dekstrokies is volgens vervaardiger se instruksies bedek. Eksperimente is uitgevoer 24-48 uur nadat die selle geplateer is.

Alle seltipes wat gebruik is, is óf verbygaande óf stabiel getransfekteer met wt of G551D CFTR-3HA wat driedubbele hemagglutinienmerkers in die vierde ekstrasellulêre lus bevat (Sharma) et al., 2004). BHK-sel wat die wt en G551D CFTR-3HA uitdruk, is gegenereer soos voorheen beskryf en klone is geselekteer in die teenwoordigheid van 500 μM metotreksaat (Sharma) et al., 2001).

CFTR-variante is stabiel uitgedruk in die CFBE- en HeLa-selle met behulp van lentivirale vektore deur Dr. J. Wakefield (Tranzyme, Birmingham, AL) en geselekteer in die teenwoordigheid van 5 μg/mP puromisien soos beskryf (Bebok) et al., 2005). IB3 brongiale epithelia, wat endogene ΔF508 en W1282X CFTR op onopspoorbare vlakke uitdruk, is stabiel getransfekteer met die pCEP4 uitdrukkingsplasmied wat vir die wt of G551D CFTR-3HA kodeer. 'n Mengsel van klone is geselekteer in higromisien B. Getransfekteerde selle is onderhou in LHC-8 wat 5% FBS en 100 μg · ml −1 higromisien B bevat. RAW-selle is kortstondig getransfekteer met CFTR wat pNut-CFTR kodeer deur gebruik te maak van FuGENE6 as DNA-komplekseringsmiddel ( Roche, Basel, Switserland) volgens die vervaardiger se aanbeveling en ontleed na 48 uur. MDCK-selle is geïnfekteer met retrovirus wat kodeer vir die CFTR-3HA-variante soos voorheen beskryf (Benharouga) et al., 2003).

Diere

Ingeteelde C57BL/6-Cftr +/− heterosigotiese muise is onderhou en geteel in die Dierefasiliteit van die McGill Universiteit Gesondheidsentrum Navorsingsinstituut. Alle kleintjies is tussen 12 en 14 dae oud gegenotipeer. Die diere is in hokke met steriele mieliebeddegoed (Anderson, Bestmonro, LA) aangehou en in geventileerde rakke gehou (Lab Products, Seaford, DE). Ouderdomsooreenstemmende C57BL/6-Cftr +/+ muise en C57BL/6-Cftr −/− muise is in muriene patogeen aangehou-, Helicobacter-, en parasietvrye toestande. Hulle is gehuisves (1-4 diere/hok), geteel en in 'n fasiliteit onder spesifieke patogeenvrye toestande onderhou. Muise is gevoer met óf die NIH-31-gemodifiseerde, bestraalde muisdieet vir wt-muise (Harlan Teklad, Indianapolis, IN) óf 'n vloeibare dieet wat begin op 14 dae vir uitklopmuise (Peptamen liquid diet Nestlé Canada, Brampton, ON, Kanada). Die vloeibare dieet is elke oggend vars voorberei en in 50 ml sentrifugebuise voorsien (Fisher Scientific, Nepean, ON, Kanada). Muise wat vir eksperimente gebruik is, was tussen 19 en 22 weke oud. Eksperimentele prosedures met muise is uitgevoer in ooreenstemming met die Kanadese Raad vir Dieresorg-riglyne en met die goedkeuring van die Fasiliteitsdieresorgkomitee van die Montreal General Hospital Research Institute (Montreal, PQ, Kanada).

Etikettering van endositiese organelle met pH-sensitiewe kleurstowwe

Die luminale pH van vroeë endosome, herwinning endosome, lisosome en fagosome is gereeld bepaal na die selektiewe etikettering van die onderskeie kompartement met fluoresceïen isothiocyanate transferrin (FITC)-gekonjugeerde vrag (bv. CFTR, transferrien, dekstraan, en P. aeruginosa PAO1) deur FRIA soos beskryf vir CFTR en ander vragmolekules (Sharma et al., 2004 Barriere et al., 2007 Kumar et al., 2007 Barriere en Lukacs, 2008 Duarri et al., 2008 Varghese et al., 2008 Glozman et al., 2009).

Om geïnternaliseerde CFTR te merk, is selle geïnkubeer met anti-HA (1:500 verdunning gelykstaande aan 10 μg/ml, MMS101R, Covance Laboratories, Madison, WI) primêre Ab en FITC-gekonjugeerde bok anti-muis sekondêre Fab (1:500 verdunning) , Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) deur primêre vir 1 uur by 37°C te inkubeer. Selle is daarna gewas (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM glukose, 0,1 mM CaCl2en 1 mM MgCl2, pH 7.3) en gejaag vir die aangeduide tyd by 37°C. Vloeistoffase Ab-opname was nie waarneembaar in skyn-getransfekteerde selle nie (data nie getoon nie). Wanneer aangedui, is seloppervlak-inwonende CFTR op ys gemerk deur opeenvolgende inkubasie met die primêre anti-HA Ab en sekondêre FITC-Fab.

Om te bevestig dat die primêre en sekondêre Ab aan CFTR gebind bly tydens FRIA eksperimente, is die pH weerstand van Ab binding gemeet deur immunoperoksidase toets. Na anti-HA– en HRP-gekonjugeerde sekondêre Ab-binding aan CFTR-uitdrukkende HeLa-selle, is die ekstrasellulêre medium pH vir 5 min na pH 7.2, 5.0 en 2.5 aangepas (van Kerkhof et al., 2001 0,15 M NaCl, 50 mM glisien, 0,1% BSA, 20 mM MES, vir pH 2,5 en 5,0, 10 mM HEPES vir pH 7,2). Die hoeveelheid begrensde HRP-gekonjugeerde Ab is gemeet deur Amplex-Red as substraat, met behulp van 'n POLARstar OPTIMA fluoressensieplaatleser (BMG Labtech, Offenburg, Duitsland Barriere) et al., 2006). Die Ab-binding was feitlik onveranderd by pH 5.0, maar verminder met 50% by pH 2.5 (Aanvullende Figuur S1A).

Herwinning endosome is gemerk met FITC-transferrien (Tf 15 μg/ml, 45-min laai na 45 min serum-uitputting by 37°C) en gejaag vir 0-3 min. Lisosomale pH is gemeet met soortgelyke resultate op selle gemerk deur oornag vloeistoffase opname van FITC-dekstraan alleen of in kombinasie met Oregon Green 488-dekstraan (50 μg/ml, MW 10 kDa, Molecular Probes, Eugene, OR) en gejaag vir >3 h.

Fagosomale pH is gemonitor na die opname van FITC- of FITC/TRITC-gekonjugeerde P. aeruginosa (PAO1-stam, vriendelik verskaf deur Dr. M. Parsek, Universiteit van Washington, Seattle). Van 'n oornagkultuur is ~5 × 108 bakterieë opsoniseer in 20% FBS-PBS vir 30 minute by 37°C met roering. Selle is gewas met PBS en gemerk in die teenwoordigheid van 1 mg/ml FITC, TRITC, of ​​'n kombinasie van beide in PBS by pH 8.0 vir 30 minute by kamertemperatuur onder rotasie. Oormaat fluoresserende kleurstowwe is verwyder deur herhaalde sentrifugering in yskoue PBS. Bakterieë is vinnig gevries en by -80°C gestoor.

Organelle pH-meting

FRIA van endositiese organelle is uitgevoer op 'n Axiovert 100 omgekeerde fluoressensiemikroskoop (Carl Zeiss MicroImaging, Toronto, ON, Kanada) by kamertemperatuur toegerus met 'n Hamamatsu ORCA-ER 1394 (Hamamatsu, Japan) afgekoelde CCD-kamera en 'n Planachromat (63× NA) 1.4) doelwit in wese soos voorheen beskryf (Sharma et al., 2004 Barriere et al., 2007 Barriere en Lukacs, 2008 Glozman et al., 2009). Beeldverkryging en FRIA is uitgevoer met MetaFluor-sagteware (Molecular Devices, Downingtown, PA). Beelde is verkry teen 490 ± 5 en 440 ± 10-nm opwekkingsgolflengtes, met behulp van 'n 535 ± 25-nm emissiefilter. Om die aanvanklike versuringstempo van endosome te bepaal (sien Figuur 4E), is CFTR gemerk met anti-HA en FITC-gekonjugeerde bok anti-muis Fab opeenvolgend vir 1 uur op ys en gejaag by 37°C vir die aangeduide tye. Die seloppervlak oorblywende Abs is suur-gestroop voor beeldverkryging (van Kerkhof et al., 2001).

In situ kalibrasiekrommes, wat die verwantskap tussen die fluoressensieverhoudingwaardes en endosoom-, lisosoom- of fagosoom-pH beskryf, het gedien om die luminale pH van individuele vesikels te bereken na fluoressensie-agtergrondaftrekking by beide opwekkingsgolflengtes (bv. Aanvullende Figuur S1, B-D) . In situ kalibrasie is uitgevoer deur die vesikulêre pH tussen 4.5 en 7.4 in K + -ryk medium (135 mM KCl, 10 mM NaCl, 20 mM HEPES of 20 mM MES, 1 mM MgCl) vas te klem2en 0,1 mM CaCl2) met 10 μM nigerisien, 10 μM monensien, 0.4 μM Baf en 20 μM karbonielsianied 3-chloorfenielhidrasoon (CCCP Sigma-Aldrich) en die fluoressensieverhoudings aan te teken. Kalibrasiekrommes is vir elke vragmolekules verkry en met gereelde tussenposes herhaal. As 'n interne kontrole is eenpunt-kalibrasie op elke dekstrokie uitgevoer deur die organellêre pH tot 6.5 vas te klem met 10 μM monensien en nigerisien, 0.4 μM Baf en 20 μM CCCP. In elke eksperiment is die pH van 200–800 endosome/lisosome en 100–400 fagosome bepaal. Mono- of meerpiek Gaussiese verspreidings van vesikulêre pH-waardes is verkry met Origin 7.0 sagteware (OriginLab, Northampton, MA), en die resultate van individuele eksperimente is geïllustreer. Die gemiddelde pH van elke vesikelpopulasie is bereken as die rekenkundige gemiddelde van die data in elke individuele eksperiment deur 200-800 vesikels van 15 tot 60 selle te gebruik. Ten minste drie onafhanklike eksperimente is vir elke toestand uitgevoer.

