Inligting

Isoleer geen van belang uit 'n groot string DNA

Isoleer geen van belang uit 'n groot string DNA



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek was altyd verward hieroor in die klas en het dit nooit ten volle geleer nie. So sê jy het 10 000 bp DNA en jy wil net 100 bp van spesifieke streek (geen van belang) isoleer deur gebruik te maak van beperkingsensiem.

Hoe kan jy verseker dat aan die albei kante van jou geen van belange die regte volgordes het vir sekere beperkingsensieme om te sny.


As jy aanvaar dat jy presies weet waar in die volle DNA-string die geen van belang is, is dit redelik maklik om die geen te isoleer. Daar is verskeie beperkingsensieme wat jy kan gebruik, dit is net 'n kwessie om te bepaal watter een(s) die geskikste is vir jou geen van belang.

Onthou dat dit gewoonlik goed is om ekstra nukleotiede aan weerskante van die geen te hê; die ribosome sal begin en ophou om peptiede by te voeg gebaseer op begin- en stopkodons, onafhanklik van hoe ver die ribosoom beweeg voordat dit die beginkodon bereik. Ontleed jou DNA-string en probeer om 'n beperkingsensiem te vind wat die string iewers sal sny voordat die geen begin, en gewoonlik 'n ander wat dit iewers sal sny nadat dit eindig, alhoewel dieselfde ensiem soms vir albei kante van die geen sal werk.

Wysig: Soos @Untitpoi genoem het, as die beperkingsensiem se snyvolgorde binne die geen van belang gevind word, sal dit jou geen in twee (of meer) sny. Dit is baie belangrik om te verseker dat die ensiem(e) wat jy kies nie die geen van belang sny nie, anders sal die string nutteloos wees. Dit is moontlik om die drade weer aan te sluit (wat, danksy taai punte, nie te moeilik is nie), maar hoekom die ekstra moeite doen as jy nie hoef nie?


Jy moet iets weet oor die volgorde wat jy wil hê en die flankerende volgorde dan kies jy 'n beperkingsensiem wat ongeveer sal sny waar jy wil. Daar is soveel verskillende ensieme met verskillende snyteikenvolgordes, dit is gewoonlik moontlik om 'n geskikte een te vind.


Inleiding tot die tegnieke van molekulêre biologie

Die doel van hierdie hoofstuk is om sommige van die algemene rekombinante DNA-metodes wat vandag gebruik word, uiteen te sit. Hierdie tegnieke word gewoonlik aangewend om 'n gedefinieerde gedeelte van die genoom, meestal 'n geen, van 'n organisme of weefsel van belang te isoleer en, daarna, om die struktuur en funksie van hierdie genetiese materiaal te karakteriseer. Om 'n geen te isoleer, word genomiese DNA uit 'n geselekteerde weefsel onttrek. Vir 'n beter hantering word die relatief groot DNA-molekules in 'n mengsel van fragmente gesny deur restriksie-endonukleases. Die fragmente word dan van mekaar geskei volgens hul grootte deur gelelektroforese. 'n Prosedure genaamd Southern blotting word gebruik om die teenwoordigheid van die verlangde geen in een van die DNS-fragmente wat op 'n agarosegel geskei is, te verifieer. Die DNA-fragmente word van die jel na 'n filter oorgedra waardeur die oorspronklike fragmentpatroon behoue ​​bly. Dan word 'n enkelstrengige DNS- of RNS-probe spesifiek vir die geen wat geïsoleer moet word, gehibridiseer met sy teikenfragmente wat aan die filter vasgemaak is. 'n Radioaktiewe of fluoresserende merker word aan die sonde geheg vir latere identifikasie. In gevalle waar slegs getranskribeerde volgordes geïsoleer moet word, word sitoplasmiese boodskapper-RNA (mRNA) in plaas van DNA voorberei. Analise van RNA deur 'n tegniek soortgelyk aan Southern blotting word Northern blotting genoem. Bewaring van DNS-volgordes word gewoonlik bereik deur DNS-kloning. DNS-kloning behels die invoeging van 'n DNS-fragment in 'n DNS-vektor en die stabiele inkorporering van die rekombinante DNS in 'n geskikte gasheer. Voortplanting van die gasheer vergemaklik die amplifikasie van die rekombinante DNA vir daaropvolgende analise.


Wysigings van kern-DNS en sy regulatoriese proteïene

DNA-metilering is 'n algemene meganisme van epigenetiese regulering in eukariotiese organismes wat wissel van swamme tot soogdiere. Genetiese studies in model-organismes het die betrokkenheid van DNA-metilering in 'n verskeidenheid biologiese prosesse getoon. By soogdiere word DNA-metileringspatrone gevestig en onderhou deur drie DNA-metieltransferases: Dnmt3a, Dnmt3b en Dnmt1. Die basis van die spesifisiteit van die DNS-metileringsmasjinerie en hoe DNS-metileringspatrone gereguleer word, bly swak verstaan. Die versamelde bewyse dui egter op komplekse wisselwerking tussen DNA-metilering en ander epigenetiese meganismes. Van besondere belang is histoon-lisien-metilering wat getoon is dat dit stewig gekoppel is aan DNA-metilering in verskeie sisteme. Hierdie hoofstuk beklemtoon die bevindinge van verskeie onlangse studies wat insig gee in die meganistiese en funksionele interaksies tussen histoonmetilering en DNA-metilering.