Bepaling van die relatiewe teenionpermeabiliteit en bufferkapasiteit van organelle

Vinnige dissipasie van die organellêre pH-gradiënt deur die protonpompinhibeerder (Baf) en die protonofoor (CCCP) is gebruik om die relatiewe teenioondeurlaatbaarheid van die organelle te bepaal. Selle is gemerk soos hierbo beskryf en die organellêre pH is deurlopend deur FRIA gemonitor vir die aangeduide tyd. pH-dissipasie is gemeet in die teenwoordigheid van 0.4 μM Baf en 20 μM CCCP. Om die passiewe protonlek te meet, is slegs Baf bygevoeg. Beide Baf en CCCP is teen versadigende konsentrasies gebruik (Lukacs et al., 1990, 1991 Hackam et al., 1997 Steinberg et al., 2007b). Wanneer aangedui, is CFTR geaktiveer met die PKA agonis-skemerkelkie (20 μM forskolien, 0,5 mM 8-(4-chloorfenyltio)adenosien 3',5'-sikliese monofosfaatnatriumsout [CPT-cAMP], en 0,2 mM isobutielmetielMXantien ]) vir 3 min voor Baf+CCCP byvoeging. FRIA is uitgevoer soos hierbo beskryf. Die pH-dissipasietempo is bereken vanaf die aanvanklike helling van die fluoressensieverhoudingverandering. Die bufferkapasiteit van endositiese organelle is bereken uit die mate van vinnige alkalinisering na die byvoeging van 0,5–2 mM NH4Cl in die teenwoordigheid of afwesigheid van Baf. Die berekening is gebaseer op die formule van Roos en Boron (Roos en Boron, 1981 Sonawane en Verkman, 2003).

Die Passiewe Proton Permeabiliteit Bepaling

Die passiewe protonpermeabiliteit van herwinning van endosome, lisosome en fagosome is volgens die volgende vergelyking bereken: waar PH+ is die organellêre passiewe protonpermeabiliteit in cm · s −1 , dpHo/dt is die organellêre protonvloed in pH · s −1 , V is die organellêre volume in cm 3 , S is die organellêre oppervlak in cm 2 , βv is die organellêre bufferkapasiteit in M ​​· pH −1 , en ([H + ]o − [H + ]c), is die transmembraanprotongradiënt tussen die organellumen en die sitosol (Chandy et al., 2001 Grabe en Oster, 2001).Die passiewe protonvloed is gemeet deur die organellêre alkaliseringstempo onmiddellik na 400 nM Baf byvoeging te monitor soos in Figuur 2D getoon. Die bufferkapasiteit is gemeet deur die vinnige alkalinisering van organelle na NH te monitor4Cl byvoeging in die teenwoordigheid van Baf soos uiteengesit in Materiale en Metodes en in Chandy et al. (2001). Die oppervlak en volume van endosome en lisosome is verkry uit gepubliseerde data (Griffiths et al., 1989). Die fagosoomvolume en oppervlakberekening is gebaseer op die aanname dat die gemiddelde fagosoomdeursnee 3 μm is en die afstand tussen die bakteriese wand en die binneblad van die fagosoommembraan 100 nm is, gebaseer op EM-waarnemings (Hart et al., 1987 Chastellier, 2008). In die lig van die hoë teenioongeleiding van die endositiese organelle en die beskeie membraanpotensiaal van fagolisosome (<25 mV insluitend die Donnan-potensiaal-effek Steinberg et al., 2007b), het ons aanvaar dat die membraanpotensiaal 'n beskeie bydrae tot die elektrochemiese proton-dryfkrag in endositiese organelle. Daarom is die passiewe protonpermeabiliteit bereken deur slegs die chemiese protondryfkrag in ag te neem, en dus verteenwoordig dit waarskynlik 'n oorskatting. Daar is aanvaar dat die sitoplasmiese pH konstant is (pH 7.3) tydens die proton-uitvloeimetings (Mukherjee) et al., 1997).

Immunofluoressensiemikroskopie

CFTR subsellulêre verspreiding is bepaal na internalisering van anti-HA Ab vir 1 uur in DMEM en gejaag vir 0.5 uur. CFTR is gevisualiseer deur FITC-gekonjugeerde bok anti-muis Fab of TRITC-gekonjugeerde bok anti-muis na selfiksasie. Gedurende die laaste 45 minute is selle gemerk met FITC-Tf of TRITC-Tf (15 μg/ml) na 45 minute serumuitputting om herwinning endosome te visualiseer. Vroeë endosoommerker 1 (EEA1) en Rab5 is opgespoor deur indirekte immunokleuring met behulp van konyn poliklonale anti-EEA-1 en anti-Rab5 teenliggaampies van Abcam (Cambridge, Verenigde Koninkryk) en Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA), onderskeidelik. Lisosome is gemerk met FITC-dekstraan (50 μg/ml, MW 10 kDa) soos beskryf vir die pH-bepaling. In sommige eksperimente is die lisosoom gekleur met muis monoklonale anti-Lamp-2 Ab (H4B4 Ab is ontwikkel deur Dr. J. Thomas August en Dr. James EK Hildreth en is verkry van die Developmental Studies Hybridoma Bank onderhou deur die Universiteit van Iowa , Departement Biologiese Wetenskappe, Iowa City, IA). Enkel optiese snitte is versamel deur Zeiss LSM510 laser konfokale fluoressensie mikroskoop, toegerus met 'n Plan-Apochromat 63X/1.4 (Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY) soos beskryf (Lechardeur) et al., 2004). Beelde is verwerk met Adobe Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA) sagteware. CFTR fagosomale kolokalisasie is gemeet deur die internalisering van anti-HA Ab gekomplekseer met TRITC-gekonjugeerde bok anti-muis IgG vir 1 uur in DMEM en gejaag vir 0.5 uur, en dan is FITC-PAO1 bakterieë gefagositiseer vir die aangeduide tyd. Kolokalisering is uitgevoer met behulp van die "Kolokalisering"-kenmerk in die Volocity 4.1.0 (Improvision sagteware Molecular Devices, Sunnyvale, CA) sagteware soos beskryf in die Aanvullende Materiale.

Western Blotting

CFTR uitdrukking vlak van sellyne is bepaal deur immunoblotting deur gebruik te maak van anti-HA (MMS101R, Covance) vir epiteelselle of anti-CFTR teenliggaampies (M3A7 en L12B4, Chemokine, East Orange, NJ) vir makrofage. Sellisate is voorberei met behulp van RIPA-buffer wat 10 μg/ml leupeptien, pepstatien, 100 μM fenielmetielsulfonielfluoried, 10 μM MG132 en 10 mM bevat N-etielmaleïmied, en immunoblotting van CFTR is uitgevoer soos voorheen beskryf deur gebruik te maak van verbeterde chemiluminesensie (Sharma et al., 2004).

Jodied-uitvloeitoets

Die plasmamembraan cAMP-afhanklike halied geleiding van getransfekteerde en ouer selle is bepaal met die jodied uitvloei soos beskryf (Sharma) et al., 2001). Die ouerselle het geen of weglaatbare hoeveelheid cAMP-geaktiveerde haliedgeleiding nie. Die CFTR-inhibeerder MalH2 (vriendelik verskaf deur Dr. A. Verkman, Universiteit van Kalifornië, San Francisco) is gelyktydig bygevoeg met die PKA-agonist-skemerkelkie wat 20 μM forskolien, 0.5 mM CPT-cAMP en 0.2 mM IBMX bevat. Die pH-sensitiwiteit van die jodied-uitvloeiing is bepaal na die inkubasie van die selle by pH 5 gedurende die laaste 10 min van die jodiedlading en die uitvloeimeting in onderskeidelik 20 mM MES-aangevulde laai- en uitvloeibuffer. Die jodied-selektiewe elektrode is gekalibreer in MES wat buffer by pH 5 bevat.

Statistiese analise

Eksperimente is ten minste drie keer herhaal of soos aangedui. Data is gemiddeldes ± SEM. Betekenis is geassesseer deur tweekantige p-waardes op 95% vertrouensvlak te bereken met ongepaarde t toets, met behulp van Prism-sagteware (GraphPad Software, San Diego, CA).


3 Resultate

3.1 Interresidu-interaksies in OTM: vergelyking met BTM en GLOB

Ons het interresidu-interaksies in die TM-streek van 3462 helices van 430 proteïene ontleed (ATM-datastel sien Afdeling 2). Absolute tellings vir die interaksies is beskikbaar in Aanvullende Tabel S2. Die resultate word aangebied as hittekaarte wat vertoon: (i) al die interaksies (Fig. 1A), (ii) dié in die proteïen-binnekant (Fig. 1B) of in die lipied-blootgestelde proteïenoppervlak (Fig. 1C), (iii) ) dié van inter-helikale (Fig. 1D) of intra-helikale (Fig. 1E) tipes en (iv) interaksies wat óf syketting-syketting-, syketting-ruggraat- of ruggraat-ruggraatkontakte behels (Aanvullende Fig. S1 en S2). Die deelname van elke residu aan die totale aantal interresidu-interaksies word in Tabel 1 getoon. Die verspreiding van die relatiewe frekwensies van interresidu-interaksies in ATM bied 'n heterogeniese profiel met 'n noemenswaardige deelname van alifatiese residue, gevolg deur aromatiese en polêre residue (hoofsaaklik Ser en Thr), en baie min interaksies het deelgeneem deur gelaaide residue. Die mees algemene residu-residu-pare behels alle kombinasies van alifatiese residue en Phe, hoofsaaklik Leu-Phe, Leu-Ile en Leu-Val. Dit is duidelik dat interaksies wat vertakte alifatiese oorblyfsels behels hoofsaaklik by die proteïenoppervlak voorkom, terwyl interaksies wat Ala betrek meestal in die proteïenbinneland voorkom (Fig. 1B en C). Daar is ook baie interaksies van alifatiese residue of Phe met Ser of Thr. Daarteenoor is daar min polêr-polêre, gelaaide-gelaaide of polêr-gelaaide interaksies, ten spyte van die bekende rol daarvan in proteïenfunksionering (Muller et al., 2008) (Fig. 1H). Hierdie interaksies vind hoofsaaklik in die proteïenkern plaas. Inter-helikale interaksies verdriedubbel intra-helikale interaksies en word hoofsaaklik uitgevoer deur syketting-syketting interaksies van hidrofobiese en Phe residue en interaksies tussen die syketting van hidrofobiese en Phe residue en die ruggraat van Gly en Ala residue (sien Fig. 1D en Aanvullende Fig. S2). Intra-helikale interaksies word hoofsaaklik uitgevoer deur Pro-, Ser- en Thr-reste wat deur sy syketting in wisselwerking tree met die ruggraat van residue in die voorafgaande beurt en ook 'n geringe bydrae van hidrofobiese en Phe-syketting-syketting-interaksies (sien Fig. 1E en Aanvullende Fig. S2).

Die verspreiding van interaksies in die OTM-stel in vergelyking met BTM- en GLOB-stelle. Hittekaarte van die frekwensie van interresidu-interaksies deur residu-pare genormaliseer deur die totale aantal interaksies in (A) OTM stel, (B) die binnekant (ATM IN) en (C) oppervlak (OTM UIT) van OTM'e, (D) interhelikaal (INTER) en (E) intra-helikaal (INTRA) in OTM'e (F) BTM stel en (G) α-helikale GLOB-stel. (H) Netto-plot wat die persentasie interresidu-interaksies verteenwoordig, gegroepeer volgens residutipes: aromaties (Trp, Tyr en Phe), alifaties (Ile, Leu, Val en Ala), Gly-Pro, swaelbevattend (Met en Cys), polêr ( Ser, Thr, Asn en Gln) en gelaaide (Sy, Arg, Lys, Glu en Asp) residue. Ruggraat-ruggraat-interaksies is nie in hierdie plotte oorweeg nie

Die verspreiding van interaksies in die OTM-stel in vergelyking met BTM- en GLOB-stelle. Hittekaarte van die frekwensie van interresidu-interaksies deur residu-pare genormaliseer deur die totale aantal interaksies in (A) OTM stel, (B) die binnekant (ATM IN) en (C) oppervlak (OTM UIT) van OTM'e, (D) interhelikaal (INTER) en (E) intra-helikaal (INTRA) in OTM'e (F) BTM stel en (G) α-helikale GLOB-stel. (H) Netto-plot wat die persentasie interresidu-interaksies verteenwoordig, gegroepeer volgens residutipes: aromaties (Trp, Tyr en Phe), alifaties (Ile, Leu, Val en Ala), Gly-Pro, swaelbevattend (Met en Cys), polêr ( Ser, Thr, Asn en Gln) en gelaaide (Sy, Arg, Lys, Glu en Asp) residue. Ruggraat-ruggraat-interaksies is nie in hierdie plotte oorweeg nie

Aantal residue en deelname aan interresidu-interaksies vir elke residu in OTM'e

. Aantal oorblyfsels. Deelname aan interresidu-interaksies .
Aantal interaksie residue. . Aantal interaksies.
Trp1846 (2.6%) 6801 (3.6%) Aromatiese 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) Aromatiese 31 650 (33.8%)
Tyr2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
Ile7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) Alifaties 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) Alifaties 62 300 (66.6%)
Leu11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
Val7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
Ala8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
Gly6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly-Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly-Pro 15 597 (16.7%)
Pro1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
Ontmoet2612 (3.7%) 8689 (4.6%) Swaelbevattend 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) Swaelbevattend 11 190 (12.0%)
Cys1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
Ser 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) Polêr 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) Polêr 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
Asn 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
Gln 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
Syne 819 (1.2%) 2597 (1.4%) Gelaai 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) Gelaai 10 702 (11.4%)
Arg 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
Lys 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
Glu 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
Asp 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)
. Aantal oorblyfsels. Deelname aan interresidu-interaksies .
Aantal interaksie residue. . Aantal interaksies.
Trp1846 (2.6%) 6801 (3.6%) Aromatiese 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) Aromatiese 31 650 (33.8%)
Tyr2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
Ile7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) Alifaties 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) Alifaties 62 300 (66.6%)
Leu11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
Val7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
Ala8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
Gly6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly-Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly-Pro 15 597 (16.7%)
Pro1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
Ontmoet2612 (3.7%) 8689 (4.6%) Swaelbevattend 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) Swaelbevattend 11 190 (12.0%)
Cys1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
Ser 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) Polêr 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) Polêr 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
Asn 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
Gln 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
Syne 819 (1.2%) 2597 (1.4%) Gelaai 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) Gelaai 10 702 (11.4%)
Arg 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
Lys 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
Glu 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
Asp 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)

Absolute tellings en persentasies (tussen hakies) van elke aminosuur op die samestelling en aantal interaksie-residu en interaksies in die OTM-stel. Persentasies van die aantal interaksie residue en aantal interaksies word vir elke residu (of groep residue) bereken deur onderskeidelik die totale aantal interaksie residue (187 186) en die totale aantal interaksies (93 593) te deel. Ruggraat-ruggraat-interaksies word nie in hierdie tabel oorweeg nie.

Aantal residue en deelname aan interresidu-interaksies vir elke residu in OTM'e

. Aantal oorblyfsels. Deelname aan interresidu-interaksies .
Aantal interaksie residue. . Aantal interaksies.
Trp1846 (2.6%) 6801 (3.6%) Aromatiese 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) Aromatiese 31 650 (33.8%)
Tyr2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
Ile7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) Alifaties 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) Alifaties 62 300 (66.6%)
Leu11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
Val7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
Ala8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
Gly6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly-Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly-Pro 15 597 (16.7%)
Pro1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
Ontmoet2612 (3.7%) 8689 (4.6%) Swaelbevattend 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) Swaelbevattend 11 190 (12.0%)
Cys1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
Ser 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) Polêr 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) Polêr 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
Asn 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
Gln 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
Syne 819 (1.2%) 2597 (1.4%) Gelaai 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) Gelaai 10 702 (11.4%)
Arg 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
Lys 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
Glu 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
Asp 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)
. Aantal oorblyfsels. Deelname aan interresidu-interaksies .
Aantal interaksie residue. . Aantal interaksies.
Trp1846 (2.6%) 6801 (3.6%) Aromatiese 35 234 (18.8%) 6643 (7.1%) Aromatiese 31 650 (33.8%)
Tyr2414 (3.4%) 8745 (4.7%) 8492 (9.1%)
Phe6071 (8.6%) 19 688 (10.5%) 18 446 (19.7%)
Ile7653 (10.8%) 18 541 (9.9%) Alifaties 81 930 (43.8%) 17 389 (18.6%) Alifaties 62 300 (66.6%)
Leu11694 (16.5%) 29 210 (15.6%) 26 498 (28.3%)
Val7634 (10.8%) 17 641 (9.4%) 16 734 (17.9%)
Ala8141 (11.5%) 16 538 (8.8%) 15 699 (16.8%)
Gly6241 (8.8%) 9133 (4.9%) Gly-Pro 16124 (8.6%) 9133 (9.8%) Gly-Pro 15 597 (16.7%)
Pro1806 (2.5%) 6991 (3.7%) 6919 (7.4%)
Ontmoet2612 (3.7%) 8689 (4.6%) Swaelbevattend 11 594 (6.2%) 8467 (9.0%) Swaelbevattend 11 190 (12.0%)
Cys1039 (1.5%) 2905 (1.6%) 2872 (3.1%)
Ser 3755 (5.3%) 11 384 (6.1%) Polêr 30 659 (16.4%) 11 013 (11.8%) Polêr 27 685 (29.6%)
Thr 3728 (5.3%) 11 927 (6.4%) 11 541 (12.3%)
Asn 1302 (1.8%) 4433 (2.4%) 4328 (4.6%)
Gln 902 (1.3%) 2915 (1.6%) 2863 (3.1%)
Syne 819 (1.2%) 2597 (1.4%) Gelaai 11 645 (6.2%) 2496 (2.7%) Gelaai 10 702 (11.4%)
Arg 1016 (1.4%) 2961 (1.6%) 2906 (3.1%)
Lys 718 (1.0%) 1559 (0.8%) 1546 (1.7%)
Glu 799 (1.1%) 2440 (1.3%) 2410 (2.6%)
Asp 668 (0.9%) 2088 (1.1%) 2060 (2.2%)

Absolute tellings en persentasies (tussen hakies) van elke aminosuur op die samestelling en aantal interaksie-residu en interaksies in die OTM-stel. Persentasies van die aantal interaksie residue en aantal interaksies word vir elke residu (of groep residue) bereken deur onderskeidelik die totale aantal interaksie residue (187 186) en die totale aantal interaksies (93 593) te deel. Ruggraat-ruggraat-interaksies word nie in hierdie tabel oorweeg nie.

Vir vergelykingsdoeleindes het ons 'n stel van 129 BTM's en 'n stel van 1231 bundels (19 861 helikse) α-helikale GLOB ontleed (sien Afdeling 2 Aanvullende Tabel S2 en Aanvullende Fig. S1 en S3). Die verspreiding van interaksies wat vir die OTM-stel waargeneem is, verskil merkwaardig van dié wat vir die BTM-stel waargeneem is (Fig. 1F en Aanvullende Tabelle S3 en S4). Laasgenoemde toon 'n meer homogene verspreiding van die interaksies, met minder alifaties-alifatiese en alifaties-polêre interaksies en meer interaksies wat deur aromatiese deelgeneem word. Tyr is verantwoordelik vir die hoogste deelname aan interresidu-interaksies. Omdat die proteïenkern van β-vate hidrofiel is, is die frekwensies van polêr-polêre, polêr-gelaaide en gelaaide-gelaaide interaksies groter. Die verspreiding van interaksies in die GLOB-stel is veral soortgelyk aan die OTM-stel (sien Fig. 1G en Aanvullende Tabelle S3 en S4). Die GLOB-stel beskik oor 'n soortgelyke frekwensie van polêre interaksies in vergelyking met die OTM-stel, meer gelaaide-gelaaide interaksies en minder alifatiese interaksies wat ander residue as Leu behels.