Isoleer geen van belang uit 'n groot string DNA - Biologie

Vorentoe. Een van die kragtiger benaderings wat oor die afgelope twintig jaar ontwikkel is, is die vermoë om DNA te maak, te isoleer en te gebruik wat komplementêr (cDNA) is tot boodskapper-RNA's (mRNA's) wat proteïene van belang kodeer. Aan die einde van die bladsy sal ons kortliks die rede opsom dat cDNS's uiters waardevol kan wees in eksperimentele ontwerp, hoewel baie hiervan reeds vir die meeste lesers duidelik behoort te wees. Dit is ook waar dat daar tientalle verskillende benaderings is om cDNA's van belang te isoleer en dit sal kortliks in die tweede deel van die afdeling beskryf word. Ons sal begin deur te beskryf hoe 'n cDNA vir 'n bekende proteïen geïsoleer kan word deur aminosuurvolgorde-inligting te gebruik, wat histories die eerste manier was waarop 'n cDNA wat vir 'n bekende proteïen kodeer, geïsoleer is. In hierdie eerste afdeling sal ons ook kyk hoe cDNA's gemaak word en hoe cDNA-biblioteke gekonstrueer word.

Enkele sleutelterme. Kom ons begin met drie definisies:

  • Kloon . Eerstens, wat beteken dit om te kloon? Kloning verwys na die isolasie van 'n geneties homogene stam van enige organisme. Binne 'n kloon is alle organismes identies aan alle ander organismes op 'n genetiese vlak. Dit is moontlik om bakterieë of fage of selfs hoër plante te kloon deur 'n enkele sel te isoleer en daardie enkele sel toe te laat om 'n kolonie, of 'n gedenkplaat, of 'n hele plant te produseer. Aangesien die meeste plante afkomstig is van 'n enkele sel met 'n unieke genotipe, is die handeling om blare te wortel om 'n versameling identiese Afrika-viooltjies te produseer, kloning.
    • cDNA-kloning is om 'n enkele, self-repliserende organisme te isoleer en te versterk wat binne sy DNA 'n cDNA insluit wat vir die eksperimenteerder van belang is.
    • In sommige gevalle kan cDNA-kloning bloot verwys na die isolasie van enige enkele cDNA, aangesien, in sommige omstandighede, 'n eksperimentele persoon belangstel in enige cDNA wat deur 'n spesifieke weefsel geproduseer word. Meer gereeld is die uitdaging van cDNA-kloning nie die isolasie van enige cDNA nie, maar die seleksie van 'n enkele cDNA wat vir 'n spesifieke rede van belang is vir die eksperimenteel. Op dieselfde manier is dit moontlik om klone te isoleer wat nie cDNA-klone is nie, maar eerder genomiese klone.
    • Genomiese klone is bloot DNA wat direk van 'n genoom afgelei is. Genomiese DNA sal sekere volgordes soos introne of regulatoriese volgordes insluit wat nie in cDNA's gevind sal word nie.
    • Net so verwys die isolasie van 'n monoklonale teenliggaam na die isolasie van 'n enkele sel wat 'n mRNA uitdruk vir 'n unieke teenliggaam. Dus, maak monoklonale teenliggaampies 'n oefening in kloning.

    Kloningstrategie. Die onderliggende eksperimentele benadering tot kloning kan in vier dele verdeel word.

    • Eerstens is dit nodig om 'n biblioteek te produseer of te verkry, insluitend die volgorde van belang.
    • Tweedens is dit nodig om klone te isoleer wat van belang kan wees.
    • Derdens is dit noodsaaklik om 'n formele toets te ontwikkel om te verseker dat die klone wat geïsoleer is wel die korrekte klone is.
    • Vierdens is dit noodsaaklik om die cDNA wat geïsoleer is vir een of ander interessante biologiese gebruik te plaas.