3.2 Die rol van residue in ATM: vergelyking met BTM en GLOB

Om die rol van elke residu in die bogenoemde interresidu-interaksies in LP's (Fig. 1 en Aanvullende Fig. S1 en S2) te verstaan, is dit belangrik om die voorkeur van elke residu (of groepe residue) vir spesifieke lokalisasies binne die bundel te ken. : vir die proteïen binnekant of vir die oppervlak, en vir die diep membraan streke of vir interfaciale streke. Met hierdie doel het ons die frekwensie en verspreiding van elke aminosuur ontleed met inagneming van die algehele proteïen (ALL) en residue wat óf in die proteïenkern (IN) óf in die lipied-blootgestelde proteïenoppervlak (OUT) geleë is (sien Fig. 2A en Aanvullende) Tabel S5). Ons het ook gekyk na die residuverspreiding langs 'n membraanprofiel (sien Fig. 2D en Aanvullende Fig. S4). Hierdie data toon dat baie oorblyfsels wel duidelike voorkeur toon om by die proteïen binnekant geleë te wees of na die lipied dubbellaag te kyk, en om in die middel van die TM segmente of by een of albei (ekstrasellulêre en sitoplasmiese) punte te lê. Die frekwensies van elke oorblyfsel en groepe residue en die deelname aan die algehele aantal interaksies word in Tabel 1 getoon. χ 2 goedheid-van-pas-toetse (sien Afdeling 2) is uitgevoer om te bepaal of tussen-residu-interaksies waargeneem in die OTM stel (Fig. 1) is statisties oorverteenwoordig of onderverteenwoordig (Aanvullende Fig. S5) in vergelyking met wat verwag sou word met die veronderstelling van ewekansige interaksies gebaseer op die waargenome samestelling (aminosuurfrekwensies in Tabel 1 en Aanvullende Tabel S5). Dieselfde analise is uitgevoer, vir vergelykende doeleindes, in die BTM- en GLOB-stelle (Fig. 2F en G, Aanvullende Tabel S5 en Aanvullende Fig. S6).

Samestelling, verspreiding en voorkeurlokalisering van elke aminosuur. Die verspreiding van aminosuurfrekwensies (bo) en groepe residue (onder sien Fig. 1 vir die definisie van residugroepe) in die OTM (A), BTM (B) en GLOB (C) datastelle. Die bydrae van residue in die proteïen binnekant (IN) of in die proteïen oppervlak (OUT) word ook getoon. * dui statistiese verskille aan (P < 0.05) tussen IN- en UIT-frekwensies in 'n χ2-goedheid-van-pas-toets met Bonferroni-korreksies. (D) Volgordelogo's vir die residusamestelling langs die TM-helikse van die OTM-datastel. Beeld gegenereer met WebLogo ( Crooks et al., 2004). Vir elke heliks is die membraansentrum (gestel op 0 Å) gebaseer op Oriëntasies van Proteïene in Membrane (Lomize et al., 2012). Die membraan loop ongeveer tussen -15 (intrasellulêr) en + 15 Å (ekstrasellulêr)

Samestelling, verspreiding en voorkeurlokalisering van elke aminosuur. Die verspreiding van aminosuurfrekwensies (bo) en groepe residue (onder sien Fig. 1 vir die definisie van residugroepe) in die OTM (A), BTM (B) en GLOB (C) datastelle. Die bydrae van residue in die proteïen binnekant (IN) of in die proteïen oppervlak (OUT) word ook getoon. * dui statistiese verskille aan (P < 0.05) tussen IN- en UIT-frekwensies in 'n χ2-goedheid-van-pas-toets met Bonferroni-korreksies. (D) Volgordelogo's vir die residusamestelling langs die TM-helikse van die OTM-datastel. Beeld gegenereer met WebLogo ( Crooks et al., 2004). Vir elke heliks is die membraansentrum (gestel op 0 Å) gebaseer op Oriëntasies van Proteïene in Membrane (Lomize et al., 2012). Die membraan loop ongeveer tussen -15 (intrasellulêr) en + 15 Å (ekstrasellulêr)

3.2.1 Alifatiese residue

Alifatiese residue is die algemeenste in TM-helikse. Hulle is verantwoordelik vir die helfte van die totale aantal residue en neem deel aan twee derdes van die interresidu-interaksies in TM-helikse. Hulle is alomteenwoordig langs die hidrofobiese membraansegment versprei, maar met 'n maksimum by die dubbellaagsentrum. Leu is verreweg die sterresidu en het die grootste frekwensie (16%) en die grootste deelname aan interresidu-interaksies (28%). By die proteïenoppervlak is Leu, Ile en Val die mees algemene residue, wat aandui dat die membraan verkies om met vertakte residue in wisselwerking te tree. Hierdie residue is in wisselwerking met ander Leu, Ile, Val (veral in Leu-Val, Leu-Leu en Leu-Ile interaksies), sowel as Phe en Ala residue wat op die proteïenoppervlak geleë is. Hierdie interaksies word oorverteenwoordig volgens die individuele residufrekwensies. In die proteïenkern is Ala die mees algemene alifatiese residu, gevolg deur Leu, en gevolglik is hulle betrokke by die meeste van die interresi-interaksies, hoofsaaklik met ander alifatiese (Leu, Ala, Val en Ile) residue en Phe deur inter- heliese syketting-syketting interaksies. Ala speel ook 'n belangrike rol in inter-helikale interaksies aangesien sy klein syketting hidrofobiese en polêre sykettings naby sy ruggraat kan allokeer. Dus, alifatiese residue speel 'n belangrike rol in helikspakking.

In BTM word alifatiese residue aan die lipieddubbellaag blootgestel, wat deelneem aan 40% van alle interaksies, deur alifaties-alifatiese en deur alifaties-aromatiese interaksies. Die teenwoordigheid van alifatiese residue in die kern van BTM is skaars aangesien watermolekules toegang tot die proteïenkern het. In GLOB neem alifatiese residue deel aan 60% van die interaksies, hoofsaaklik deur alifaties-alifatiese interaksies. Die kern van GLOB-proteïene is hoogs ryk aan alifatiese residue, veral in Leu- en Ala-reste. Alhoewel Leu en Ala soortgelyke frekwensies het, neem Leu deel aan een derde van alle interaksies, terwyl Ala min bydra.

3.2.2 Aromatiese residue

Aromatiese residue is verantwoordelik vir 15% van alle residue in TM-helikse en neem deel aan byna 36% van die interaksies. Ten spyte van aromaties-aromatiese interaksies is dit bekend dat dit bydra tot 'n beduidende gedeelte van die stabiliserende kragte in proteïene (Goyal et al., 2017), is die aantal interaksies van hierdie tipe skaars (ongeveer 4%). Daarteenoor het aromatiese residue hoofsaaklik interaksie met alifatiese residue. Phe is die tweede mees algemene oorblyfsel op TM-helikse en verreweg die mees gereelde aromatiese residu. Phe-reste is ewe teenwoordig in die oppervlak of in die proteïenkern. Hulle vertoon 'n relatief plat verspreiding langs die TM-segment, maar met 'n piek aan die ekstrasellulêre punt. Phe het hoofsaaklik interaksie met Leu in die oppervlak en met alifatiese residue in die algemeen in die proteïenkern. Trouens, Phe-Leu is die mees algemene interresidu-interaksie in TM-helikse, waar dit 'n belangrike rol speel in die pak van helikse deur middel van syketting-syketting-interhelikale interaksies.Tyr- en Trp-reste het klein frekwensies en het duidelike voorkeur vir die TM-punte, in ooreenstemming met hul rol in interaksie met die lipiedkopgroepe (Baker et al., 2017 Muller et al., 2008 von Heijne, 1992) en met polêre residue in die ekstrasellulêre en intrasellulêre koppelvlak. Terwyl Tyr-reste die proteïenkern verkies, lyk Trp-reste ewe begrawe in die proteïenbinne of op die oppervlak. Tyr en Trp neem deel aan min interresidu-interaksies, hoofsaaklik met Leu. Tog is hierdie interaksies oorverteenwoordig in vergelyking met die interaksies wat van die individuele aminosuurfrekwensies verwag word.

Aromatiese residue is verantwoordelik vir 40% van die totale interaksies in BTM, hoofsaaklik deur Tyr en Trp, wat na die lipieddubbellaag kyk en aromaties-aromatiese en alifaties-aromatiese interaksies uitvoer. Tyr voer 'n beduidende aantal interaksies uit, hoofsaaklik met polêre en gelaaide residue in die proteïenkern en met alifatiese en ander aromatiese residue in die oppervlak van die proteïen. Die paar aromatiese residue wat in GLOB gevind word, is hoofsaaklik in die kern van die proteïen geleë.

3.2.3 Polêre residue

Polêre residue verteenwoordig 14% van die totale aantal residue in TM-segmente en neem deel aan 30% van die interaksies, hoofsaaklik waarby Ser en Thr betrokke is. Hulle het duidelike voorkeur vir die proteïenkern en is alomteenwoordig langs die TM-heliks versprei. Die meeste van die interaksies vind plaas tussen die syketting van Ser en Thr en die ruggraatkarboniel van die oorblyfsel in die voorafgaande beurt wat distorsies veroorsaak ( Ballesteros et al., 2000). Dus, Ser en Thr het 'n belangrike rol in intra-helikale interaksies. Min interhelikale interaksies word ook gevorm tussen die metileengroep van Thr-syketting en hidrofobiese residue of deur C-H···O-H swak waterstofbindings tussen die hidroksielgroepe en hidrofobiese residue (Desiraju, 2005). Alhoewel polêr-polêre interaksies 'n belangrike rol speel in die funksie van proteïene (Muller et al., 2008), is daar relatief min van sulke interaksies in TM-helikse. Gln en Asn vertoon klein frekwensies en dus neem hulle deel aan 'n marginale aantal interresidu-interaksies. Hulle verkies die buitekant van die proteïen, naby die lipiedkopgroepe.

BTM bied die hoogste persentasie polêre residue (ongeveer 20%) in vergelyking met ATM en GLOB. Polêre residue is in wisselwerking met alle tipes residue en is hoofsaaklik in die proteïenbinnekant geleë waar hulle met watermolekules kan in wisselwerking tree. Alhoewel polêre residue gereeld in GLOB voorkom, dra hulle min by tot interaksies, aangesien hierdie residue by die proteïenoppervlak geleë is en hoofsaaklik met watermolekules interaksie het.

3.2.4 Gly en Pro

Gly en Pro is welbekende heliksverwringers of -brekers. Gly verkies om in die proteïen-binnekant te wees—dit is eintlik die tweede mees algemene oorblyfsel in die proteïenkern—en in die sentrale deel van die TM-helikse. Die gebrek aan syketting laat toe om die sykettings van lywige naburige hidrofobiese residue naby sy ruggraat toe te ken (Eilers et al., 2002). Die naburige sykettings vorm swak C-H···O = C interaksies met die ruggraat van Gly. Dus, Gly het 'n belangrike rol in ruggraat-syketting interheliese interaksies. Pro is teenwoordig langs die TM-heliks, hoewel met voorkeur vir die ekstrasellulêre streek. Pro het hoofsaaklik interaksie met Leu, hetsy in die proteïenkern of in die proteïenoppervlak. Pro-alifatiese interaksies word oorverteenwoordig met inagneming van die frekwensies van residue in TM-helikse. Pro speel 'n belangrike rol in intra-helikale interaksies, aangesien sy syketting in wisselwerking is met die ruggraat van die voorafgaande beurt, as Ser- en Thr-residue. Dus, benewens sy rol as heliksbreker of as heliksvervormingsinduseerder (Cordes et al., 2002), dra Pro by om TM-bundels te stabiliseer deur intra-helikale interaksies.

In BTM dra Pro in baie min interaksies by, terwyl Gly aan 'n aansienlike aantal interaksies met hidrofobiese en aromatiese residue deur sy ruggraat deelneem. In GLOB het beide Pro en Gly klein frekwensies en dus min deelname aan interaksies.

3.2.5 Cys en Met

Die swaelbevattende residue Cys en Met toon lae frekwensies (veral Cys) in TM-helikse en verkies die proteïenkern en die middelpunt van die TM-helikse (sien Fig. 2). Cys-reste wissel hoofsaaklik met alifatiese residue, Met en Phe. Dit is versoenbaar met die feit dat swaelbevattende residue sterk interaksies met alifatiese en aromatiese aminosure vorm ( Cordomi et al., 2013 Gómez-Tamayo et al., 2016). Die meeste Cys-Cys-interaksie-afstande is versoenbaar met nie-gebonde interaksies eerder as disulfiedbindings. Met toon 'n belangrike bydrae tot die algehele interresidu-interaksies ten spyte van die lae frekwensie daarvan. Trouens, interaksies wat Met behels, is oorverteenwoordig in vergelyking met die interaksies wat van die individuele aminosuurfrekwensies verwag word.

Cys en Met is selfs skaarser in BTM en GLOB en dra min interaksies by. Hulle het geen voorkeur om IN of UIT te wees nie.

3.2.6 Gelaaide reste

Die groep vermoedelik gelaaide residue (His, Lys, Arg, Glu en Asp) het die kleinste frekwensies in TM-segmente - hulle tel slegs 6% op - en neem deel aan 'n klein aantal interresidu-interaksies (ongeveer 11%). Hulle is naby die punte van die TM-segmente geleë. Arg en Lys kyk oorwegend na die sitoplasmiese deel, volgens die 'positiewe binne-reël' (Baker et al., 2017 Muller et al., 2008 von Heijne, 1992). Ten spyte van die lae deelname aan interresidu-interaksies, is die paar gelaaide-gelaaide interaksies oorverteenwoordig in vergelyking met die interaksies wat verwag word van die individuele aminosuurfrekwensies wat ooreenstem met hul voorspelde rol in proteïenfunksie (Muller). et al., 2008).

Gelaaide residue is min in BTM, hulle word hoofsaaklik in die proteïenkern aangetref waar hulle interaksies met gelaaide en polêre residue uitvoer. In teenstelling hiermee maak hulle 40% van die residue in die oppervlak van GLOB uit, waar hierdie residue met die hidrofiele omgewing en met ander gelaaide residue kan inwerk.


Funksionele subklassifikasie van transmembraanproteïenklasse

Nadat membraanproteïene geïdentifiseer en van oplosbare proteïene geskei is deur gebruik te maak van die topologie voorspellingsprogramme hierbo uiteengesit, behels die tweede vlak van klassifikasie in Figuur 1 die groepering van die populasie van membraanproteïene in individuele funksionele klasse, en om die funksie van gekarakteriseerde gene vooruit te identifiseer. Verskeie metodes is gerapporteer om hierdie taak uit te voer, wat in Tabel 3 opgesom word en in Figuur 2 visueel gediagram is.

Soos met baie topologievoorspellingsalgoritmes, vereis hierdie metodes dikwels dat die aminosuurvolgorde op 'n kwantitatiewe wyse opgesom word om twee proteïene te vergelyk. Een so 'n beskrywer wat suksesvol gebruik is, is die fraksie van 'n proteïen se volgorde wat bestaan ​​uit elk van die twintig natuurlik voorkomende aminosure, 'n vektor van lengte twintig wat tot een optel en die 'aminosuursamestelling' genoem word 56,57. Die intuïsie agter hierdie beskrywer is dat afsonderlike klasse membraanproteïene 'n vooroordeel het om spesifieke aminosure met groter frekwensie in te sluit as gevolg van die strukturele vereistes of beperkings vir hul funksie. Verfynings van die aminosuursamestellingbeskrywer is ook voorgestel, soos die gebruik van die ongenormaliseerde telling van die twintig aminosure in 'n proteïenvolgorde, 'n metode wat na bewering meer effektief is aangesien dit ook verskille in die kenmerkende lengte van 'n proteïenfamilie vasvang 58 . Net so het die uitbreiding van die genormaliseerde aminosuursamestelling tot 'n vektorlengte sestig – twintig vir samestelling van die hele proteïen, en twintig elemente elk vir die aminosuursamestelling van transmembraan- en nie-transmembraansegmente – ook beter diskriminasie 59 moontlik gemaak. Soos aminosuursamestelling, is dipeptiedfrekwensies ook suksesvol gebruik as beskrywers om membraanproteïene van verskillende klasse 56,57,60 te onderskei. Die voorheen genoemde PSSM afgelei van Posisie-spesifieke Iteratiewe BLAST (PSI BLAST), wat die waarskynlikheid meet van 'n substitusie van die waargenome na 'n alternatiewe aminosuur op 'n spesifieke posisie gebaseer op substitusiepatrone tussen 'n proteïen en sy homoloë bure, is ook gevind dat dit 'n hoë sensitiwiteit as 'n beskrywer het 61 . Meer abstrak is numeriese beskrywers van vou-energie ook in voorspellingsmodelle 61 gebruik.

Net soos die insetbeskrywers vir hierdie algoritmes verskil, so is die soorte funksionele voorspellings wat in hierdie studies geproduseer word. Verskeie metodes is gebruik om 'n navraaggeen se familielidmaatskap te voorspel, soos om kanale, vervoerders en draers van mekaar te klassifiseer 58 . In groter detail is hierdie metodes ook gebruik om 'n proteïen se substraat te voorspel, soos verskillende metaalione vir kanale of proteïen/nukleïensure vir vervoerders 62 . Voorspellings is ook geteiken vir funksionele parameters spesifiek vir spesifieke klasse membraanproteïene. Aminosuurvolgorde is byvoorbeeld gebruik om die halfmaksimale aktiveringspotensiaal van spanningsgehekte kanale 63 te voorspel, te onderskei tussen kanale op grond van hul elektrofisiologiese parameters 64, of kanale te identifiseer wat as belowende terapeutiese teikens 65 kan dien.

Hierdie voorheen beskryfde metodes maak in wese staat op die nabyheid van 'n navraagproteïen tot 'n omgewing van bekende proteïene in die ruimte van die beskrywer wat gebruik word. Verdere verfynings is voorgestel, waar hierdie nabyheidsmeting gekombineer kan word met ander kenmerke soos Gene Ontologie terme wat die biologiese prosesse beskryf, molekulêre funksies, subsellulêre lokalisering van 'n proteïen 66, teenwoordigheid van klas-geassosieerde proteïenfamilies (Pfam) domeine 67, of die aantal voorspelde transmembraandomeine 68 . Die gevolglike kombinasie van geannoteerde en rou volgorde inligting kan dan gebruik word in 'n voorspelling algoritme soos die voorheen bespreek SVM 68. Inderdaad, die vermoë van aminosuurprofiele om te dien as relevante kenmerke vir die identifisering van funksioneel verwante proteïene kan daarop dui dat families spesifieke motiewe deel, en spesifieke strukturele fragmente en motiewe is ook in verwante studies geïdentifiseer 69,70.

Deur hierdie voorspellings uit te brei gebaseer op tweedimensionele struktuur wat met klassifikasies of funksionele parameters gekorreleer is, is metodes ook ontwikkel om funksie direk op grond van 'n driedimensionele konformasie af te lei. Byvoorbeeld, die SLITHER-program gebruik molekulêre modelleringsimulasies om te voorspel of 'n vermeende substraatmolekule die holtes of kanale in 'n proteïenstruktuur 71 kan deurdring. In gevalle waar die bestaan ​​van 'n kanaal in 'n proteïen ongeverifieer is, kan die MolAxis-program gebruik word om te voorspel of hulle bestaan ​​deur gebruik te maak van berekeningsgeometrie 72 . Uiteraard vereis albei hierdie metodologieë driedimensionele proteïenkoördinate wat eksperimenteel nie vir die meeste kanale of ander membraanproteïene beskikbaar is nie, maar kan gekombineer word met homologie-gebaseerde driedimensionele struktuurvoorspellings wat in die vorige afdeling beskryf is om funksionele voorspellings vir afgeleide driedimensionele strukture te genereer .