    cDNA biblioteke. Kom ons kyk na die belangrike aspekte van die bou van 'n cDNA-biblioteek. 'n cDNA-biblioteek bevat eenvoudig volgordes wat aanvullend tot mRNA's is. Daar is 'n aantal verskillende kriteria wat gebruik kan word om die kwaliteit van 'n cDNA-biblioteek te beoordeel. 'n cDNA-biblioteek is oor die algemeen beter as die grootte van die invoegings (dit is die hoeveelheid aaneenlopende cDNA in elke kloon) groot is, ideaal vol-lengte. Ideaal gesproke moet geen lid van die biblioteek cDNA's insluit wat van verskillende mRNA's afgelei is nie (dit kan verwarrend wees). Die biblioteek moet groot genoeg wees dat dit die cDNA van belang bevat (of, meer presies, dit moet genoeg onafhanklik-afgeleide klone hê dat dit die cDNA van belang bevat). Oor die algemeen beteken dit dat dit verteenwoordigend moet wees van al die mRNA's wat in 'n spesifieke weefsel teenwoordig is. Natuurlik, die keuse van 'n weefsel wat 'n relatief groot hoeveelheid van die mRNA van belang het, is 'n belangrike eksperimentele keuse. Oor die algemeen is dit makliker om 'n cDNA uit 'n biblioteek te isoleer waar dit baie keer voorgestel word as uit 'n biblioteek waar dit selde teenwoordig is. Sommige kenmerke van 'n biblioteek hang af van die vektor wat gekies is. Vektore word gereeld gekies omdat hulle die sifting van 'n groot aantal onafhanklike lede van die biblioteek met eksperimentele gemak moontlik maak. Sommige vektore is ontwerp om slegs die cDNA's uit te druk, terwyl ander aangepas is om nie net die cDNA uit te druk nie, maar ook om dit in 'n konteks uit te druk sodat die cDNA in 'n proteïen of 'n samesmeltingsproteïen gemaak word. (Fusieproteïene sal hieronder bespreek word.) Voordat 'n cDNA-biblioteek gebruik word, is dit verstandig om te bepaal of dit 'n goeie kwaliteit biblioteek is. Meer as een student het maande se tyd gemors om 'n biblioteek te keur wat geen insetsels gehad het nie of insetsels so kort dat dit van min waarde was.

    Die maak van cDNA. Generering van cDNA's kan ook deur 'n wye verskeidenheid prosesse gedoen word, maar, in feitlik alle gevalle, word cDNA gegenereer deur die ensiem omgekeerde transkripsie* (RT) wat die vermoë het om die inligting in 'n RNA te gebruik om 'n komplementêre DNA te genereer. Omgekeerde transkriptase is dus 'n RNA-afhanklike DNA-polimerase. Soos alle DNA-polimerases kan dit nie sintese de novo inisieer nie, maar hang af van die teenwoordigheid van 'n primer. Aangesien baie mRNA's 'n poli-A-stert aan die 3'-punt het (sien polyadenilation*), word oligo-dT gereeld gebruik om DNA-sintese te primer (dit is ook moontlik, en dikwels noodsaaklik, om cDNA's te genereer deur óf ewekansige primers óf primers te gebruik ontwerp om 'n spesifieke mRNA te versterk). Sodra die aanvanklike cDNA gegenereer is, is dit oor die algemeen nodig om 'n tweede string DNA te produseer. Weereens, daar is baie strategieë om dit te doen, maar 'n gerieflike meganisme behels blootstelling van die DNA/RNA-baster aan 'n kombinasie van RNAase-H en DNA-polimerase. RNAase-H het die vermoë om enkelstrengs inkepings in die RNA te veroorsaak, en DNA-polimerase kan dan hierdie enkelstrengs inkepings gebruik om "tweede string" DNA-sintese te begin. Hierdie twee-stap prosedure is geoptimaliseer om getrouheid en lengte van cDNA's te maksimeer.

    Inkorporering van cDNA in die vektor. Die volgende uitdaging is om hierdie versameling cDNA s in 'n vektor* te inkorporeer sodat dit gemanipuleer kan word. Een van die gerieflikste maniere om dit te doen, is om te probeer om die cDNA's te manipuleer sodat elkeen 'n unieke beperkingsplek aan daardie punte het. Om dit te doen, word die cDNA's gereeld gemetileer met 'n spesifieke metieltransferase wat 'n metielgroep in 'n spesifieke beperkingsplek inkorporeer om hulle te beskerm teen die beperkingsensiem wat later gebruik sal word. Enige 3'- of 5'-verlengings moet dan óf deur nukleasebehandeling uitgeskakel word óf met polimerase ingevul word. Dit produseer 'n "stomp-einde" molekule waarin die 3'- en 5'-basisse in "register" is. Dit is dan moontlik om 'n sintetiese oligonukleotied aan die punte van hierdie cDNA te ligeer. Stompe afbinding is oor die algemeen 'n lae doeltreffendheidsproses, maar deur 'n hoë konsentrasie van hierdie sintetiese oligonukleotiede te gebruik, is dit moontlik om die reaksie tot byna voltooiing te dryf. Hierdie sintetiese oligonukleotiede kan óf 'skakelaars' wees (wat gesintetiseer word om een ​​stomp punt te hê en een punt wat 'n 'oorhang' het (dws, gebied van enkelstring-DNS) wat aanvullend is tot dié wat deur beperkingsensieme geproduseer word, óf hulle kan ' adapters' (wat 'n dubbelstring DNA-molekule is wat met 'n nuklease behandel kan word om die toepaslike oorhang te produseer).