'n Verwante funksionele voorspelling is om die natuurlike ligand, ioonsubstraat of proteïeninteraksievennoot van die nuwe proteïene te identifiseer. Inderdaad, voorbeelde wat die uitdaging beklemtoon om 'n groot aantal van sewe transmembraanproteïenreseptore te deorphaniseer, waar die natuurlike bindingsvennoot(e) van sommige andersins goed gekarakteriseerde transmembraanreseptore soos BRS-3 onbekend bly 73 . Alhoewel nie spesifiek ontwikkel om peptied-reseptor interaksies te identifiseer nie in silico, grootskaalse voorspellings van proteïen-proteïen-interaksies is beskryf met behulp van twee- en driedimensionele inligting 74,75,76. Sulke algoritmes kan moontlik gebruik word om nuwe interaksies tussen peptiedligande en die subset van peptiedbindende reseptore te identifiseer. Direkte bioinformatika-identifikasie van ligande soos neuropaptiedvoorlopers het ook baat gevind by die verhoogde beskikbaarheid van genoomwye proteomiese en nukleotieddata, soos gedemonstreer deur die berekeningsvoorspelling van meer as 200 nuwe neuropaptiede in die heuningby Apis mellifera, waarvan 100 met behulp van peptidomics bekragtig is 77 . Verwante studies van die rooi meelkewer Tribolium castaneum homologie-analise gebruik het om 30/41 voorspelde neuropeptiedgene te bekragtig deur gebruik te maak van massaspektrometrie data, wat 71 peptiede 78 kodeer. Gegewe die akkuraatheid van die voorspellings in hierdie studies met behulp van groot genomika-datastelle, spekuleer ons dat sulke metodes en inligting 'n belowende poel van potensiële nuwe ligande bied wat in funksionele toetse gekeur kan word teen vermeende peptied-bindende reseptore.


Die rol van ander proteïenfaktore

Interaksies tussen TM-domeine kan nie verduidelik hoe twee proteïene wat identiese primêre strukture het en dieselfde basiese translokasiemasjinerie gebruik, in twee verskillende oriëntasies gesintetiseer kan word nie. Verskeie proteïene, insluitend die prionproteïen (PrP), duktien, miëlienproteolipiedproteïen (PLP) en die sistiese fibrose transmembraangeleidingsreguleerder (CFTR) bestaan ​​in veelvuldige topologiese vorms (Lopez et al., 1990 Dunlop et al., 1995 Hegde et al. ., 1998b Wahle en Stoffel, 1998). Alhoewel 'n ontluikende ketting toegang kan verkry tot een van die vele beskikbare vou tregters, het studies van PrP getoon dat hierdie verspreiding beide in cis en in trans verander kan word.

Interproteïeninteraksies kan 'n rol speel in beide TM-domeinintegrasie en STE-herkenning. PrP kan in drie verskillende topologiese vorms gesintetiseer word: Ntm PrP, 'n tipe I membraanproteïen waarin die N-terminus in die lumen Ctm PrP is, 'n tipe II membraanproteïen waarin die C-terminus in die lumen is en 'n sekretoriese vorm genoem sek PrP. In vitro, in die afwesigheid van translokasie-bykomstige faktor (TrAF)-aktiwiteit, word PrP uitsluitlik gemaak as die Ctm PrP-vorm (Hegde et al., 1998b), wat neurodegenerasie by muise en mense veroorsaak wanneer dit in vivo gesintetiseer word (Hegde et al., 1998a). Min meer is bekend oor TrAF, maar miskien reguleer dit hoe of wanneer ander faktore, soos TRAM, interaksie met PrP en waarskynlik met baie ander proteïene. Vroeë studies het voorgestel dat reseptor-gemedieerde herkenningsgebeure plaasvind tydens translokasie begin en stop (Mize et al., 1986), wat in ooreenstemming is met die daaropvolgende identifikasie van STE's (Yost et al., 1990). Onlangs het kruisbindingstudies van 'n IgM STE-volgorde twee membraanproteïene geïdentifiseer wat betrokke is by STE-herkenning of -funksie (Falcone et al., 1999). Karakterisering van hierdie STE-reseptore sal een van die volgende stappe wees om te verstaan ​​hoe integrasie gereguleer word.

Chaperone-aktiwiteit blyk ook 'n rol in integrasie te speel. Ten minste een proteïenfaktor in die ER-membraan word voorgestel om verantwoordelik te wees vir behoorlike biosintese van die gap aansluiting komponent konneksien. In vitro sintese of in vivo ooruitdrukking van konneksien lei tot die produksie van afwykend gekloofde molekules omdat seinpeptidase die eerste TM-domein vir 'n seinpeptied verwar. Daar word geglo dat in vivo-splyting van die TM-domein voorkom word deur 'n ongeïdentifiseerde chaperone in die membraan, wat die ontluikende ketting herken en die toegang van seinpeptidase blokkeer. In vitro kan hierdie chaperone afwesig of nie-funksioneel wees (Falk en Gilula, 1998).

Ko-translokasie-modifikasie van ontluikende kettings kan ook biosintese beïnvloed. Oligosakkariel-transferase (OST) assosieer met die translokon en glikosileer ontluikende kettings soos hulle in die ER na vore kom. Om te kyk na moontlike effekte van glikosilering op TM-domeinoriëntasie, het Goder et al.(Goder et al., 1999) 'n chimeriese proteïen geskep wat in enige van twee topologiese vorms gesintetiseer kan word. Toe hulle glikosileringsplekke ontwerp het, het hulle gevind dat heroriëntasie van 'n transmembraandomein in die translokon verhinder is deur glikosilering van die lumenale TM-lus. Hierdie resultate dui daarop dat regulering van glikosilering van inheemse proteïene vou en oriëntasie van proteïene volgens die behoeftes van die sel kan beheer.

Die interproteïeninteraksies wat hierbo beskryf word, beïnvloed waarskynlik biosintese van baie verskillende membraanproteïene. Substraatspesifieke interproteïeninteraksies beïnvloed ook biosintese. In die membraan, soos in die sitosol, assosieer proteïene om funksionele komplekse te vorm. Studies van die P-tipe Na + /K + -ATPase het aan die lig gebring dat die korrekte invoeging van die politopiese α-subeenheid sewende en agtste TM-domeine assosiasie van die bitopiese β-subeenheid met die ekstra-sitosoliese lus tussen die twee TM-domeine vereis (Beguin et al. ., 1998). Wanneer die β-subeenheid die regte streek van die α-subeenheid teëkom, blyk dit 'n konformasieverandering te veroorsaak wat behoorlike vou en integrasie van die TM-domeine bevorder. Spesifieke trans-interaksies wat behoorlike vorming van membraanproteïenkomplekse fasiliteer, kan voorkom dat die ontluikende ketting ongewenste of skadelike assosiasies met homself of ander proteïene maak.

Ons begin meer verstaan ​​oor die proteïene wat membraanproteïensintese beïnvloed, maar daar is nog baie om te leer. Karakterisering van beide TrAF's en die STE-reseptore sal ons begrip van die meganisme van membraandomeinintegrasie verbeter, asook bykomende voorbeelde van substraat-spesifieke interaksies. Identifikasie van die chaperone betrokke by konneksienbiosintese sal ons in staat stel om te leer hoe membraanchaperone funksioneer. Laastens, die ontdekking van proteïene wat glikosilering gebruik om oriëntasie in vivo te beheer, sal ander maniere verduidelik waarop biosintese gereguleer kan word.


Mis ons die dinamiese oligomere toestand? Hoe om 'n simmetriese en buigsame dimeer te bestudeer?

Verkry beheer van 'n swak dimeer

Die lae aantal tans beskikbare homodimeriese TMD-strukture van SPTMRs is waarskynlik 'n weerspieëling van die uitdagings wat verband hou met strukturele studies van hierdie simmetriese en buigsame dimere. 'n Hoë konformasie buigsaamheid en beskeie affiniteit van die TMD homodimere is vermoedelik 'n voorvereiste vir hul verwagte vermoë om tussen konformasies te wissel, hierdie eienskappe daag egter ook duidelik strukturele studies van SPTMR-TMD dimere uit. Soos bespreek, blyk die algehele kwaliteit van die beskikbare strukture beperk te wees, en daarbenewens is die oligomere toestand van die proteïen nie altyd duidelik gedefinieer nie. Die homodimeriese toestand van die meeste van die TMD's is hoofsaaklik bevestig onder die toegepaste toestande deur die verkryging van interheliese NOE's [15, 23, 58-63, 65, 66, 69, 71, 72], soms in kombinasie met kruisbinding eksperimente [ 64] of met die opsporing van grootteveranderinge soos beraam uit ruggraat-ontspanningskoerse [61, 62, 69] of ultrasentrifugering [70]. Interheliese NOE's wat in filtergebaseerde eksperimente verkry word, moet verkieslik vergelyk word met agtergrondverwysingsspektra van die proteïen in die afwesigheid van ongemerkte proteïen om waninterpretasie van sterk intramolekulêre pieke wat deur die filter lek as gevolg van onvolmaakte isotoop-etikettering te voorkom [50] , maar dit is selde duidelik. indien dit verkry is. In die strukturele studies van die monomere TMD's word ook nie altyd aangetoon dat die TMD in werklikheid monomeer onder die toegepaste toestande is nie.Hierdie gebrek aan evaluering van die oligomere toestand is waarskynlik die gevolg van die komplikasies wat veroorsaak word deur hul inbedding in membraanmimetika, wat klassieke grootteskattings afhanklik maak van twee onbekendes (die mate van oligomerisering van die proteïen en die grootte van die membraanmimetika). Opsporing van interheliese NOE's is, wanneer dit behoorlik gebruik word, 'n betroubare maatstaf van 'n beduidende populasie dimeer. Nietemin, interspesie NOE's is hulpbron-swaar metings wat nie geskik is vir die evaluering van groot stelle toestande nie en nie maklik, indien enigsins moontlik, verkry word op kortstondige interaksie proteïene [120]. Verder is hulle nie geskik om die afwesigheid van oligomerisering vir studies van die monomere toestand te bevestig nie. 'n Moontlike strategie is die gebruik van paramagnetiese merkers [48] , waarvan die implementering nietemin voorafkennis van die dimeriseringsplek, die generering van 'n reeks mutante, sowel as bykomende tegniese uitdagings wat met die gebruik van hidrofobiese etikette in die konteks geassosieer kan word, vereis van 'n membraan-nabootsende omgewing. Dus, ontwikkeling van hoë-deurset metodes vir betroubare bepaling van die oligomere toestand van misel-ingebed TMDs onder 'n groot stel van KMR-geskikte toestande is noodsaaklik vir die ontwikkeling van die veld. Een belowende voorsprong is die onlangse ontwikkeling van inheemse massaspektrometrie op membraanproteïene, wat die verkryging van spektra op ongeskonde membraanproteïenkomplekse wat in misele ingebed is [125] moontlik maak. Hierdie metodes is egter steeds nie kwantitatief genoeg om die omvang van oligomerisering te bepaal nie.