    Die waarde van die vervaardiging van 'n oorhang is dat dit die bekendstelling van die cDNA in 'n vektor sal vergemaklik. Die vektor kan ook voorberei word deur dit te behandel met dieselfde nuklease, of 'n nuklease wat dieselfde beperkingsplek produseer, om 'n enkelstrengige streek te produseer wat komplementêr is tot die enkelstrengige streek in die cDNA. Die vermenging van die cDNA van belang met die vektor in die teenwoordigheid van ligase laat inkorporering van die cDNA in die vektor toe. Een van die eksperimentele probleme om dit te doen is dat die vektor self 'n hoë neiging sal hê om te herligateer om 'n vektor te vorm sonder enige cDNA-insetsel. Dit word gereeld geminimaliseer deur die vektor met die fosfatase te behandel om die terminale fosfate te verwyder. Hierdie fosfate is nodig vir ligase om te werk, so hierdie strategie verhoed hierdie ongewenste newe-reaksie.

    Die keuse van die vektor wat gebruik word, het ook 'n belangrike impak op eksperimentele uitkoms. Aanvanklik is plasmiede as vektore gekies en is aangepas om merkers in te sluit wat gebruik kan word om te bepaal of 'n plasmied in 'n bakteriese sel ingebring is en of daar 'n cDNA-insetsel in die kloningsplek was. Meer onlangs is afgeleides van bakterieë faag lambda gemaak wat effektiewe vektore vir cDNA-kloning kan wees. Die voordeel van bakterieë faag lambda is dat dit moontlik is om meer onafhanklike klone uit 'n gegewe hoeveelheid mRNA/cDNA te isoleer en om 'n groter aantal klone te sift deur gebruik te maak van hibridisasie tegnieke. Die mate van begrip van lambda- en lambda-genetika het dit moontlik gemaak om lambda-afgeleides te isoleer waar sommige nie-noodsaaklike gene verwyder is, wat dit moontlik maak om invoegings van tot 11 kb cDNA te dra, wat 'n gerieflike grootte is en voldoende is vir die isolasie van die meeste cDNA's. Die lambda-genoom is 'n lineêre molekule wanneer dit in die bakteriofaag verpak word en die cDNA kan in die sentrale gebied van die DNA geïnkorporeer word. Die lambda "arms" (die meer distale dele van die DNA) kodeer al die noodsaaklike inligting vir replikasie van lambda in 'n aansteeklike siklus. Die kloningsplek in lambda -gt10 is gekies om gene te onderbreek wat noodsaaklik is vir lambda om lisogenie * te ondergaan. As die lambda-arms herligeer in die afwesigheid van 'n insetsel, en 'n geskikte gasheer word gekies (hfl, vir hoë frekwensie van lisogenie), dan sal hierdie deeltjies nie gedenkplate vorm nie. Slegs deeltjies wat 'n insetsel dra sal dus plate vorm. Die merkwaardige krag van bakteriofaag lambda as 'n vektor is dat sodra die cDNA in die lambda-arms afgebind is, die DNA dan in 'n faagdeeltjie in vitro geïnkorporeer kan word. Uittreksels wat voorberei is uit selle wat al die nodige proteïene vir die samestelling van lambda het, kan dan met die biblioteek DNA en ATP gemeng word en deeltjies sal saamgestel word! Hierdie deeltjies kan dan gebruik word om E coli te infekteer en elke individuele plaak is 'n onafhanklike klonale populasie wat 'n enkele cDNA-spesie verteenwoordig. Hierdie vermoë kan beide gebruik word om die cDNA-biblioteek te amplifiseer (wat ietwat gevaarlik is omdat herhaalde amplifikasie kan lei tot 'n verlies van sommige cDNA-volgordes) en vir die sifting van die cDNA-biblioteek om die cDNA van belang te isoleer.

    Sifting . 'n Lambda -gt10-biblioteek kan gerieflik gekeur word deur dit teen relatief hoë konsentrasies op 'n bakteriese grasperk van E coli te plaas. Hoë-digtheid sifting laat die eksperimenteel toe om tussen 100 000 en 1 000 000 onafhanklike plate op 'n enkele plaat te sift en maak dit teoreties moontlik om te sift vir 'n cDNA wat slegs by een kopie per sel in 'n spesifieke weefsel teenwoordig is. Sifting word gedoen deur 'n "replica plating" prosedure. Nadat die fage E coli besmet en individuele plate vorm, kan 'n perfekte ruimtelike voorstelling van die besmette gedenkplaat geproduseer word deur 'n stukkie nitrosellulose bo-op die grasperk van E-coli te plaas. Nitrosellulose bind DNS met groot ywer en dus kan van die DNS van elke gedenkplaat na nitrosellulosepapier of selfs verskeie verskillende nitrosellulosepapiere oorgedra word. elke nitrosellulosevel moet 'n voorstelling hê van die oorspronklike patroon van besmette selle op 'n petrischaal. Die DNA van die biblioteek kan dan aan die filter gekruis word en vreemde proteïene kan afgewas word. Die gedenkplate van belang kan dan deur middel van 'n hibridisasietoets gekeur word.

    Dit bring ons by die vraag hoe 'n biblioteek gekeur kan word om kandidate vir die cDNA van belang te isoleer. Een van die mees reguit maniere om dit te doen is om voordeel te trek uit DNA-hibridisasie. As 'n mens 'n oligonukleotied kan ontwerp wat aanvullend tot die mRNA van belang is, kan dit gebruik word om die biblioteek te sift. So 'n oligonukleotied-probe kan ontwerp word deur volgorde-inligting van die aminosuurvolgorde van 'n bekende proteïen. In die 50's en 60's is biochemiese metodes ontwikkel om aminosuurvolgorde van oorvleuelende fragmente van bekende gesuiwerde proteïene te produseer. Ons taak is baie eenvoudiger. Dit is nou net nodig om die aminosuurvolgorde van 'n paar streke van die proteïen te ken. Om dit te doen, word 'n gesuiwerde proteïen gewoonlik verteer met proteases of biochemiese metode om 'n reeks peptiede te produseer. Anders as proteïene, wat met sorg behandel moet word om te verseker dat hulle hul inheemse konformasie behou, kan peptiede as bio-organiese molekules behandel word. Hulle kan gefraksioneer word deur redelik standaardprosedures deur gebruik te maak van HPLC (hoëdrukvloeistofchromatografie) wat in staat is om individuele peptiede op te los. As 'n reeks individuele peptiede opgelos kan word, kan die volgorde van daardie peptiede bepaal word, of ten minste gedeeltelik bepaal word, deur Edmund-degradasie. Hierdie reeks reaksies klief individuele aminosure een op 'n slag van 'n peptied en die resulterende aminosuurderivate kan geïdentifiseer word. Hierdie prosedure kan volgorde-inligting oor 'n reeks peptiede produseer. Om dit intelligent te doen is dit noodsaaklik dat elkeen van die peptiede afkomstig is van 'n enkele proteïenmolekule, en die kriterium om te verseker dat dit waarskynlik die geval sal wees, is in die afdeling oor proteïensuiwering bespreek. Edmund-afbraak werk deur die verwydering van enkele aminosure vanaf die N-terminale punt en kan in sommige gevalle op 'n ongeskonde proteïen toegepas word, maar oor die algemeen word die N-terminale aminogroep chemies gemodifiseer, so hierdie benadering misluk gewoonlik.

    Ontwerp van 'n sonde. 'n Sonde is 'n oligonukleotied wat ontwerp is om aanvullend tot die mRNA van belang te wees sodat dit gebruik kan word om 'n biblioteek te sift. Natuurlik produseer enige mRNA 'n unieke polipeptied wanneer dit vertaal word, maar die omgekeerde is nie waar nie. Omdat die drielingkode gedegenereer is, is daar baie mRNA-volgordes wat dieselfde aminosuurvolgordes kan produseer. As gevolg hiervan is die ontwerp van 'n oligonukleotied-sonde nie reguit vorentoe nie, maar 'n slim eksperimentele persoon kan goeie keuses maak in die ontwerp van 'n sonde. Daar is basies twee strategieë wat gebruik kan word.Óf die eksperiment kan kies om 'n relatief kort oligonukleotied te ontwerp wat hopelik 'n hoë mate van homologie met die mRNA van belang sal hê, óf die eksperimenteel kan kies om 'n langer sonde te ontwerp wat meer geneig is om sommige streke te hê wat nie komplementêr tot die mRNA is nie van belang, maar sal hopelik ten minste 'n paar reekse hê wat 'n stabiele dupleks kan vorm. In baie gevalle maak dit sin om 'n mengsel van verskillende probes te maak, wat homoloë is, maar verskillende basisse het in posisies waar dit nie moontlik is om 'n goeie voorspelling te maak van watter een teenwoordig moet wees nie. Dit word degenerasie genoem. 'n Sonde kan dikwels 64 of 128 keer gedegenereer wees, maar te veel degenerasie verminder die spesifieke aktiwiteit van 'n sonde en verhoog die kans op hibridisasie met die 'verkeerde' cDNA. Die keuse van watter strategie hang af van die aminosuurvolgordes wat beskikbaar is.