'n Besondere uitdaging is die stabilisering van membraanproteïen-oligomere in nie-inheemse membraanmimetika. Dit word al hoe duideliker dat die lipied-dubbellaag aan TMD-assosiasies kan deelneem deur volgorde-onafhanklike effekte soos membraandikte en lading [126, 127]. Verder is voorgestel dat volgorde-afhanklike effekte wat spesifieke lipiedbinding aan TMD-helikse bemiddel, belangrike rolle speel in die regulering van die monomeer-dimeer-ewewig, beide deur dimerisasie teë te werk en te verbeter [128]. Hierdie effekte word natuurlik nie goed gesimuleer in die membraanmimetika wat strukturele studies deur oplossing-toestand KMR-spektroskopie moontlik maak nie, wat die TMD homodimere vermoedelik verder destabiliseer. Verskeie studies het gerapporteer dat die monomeer-dimeer-ewewig vir sommige TMD's gemanipuleer en daardeur bestudeer kan word deur veranderinge in die skoonmaakmiddel-tot-proteïen (DP) of lipied-tot-proteïen (LP) verhouding, soos die eerste keer deur Fisher gerapporteer et al. [129] op die GpA-TMD. Dit is in wese analoog aan die algemene benadering om 'n proteïenkompleks te verdun met die doel om die ewewig na die monomeerkonformasie te stoot om die dissosiasiekonstante daarvan te laat bepaal. Benewens GpA, is monomeer-dimeer-oorgange as gevolg van veranderinge in die DP-verhouding gerapporteer vir baie van die TMD's waarvan strukture gerapporteer is, bv. die homodimere van FGFR3, VEGFR, ErbB1-4, APP en TLR3 [23, 59-63, 69, 71, 130] .

Oplossingstoestand KMR-spektroskopie is 'n kragtige hulpmiddel vir die bestudering van monomeer-dimeer-oorgange as 'n gevolg van veranderinge in bv. DP-verhouding, wat opsporing en residuvlakkartering bied van die vorming en dissosiasie van lae tot matige affiniteitskomplekse, soos bv. homodimere , asook die verskaffing van strukturele inligting. Selfs in gevalle waar veelvuldige oligomere toestande gelyktydig voorkom, kan data onder sekere omstandighede onttrek en aan elke toestand toegewys word. Metodologieë vir die gebruik van oplossing-toestand KMR-spektroskopie vir ondersoek van TMD-oligomerisasie gebaseer op die manipulering van die DP- of LP-verhouding is ontwikkel [130, 131] egter 'n hoë-deurset metode om te bevestig dat die chemiese verskuiwing veranderinge waargeneem spruit uit veranderinge in oligomere toestande is steeds wenslik. Die groot nadeel is ook dat die skoonmaakmiddelkonsentrasies wat vir KMR-studies van toepassing is, beide boonste en onderste perke het. Die boonste limiet word veroorsaak deur 'n toename in monsterviskositeit, en daardeur 'n verlangsaming in molekulêre tuimering, wat lei tot lynverbreding [132], met die presiese konsentrasielimiet afhanklik van die aard van die skoonmaakmiddel en die eksperimentele toestande. Die onderste limiet ontstaan ​​omdat dit moeilik is om data wat verkry is met skoonmaakmiddelkonsentrasies onder die kritiese miselkonsentrasie (CMC) van die skoonmaakmiddel behoorlik te ontleed, aangesien die aard van proteïen/wasmiddelmiselle onder hierdie toestande swak verstaan ​​word. Gevolglik is slegs stelsels wat volledige monomeer-dimeer-oorgange binne die toepaslike skoonmaakmiddelreeks ondergaan, interpreteerbaar. Verder, met die uitsondering van APP-TMD in LMPG-miselle [130], toon die meerderheid TMD-skoonmaakmiddelstelsels wat tot dusver bestudeer is, stadige uitruiling op die KMR-tydskaal van die monomeer-dimeer-oorgang. Gevolglik ontbreek KMR-metodologieë vir die kwantitatiewe bestudering van stelsels in vinnige uitruiling nog steeds.

Oplossingstoestand KMR-studies van die TMD-monomeer-dimeer-oorgang

Die bepaling van die kinetika van monomeer-dimeer-oorgange in skoonmaakmiddeloplosmiddel is 'n taamlik komplekse geval, waarin faktore wat deur die oplosmiddelstelsel opgelê word, soos die CMC, eienskappe en deelname van die skoonmaakmiddel, sowel as miselêre botsings moontlike bydraers is tot die waargenome gedrag . Verskeie modelle is voorgestel om die afleiding van formalismes te help om die oligomerisering van enkeldeurlaat-TMD's in sulke stelsels te beskryf: die deurlopende oplosmiddelmodel [133, 134], die detergent-vrystellingsmodel [129, 134] en die micellêre oplosmiddelmodel [131] . In wese neem die deurlopende oplosmiddelmodel aan dat die skoonmaakmiddel as 'n oplosmiddel in die dimerisasieproses optree, dit wil sê dat dimerisasie in micellêre oplosmiddel soortgelyk optree as dimerisasie in water of 'n lipieddubbellaag. So 'n aanname is hoofsaaklik van toepassing wanneer die monomeer-dimeer-oorgang binne dieselfde misel plaasvind (bv. teen 'n lae DP-verhouding). In die skoonmaakmiddelvrystellingsmodel word die skoonmaakmiddel nie as 'n oplosmiddel hanteer nie, maar eerder as 'n deelnemer aan die dimerisasieproses, 'n beskrywing wat die beste van toepassing gevind is by 'n hoë DP-verhouding en op relatief sterk dimere. Laastens is die miselêre oplosmiddelmodel gebaseer op die aanname dat dimerisasie en dissosiasie slegs plaasvind by botsing en verval van die misel onderskeidelik. Die gepaardgaande formalisme is slegs van toepassing wanneer die miselbotsings gereeld voorkom en die dimeer-dissosiasietempo's stadig is op die KMR-tydskaal, en oorgange binne 'n enkele misel word dus weglaatbaar. 'n Gedetailleerde beskrywing van al die modelle en formalismes vir die beskrywing van die ewewig kan gevind word in Verw. [131] . Dat geen enkele formalisme of model in staat is om alle monomeer-dimeer-oorgange te beskryf nie, beklemtoon hul kompleksiteit, en dat daar nog baie moet verstaan ​​word. Die homodimerisasie van die APP-TMD is byvoorbeeld bestudeer in beide DPC-miselle [71] en in LMPG-miselle [130], waar die monomeer-dimeer in stadige uitruiling op die KMR-tydskaal in DPC is, maar in vinnige uitruiling in LMPG. Dit wil sê, die monomeer-dimeer-oorgang van die APP-TMD pas binne die skoonmaakmiddelvrystellingmodel en die deurlopende oplosmiddelmodel, afhangende van die skoonmaakmiddel eerder as die intrinsieke aard van die TMD-assosiasie. Dit is in lyn met die waarneming dat die grootte van die dimeer-dissosiasiekonstante afhanklik is van die toegepaste skoonmaakmiddel [129, 134], en dus kan die vraag na die biologiese relevansie van sulke skattings van die ewewigskinetika geopper word. Selfs wanneer hierdie metings in lipied-dubbellaag uitgevoer word, wissel die sterkte van die assosiasies aansienlik met membraansamestelling [126, 127], 'n scenario wat biologiese relevansie kan weerspieël. Dit kan beredeneer word, soos voorgestel deur Mineev et al. [131], dat hierdie skattings gebruik kan word om die sterkte van dimeervorming van TMD's gemeet in dieselfde membraan-nabootsende omgewing te vergelyk. Soos genoem, beïnvloed verskillende skoonmaakmiddels en lipiede egter nie struktuur, stabiliteit en funksionaliteit van membraanproteïene op soortgelyke wyse nie en hierdie wisselwerking word tans nie goed verstaan ​​nie. Die vraag is dus of dieselfde membraanmimetiese omgewing ook verskillende TMD monomeer-dimeer ewewigte verskillend beïnvloed, en die gemete ewewigkinetika word dus 'n vergelyking met te veel onbekendes om enige biologies betekenisvolle resultate te verskaf. Daar moet kennis geneem word dat die meeste van hierdie studies slegs op die GpA-TMD uitgevoer is, wat algemeen beskou word as 'n baie stabiele homodimeer [135], wat vermoedelik ook meer verdraagsaam is teen verskillende toestande.

In terme van strukturele kennis van atoomresolusie oor die monomeer-dimeer-oorgang, word slegs die TMD's van ErbB1, ErbB2 en APP voorgestel deur strukture van beide 'n monomeer en 'n homodimeer, en in die geval van ErbB2, kom die monomeer en dimeer nie van dieselfde spesie. Daarbenewens, soos bespreek, bestaan ​​kontroversie rondom die strukture van die ErbB1-TMD, terwyl die kenmerke van die APP-TMD onduidelik is as gevolg van die veelvuldige strukture wat die monomeriese en dimeriese APP-TMD verteenwoordig. Gevolglik is min direkte kennis beskikbaar oor die besonderhede van die strukturele transformasie van die TMD's by monomeer-na-dimeer-oorgang. Die handjievol monomere, heliese TMD's demonstreer egter duidelik dat die vorming van sekondêre struktuur van oligomerisering ontkoppel is. Daar moet egter op gelet word dat daar gevind is dat die ErbB1-TMD α-heliks verleng is met homodimerisasie [62].


Sellulêre spanning

Tensegrity is 'n boubeginsel wat die eerste keer beskryf is deur die argitek R. Buckminster Fuller (Fuller, 1961) en die eerste keer gevisualiseer is deur die beeldhouer Kenneth Snelson (Snelson, 1996). Fuller definieer spanningsisteme as strukture wat hul vorm stabiliseer deur aaneenlopende spanning of `spanningsintegriteit' eerder as deur voortdurende kompressie (bv. soos gebruik in 'n klipboog). Dit word duidelik gesien in die Snelson-beeldhouwerke, wat saamgestel is uit geïsoleerde vlekvrye staalstawe wat in posisie gehou en in die ruimte opgehang word deur hoëspanningkabels (Fig. 1A). Die opvallende eenvoud van hierdie beeldhouwerke het gelei tot 'n beskrywing van tensegrity-argitektuur as 'n gespanne netwerk van strukturele lede wat vormvervorming weerstaan ​​en self-stabiliseer deur ander ondersteuningselemente in te sluit wat kompressie weerstaan. Hierdie beeldhouwerke en soortgelyke strukture saamgestel uit houtstutte en elastiese snare (Fig. 1B) illustreer pragtig die onderliggende kragbalans, wat gebaseer is op plaaslike druk en deurlopende spanning (Fig. 2A) wat verantwoordelik is vir hul stabiliteit. Rigiede elemente word egter nie vereis nie, want soortgelyke strukture kan uit buigsame vere gebou word wat bloot in hul elastisiteit verskil (Fig. 1C).

Tensegriteit strukture. (A) Drievoudige kroon, 'n tensegrity-beeldhouwerk, deur die kunstenaar Kenneth Snelson, wat saamgestel is uit vlekvrye staalstawe en spanningskabels. Let daarop dat hierdie struktuur uit veelvuldige spanningsmodules saamgestel is wat deur soortgelyke reëls met mekaar verbind is. (B) 'n Tensegriteitsfeer wat bestaan ​​uit ses houtstutte en 24 wit elastiese snare, wat naboots hoe 'n sel van vorm verander wanneer dit aan 'n substraat kleef (Ingber, 1993b). (C) Dieselfde spanningskonfigurasie as in B, geheel en al uit vere met verskillende elastisiteite gebou.

Tensegriteit strukture. (A) Drievoudige kroon, 'n tensegrity-beeldhouwerk, deur die kunstenaar Kenneth Snelson, wat saamgestel is uit vlekvrye staalstawe en spanningskabels. Let daarop dat hierdie struktuur uit veelvuldige spanningsmodules saamgestel is wat deur soortgelyke reëls met mekaar verbind is. (B) 'n Tensegriteitsfeer wat bestaan ​​uit ses houtstutte en 24 wit elastiese snare, wat naboots hoe 'n sel van vorm verander wanneer dit aan 'n substraat kleef (Ingber, 1993b). (C) Dieselfde spanningskonfigurasie as in B, geheel en al uit vere met verskillende elastisiteite gebou.

(A) 'n Hoë vergroting aansig van 'n Snelson beeldhouwerk met monster kompressie en spanning elemente gemerk om die spanningskrag balans te visualiseer gebaseer op plaaslike kompressie en deurlopende spanning. (B) 'n Skematiese diagram van die komplementêre kragbalans tussen gespanne mikrofilamente (MF'e), intermediêre filamente (IF's), saamgeperste mikrotubuli (MT's) en die ECM in 'n gebied van 'n sellulêre tensegriteit-skikking. Drukkragte wat deur mikrotubuli (bo) gedra word, word oorgedra na ECM adhesies wanneer mikrotubuli ontwrig word (onder), waardeur substraat traksie verhoog word.

(A) 'n Hoë vergroting aansig van 'n Snelson beeldhouwerk met monster kompressie en spanning elemente gemerk om die spanningskrag balans te visualiseer gebaseer op plaaslike kompressie en deurlopende spanning. (B) 'n Skematiese diagram van die komplementêre kragbalans tussen gespanne mikrofilamente (MF'e), intermediêre filamente (IF's), saamgeperste mikrotubuli (MT's) en die ECM in 'n gebied van 'n sellulêre tensegriteit-skikking. Drukkragte wat deur mikrotubuli (bo) gedra word, word oorgedra na ECM adhesies wanneer mikrotubuli ontwrig word (onder), waardeur substraat traksie verhoog word.

Volgens Fuller se meer algemene definisie sluit spanning twee breë strukturele klasse in - voorgespanne en geodesies - wat albei nie sal optree soos 'n enkele entiteit of om hul vormstabiliteit te handhaaf wanneer meganies onder spanning gebring word sonder voortdurende oordrag van spanningskragte nie (Fuller, 1961 Fuller, 1979 Ingber, 1998 Chen en Ingber, 1999). Eersgenoemde hou hul gewrigte in posisie as gevolg van 'n `voorspanning' (vooraf bestaande trekspanning of isometriese spanning) binne die struktuur (Fig. 1). Laasgenoemde trianguleer hul strukturele lede en oriënteer hulle langs geodetika (minimale paaie) om beweging geometries te beperk. Ons liggame bied 'n bekende voorbeeld van 'n voorgespanne spanningstruktuur: ons bene tree op soos stutte om die trek van trekspiere, tendons en ligamente te weerstaan, en die vormstabiliteit (styfheid) van ons liggame wissel na gelang van die toon (voorspanning) in ons spiere . Voorbeelde van geodetiese spanningstrukture sluit in Fuller se geodetiese koepels, koolstof-gebaseerde buckminsterfullerenes (Bucky Balls) en tetraëdriese ruimterame, wat gewild is by NASA omdat hulle hul stabiliteit handhaaf in die afwesigheid van swaartekrag en dus sonder voortdurende kompressie.

Sommige ondersoekers gebruik spanning om slegs na die voorgespanne "staaf en kabel"-strukture of spesifieke subklasse hiervan te verwys (bv. ongeankerde vorms) (Snelson, 1996 Heidemann et al., 2000). Aangesien Fuller die term tensegrity gedefinieer het, gebruik ek sy meer algemene definisie hier. Die bestaan ​​van 'n gemeenskaplike strukturele basis vir hierdie twee verskillende klasse van struktuur word ook ondersteun deur onlangse werk deur die wiskundige Robert Connelly. Hy het 'n hoogs vereenvoudigde metode ontwikkel om voorafbeklemde spanningskonfigurasies te beskryf en toe ontdek dat dieselfde fundamentele wiskundige reëls die naaste samestelling van sfere beskryf (Connelly en Back, 1998), wat ook die verskillende geodesiese vorme omlyn (Fuller, 1965).

Die sellulêre tensegriteitsmodel stel voor dat die hele sel 'n voorgespanne tensegriteitstruktuur is, alhoewel geodesiese strukture ook in die sel op kleiner grootte skale gevind word. In die model word spanningskragte gedra deur sitoskeletale mikrofilamente en intermediêre filamente, en hierdie kragte word gebalanseer deur onderling verbinde strukturele elemente wat kompressie weerstaan, veral interne mikrotubulusstutte en ekstrasellulêre matriks (ECM) adhesies (Fig. 2B). Individuele filamente kan egter dubbele funksies hê en dra dus óf spanning óf kompressie in verskillende strukturele kontekste of op verskillende grootte skale (bv. rigiede aktienfilamentbundels dra kompressie in filopodia). Die spanningsvoorspanning wat die hele sel stabiliseer, word aktief gegenereer deur die kontraktiele aktomiosienapparaat. Bykomende passiewe bydraes tot hierdie voorspanning kom van seluitsetting deur adhesies aan die ECM en ander selle, osmotiese kragte wat op die selmembraan inwerk en kragte wat deur filamentpolimerisasie uitgeoefen word. Intermediêre filamente wat op baie punte langs mikrotubules, mikrofilamente en die kernoppervlak verbind, verskaf meganiese styfheid aan die sel deur hul materiaal eienskappe en hul vermoë om op te tree as ophangkabels wat die hele sitoskelet en kernrooster met mekaar verbind en spanningsvol verstyf. Daarbenewens verbind die interne sitoskelet by die selperiferie met 'n hoogs elastiese, kortikale sitoskeletale netwerk direk onder die plasmamembraan. Die doeltreffendheid van meganiese koppeling tussen hierdie submembraneuse strukturele netwerk en die interne sitoskeletale rooster hang af van die tipe molekulêre adhesiekompleks wat op die seloppervlak vorm. Die hele geïntegreerde sitoskelet word dan deur 'n viskose sitosol deurdring en omring deur 'n differensieel deurlaatbare oppervlakmembraan.


CMB 334 Eksamen 1

Moderne filterstelsels gebruik weggooibare plastieklaboratoriumitems eerder as algegebaseerde filters en het boonste/onderste kamers en is beskikbaar in 'n verskeidenheid porieëgroottes.

1.) Aard van die nukleïensuur in die virion (Baltimore-model, meestal gebruik)

2.) Simmetrie van die proteïen dop/kapsied

3.) Teenwoordigheid van 'n lipiedmembraan/omhulsel

Weerstandige sel- laat nie virusse toegang toe nie

Floressensie-fokustoets- soortgelyk aan die plaaktoets, behalwe dat 'n teenliggaam vir die virus bygevoeg word saam met 'n tweede fluoresserende aanwyser-teenliggaam wat aan die eerste teenliggaam heg om die virustiter as " waar te neemfluoresserende-fokus-vormende eenhede/ml".

Aansteeklike-sentrums-toets- soortgelyk aan die plaaktoets, behalwe dat dit met 'n bekende aantal besmette selle begin en gebruik word om die proporsie van besmette selle in aanhoudend besmette kulture.

Transformasie-toets- nuttig vir retrovirusse wat nie gedenkplate vorm nie, dit meet die aantal "hope" of fokus wat vorm as gevolg van besmette selle wat hul kontakinhibisie verloor wat hulle in staat stel om 'n normale monolaag te vorm. dit word gemeet in fokusvormende eenhede/ml.