    Daar is 'n aantal ander faktore wat ook in ag geneem moet word. By baie organismes is daar 'n voorkeur vir die gebruik van bepaalde drieling bo die gebruik van ander drieling (kodonbenutting). Die ontwerp van 'n sonde wat homologie het met 'n bekende mRNA word oor die algemeen nie aanbeveel nie aangesien dit kan lei tot die kloning van die verkeerde cDNA. Toetsing van enige sonde vir sy ooreenstemming met bekende rye in die databasis is dus noodsaaklik. Die gebruik van aminosure of aminosuurkombinasies wat minder potensiële drieling-koderende volgordes of laer graad van degenerasie het (d.w.s. potensiële volgordes) is van groot belang. As veelvuldige verwante probes moontlik is, is dit dikwels sinvol om met 'n gedegenereerde oligonukleotied te skerm. Sodra 'n probe of 'n reeks probes ontwerp is, kan hulle chemies gesintetiseer word en gemerk word tot hoë spesifieke aktiwiteit met 32 ​​P. Die oligonukleotied probes kan dan met die nitrosellulose filters geïnkubeer word om hibridisasie moontlik te maak. Toestande word gekies om te probeer om die spesifisiteit van die hibridisasie te maksimeer, maar voorsiening te maak vir 'n mate van potensiële wanpassing. Die belangrikste is dat toestande so gekies moet word dat hibridisasie wat nie-spesifiek is of slegs met 'n hoë mate van wanpassing plaasvind nie toegelaat word nie. Filters word dus gewas om ongemerkte of nie-spesifiek gebonde oligonukleotiede te verwyder. Die filters kan dan geoutoradiografeer word om die streke van die filter te identifiseer wat ooreenstem met 'n, hopelik, spesifieke sein. Aangesien die filter 'n replikaat van die oorspronklike plaat is, kan die eksperimenteel dan terugkeer na hierdie plaat en die oorspronklike gedenkplaat of groep plate wat verantwoordelik is vir die sein isoleer. Die gedenkplate kan dan weer op vars E coli uitgeplaat word (onthou elke gedenkplaat bevat fage wat kan infekteer en repliseer in E coli), en die proses word herhaal om uiteindelik 'n enkele gedenkplaat te isoleer wat verantwoordelik is vir die sein (bv. Plaak suiwer * Dit).

    Toets vir spesifisiteit. Terwyl die isolasie van 'n gedenkplaat wat 'n sterk sein gee duidelik 'n opwindende stap is, is dit slegs die eerste stap. Die volgende vraag moet gevra word: is die geïsoleerde cDNA werklik die een van belang? Dit kan sekerlik 'n cDNA wees vir 'n verwante proteïen of 'n heeltemal onverwante proteïen wat toevallig 'n volgorde het wat sou hibridiseer met die sonde wat gekies is. Dit is dus noodsaaklik om 'n paar kriteria te ontwikkel dat die regte cDNA geïsoleer of uit die stryd uitgeskakel is. Daar is 'n aantal kriteria wat aan hierdie behoefte sal voldoen. Die eenvoudigste maak gebruik van volgorde-inligting wat van die geïsoleerde cDNA verkry kan word. In teenstelling met proteïene waar die verkryging van volgorde-inligting eksperimenteel moeilik is, is dit relatief eenvoudig om volgorde-inligting van DNA te kry. Die cDNA kan in 'n gerieflike vektor gesubkloneer word en volgorde-inligting kan verkry word. As die volgorde van die cDNA wat geïsoleer is ook die volgorde kodeer van sommige van die peptiede wat in volgorde geplaas is, maar nie gebruik is om 'n probe te ontwerp nie, is dit beslis oortuigende bewys dat die korrekte cDNA geïsoleer is. Dit sou moeilik wees om te argumenteer dat die verkeerde cDNA geïsoleer is as die volgorde van verskeie onafhanklike peptiede almal deur 'n cDNA voorspel is.

    Dikwels is daar ook elemente van die struktuur van die voorspelde proteïen wat gebruik kan word om die korrektheid van die kloningsprosedure te help bevestig. Tydens die karakterisering van die proteïen is dit gereeld bekend dat die proteïen byvoorbeeld 'n membraanproteïen kan wees, in welke geval 'n mens die bestaan ​​van transmembraanvolgordes kan voorspel. Dit is bekend dat sommige proteïene fosfoproteïene is, wat die teenwoordigheid van óf seriene óf treoniene in 'n spesifieke konteks voorstel wat kinase sal toelaat om hulle te fosforileer. Net so is sommige proteïene geglikosileer en die teenwoordigheid van aminosuurvolgordes wat met glikosilering geassosieer word, sal ook die korrektheid van die kloningsbenadering ondersteun. Weereens moet dit beklemtoon word dat al hierdie bloot kriteria is dat die korrekte cDNA geïsoleer is. Dit moet deur die eksperimenteler gebruik word om 'n oortuigende saak te ontwikkel, maar nie een is absoluut dwaas nie. In sommige gevalle kan die uitdrukkingspatroon van 'n proteïen ('n weefselspesifieke wyse) of 'n verandering in mRNA in organismes wat 'n spesifieke mutasie dra wat bekend is om die aktiwiteit van die proteïen van belang te beïnvloed 'n kragtige maatstaf wees wat dit sal toelaat die eksperimentalis om 'n oortuigende saak te maak dat die korrekte cDNA geïsoleer is. Een van die mees oortuigende benaderings is om te bepaal of die proteïen wat deur die geïsoleerde DNS gekodeer word die biologiese aktiwiteit van belang het, maar dit neem soms tyd om hierdie eksperiment te doen.

    Kry vollengte cDNA's. In sommige gevalle, inderdaad in die meeste gevalle, sal die cDNA wat geïsoleer word nie vollengte wees nie, dit wil sê dit sal slegs ooreenstem met dele van mRNA maar nie die hele volgorde nie. In hierdie geval is dit nodig om die biblioteek weer te skerm, gewoonlik deur die cDNA te gebruik wat reeds geïsoleer is om óf 'n vollengte cDNA óf 'n reeks gedeeltelike cDNA's te identifiseer wat die hele cDNA van belang sal omvat. Dit bring die interessante vraag na vore oor hoe 'n eksperimenteel weet of 'n vollengte cDNA wel geïsoleer is. Oorweging van basiese molekulêre biologie kan 'n aantal leidrade in hierdie vraag verskaf. Die molekulêre gewig van 'n mRNA kan deur noordelike analise* geskat word en dit kan vergelyk word met die grootte van die cDNA wat geïsoleer is. Daarvan is moontlik dat verskeie mRNA's uit 'n enkele geen gegenereer kan word deur alternatiewe splitsing en dit moet onthou word. 'n MRNA moet beide 'n koderende gebied insluit wat 'n lang oopleesraam het sowel as nie-koderende rye (dikwels genoem UTR's *, vir u n t ranslate streke) aan beide die 3'- en 5'-punte. 'n Oop leesraam* is bloot 'n ononderbroke reeks drieling wat nie stopkodons bevat nie. So 'n koderende volgorde behoort 'n proteïen met 'n toepaslike molekulêre gewig te voorspel wat dikwels vergelyk kan word met die molekulêre gewig van die bekende proteïen. Stroomop van die vertaling begin werf word gereeld, maar nie altyd, stop kodons gevind. Die 3'-kant van die boodskap het dikwels 'n poli-A-stert. Daar is byna altyd spesiale belangstelling om die 5'-kant van die mRNA duidelik te identifiseer. Hierdie volgorde is dikwels die moeilikste om van 'n cDNA-biblioteek te verkry aangesien dit effektiewe tru-transkripsie tot die uiterste punt van die mRNA vereis. Dikwels is dit nodig om herhaaldelik na 'n cDNA-biblioteek terug te keer of gespesialiseerde benaderings te gebruik om 'n outentieke 5'-uiteinde te isoleer. Dikwels is die beste manier om volgordes aan die 5'-kant van 'n cDNA te identifiseer om RACE te gebruik, wat 'n PCR-gebaseerde tegniek is om DNS-volgordes naby óf die 5'- óf die 3'-kant van 'n DNS te versterk. Die egtheid van 'n spesifieke 5' einde kan bevestig word deur 'primer extension*' eksperimente te doen. In hierdie tegniek word omgekeerde transkriptase gebruik om 'n oligonukleotied-primer uit te brei wat ontwerp is om naby die voorspelde 5'-kant van 'n mRNA te hibridiseer. Die verlenging van so 'n onderlaag behoort 'n polimeer van 'n spesifieke en voorspelde grootte te produseer.

    Ander metodes om cDNA's te isoleer.

    Die keuse van hoe om cDNA's te isoleer hang af van die belangstelling van die ondersoeker en die gereedskap wat beskikbaar is. Ontwerp van 'n oligonukleotiedprobe is in baie gevalle doeltreffend gebruik, maar daar is baie ander bykomende benaderings wat gebruik kan word. 'n Paar daarvan sal in hierdie afdeling gelys en beskryf word.

    Kloning vanaf uitdrukkingsbiblioteke. In baie gevalle kan 'n vektor ontwerp word sodat die cDNA uitgedruk sal word, dikwels as 'n samesmeltingsproteïen. In hierdie geval is die cDNA in 'n vektor geïnkorporeer in 'n posisie waar dit binne 'n koderende volgorde van 'n ander proteïen is. Die vektor inkorporeer ook promotorvolgordes wat toelaat dat die proteïen uitgedruk word (beide getranskribeer en vertaal). Wanneer so 'n vektor gebruik word om 'n biblioteek te maak, word dit 'n uitdrukkingsbiblioteek* genoem. Uitdrukkingsbiblioteke het die voordeel en nadeel dat die proteïen teenwoordig is. In sommige gevalle kan dit beteken dat daar selektiewe druk teen die uitdrukking 'n cDNA van belang kan wees, maar in baie gevalle maak hierdie uitdrukking 'n nuwe siftingsbenadering moontlik. Die mees eenvoudige hiervan is die gebruik van teenliggaampies om 'n biblioteek te skerm.

    Sifting met 'n teenliggaam is baie soortgelyk aan sifting met 'n oligonukleotied-sonde, maar in hierdie geval is 'n teenliggaam teen die proteïen die reagens wat beskikbaar is. Hierdie teenliggaam kan eksperimenteel gegenereer word, maar dit kan ook beskikbaar wees as gevolg van interessante outo-immuunrespons in 'n diermodel of in 'n menslike bevolking. Sommige kankerpasiënte ontwikkel byvoorbeeld 'n outo-immuun siekte wat lei tot neuronale degenerasie. Die antisera van hierdie pasiënte kan dan gebruik word om 'n geen te isoleer wat 'n proteïen produseer wat deur hierdie teenliggaam herken word. Die teenliggaam kan by nitrosellulose filters gevoeg word onder toestande waar dit spesifiek bind en die teenliggaam kan dan opgespoor word deur 'n sekondêre teenliggaam wat óf met 'n isotoop gemerk is óf kovalent geheg is aan 'n ensiem soos peperwortelperoksidase wat opgespoor kan word met behulp van standaard ensiematiese reaksies . Hier is 'n goeie webwerf wat meer inligting oor hierdie tipe benadering verskaf.

    As daar vermoed word dat 'n cDNA 'n oplosbare faktor kodeer wat 'n bekende biologiese effek het, en as daardie effek maklik getoets kan word, kan die toets 'n manier wees om die biblioteek te skerm, alhoewel dit moeilik kan wees om 'n groot aantal onafhanklike isolate.

    Aanvulling . Sommige gene kan geïsoleer word deur 'n klassieke genetiese aanvullingsbenadering. As daar 'n metode is om vir die uitdrukking van 'n spesifieke geen te selekteer, kan hierdie seleksie gebruik word om 'n cDNA wat vir daardie geen kodeer, te isoleer. Dit is byvoorbeeld relatief reguit vorentoe om óf vir óf teen die teenwoordigheid van die ensiem HGPRTase* (hipoxanthine guanine phospho ribosol transferase) in E. coli of in eukariotiese selle te selekteer. As HGPRTase-tekort E. coli geïsoleer kan word en dan met 'n uitdrukkingsvektor getransformeer kan word, sal daardie selle wat die toepaslike aktiwiteit uitdruk HGPRTase+ word. Aangesien dit moontlik is om vir sulke kolonies te selekteer, sal dit 'n maklike manier wees om 'n cDNA vir HGPRTase van enige organisme te isoleer. Komplementering is gebruik om baie tipes cDNA's te isoleer, insluitend sommige wat komplekse verskynsels soos die selsiklus of membraanhandel reguleer. Die krag van hierdie benadering is dat dit so sterk bewyse vir spesifieke in vivo funksie verskaf. Natuurlik is dit noodsaaklik om onafhanklik vas te stel dat die korrekte kloon geïsoleer is.

    Uitdrukking op die seloppervlak met teenliggaampiesifting. Seloppervlakreseptore is spesiale belangstelling in biologie en hulle kan soms geïsoleer word deur 'n uitdrukkingstrategie te gebruik. Seloppervlakmolekules op limfosiete is byvoorbeeld geïdentifiseer deur die isolasie van spesifieke monoklonale teenliggaampies. Net so is die ligand vir baie reseptore geïsoleer voordat die aard van die reseptor vasgestel is. In beide gevalle sal 'n cDNA vir die seloppervlakmolekule wanneer dit uitgedruk word, lei tot die teenwoordigheid van 'n bindingsplek op die seloppervlak. Hierdie bindingsplek kan gebruik word om 'n biblioteek te sift óf deur 'n metode analoog aan die teenliggaamsifting hierbo genoem óf deur die ligand of teenliggaam as 'n affiniteitsreagens te gebruik om te "pan" vir selle wat die bindingsplek uitdruk.

    Funksionele kloning van reseptore. Een van die meer interessante klasse seloppervlakmolekules is molekules wat ioniese kanale kodeer. As gevolg van die geweldige krag en sensitiwiteit van die elektrofisiologie (elektrofisioloë kan selfs die funksie van 'n enkele molekule meet!), kan die teenwoordigheid van een of 'n paar mRNA-molekules in 'n enkele sel genoeg ioonkanale produseer om relatief maklik opgespoor te word met behulp van 'n elektrofisiologiese benadering. Inspuiting van mRNA's in padda-oösiete kan lei tot die voorkoms van bepaalde ioonkanale wat opgespoor kan word óf as gevolg van hul reaksie op elektriese seine óf die teenwoordigheid van ekstrasellulêre ligande. Hierdie benadering het 'n reguit toets vir die seloppervlakreseptor vir glutamiensuur (glutamaat) verskaf, wat die mees algemene neurotransmitterreseptor in die sentrale senuweestelsel is. Hierdie tipe benadering kan óf staatmaak op uitdrukkingsvektore wat die mRNA van belang kan produseer óf dit kan staatmaak op 'n negatiewe maatstaf. Gesamentlike inspuiting van cDNA's kan 'n sein onderdruk deur spesifiek met die mRNA te hibridiseer. Natuurlik is die probleem met enige van hierdie benaderings dat dit moeiliker word om 'n groot aantal mRNA's te skerm. Hierdie probleem is suksesvol oorkom deur strategieë te gebruik wat 'sib (vir broers en susters) seleksie' behels. In hierdie strategie word duisende onafhanklike klone gelyktydig gekeur, en sodra 'n sein in enige poel geïdentifiseer is, kan die poel self dan onderverdeel word totdat 'n individuele kloon geïsoleer kan word.

    Homologie sifting. Een van die mees produktiewe, hoewel miskien minder kreatiewe benaderings om cDNA's te isoleer, is homologie-sifting *. Sodra 'n interessante geen van een spesie geïsoleer is, is dit relatief eenvoudig om 'n lae-stringensie hibridiseringstrategie te gebruik om cDNA's van 'n ander spesie te isoleer. Net so kan bykomende familielede van dieselfde spesie gereeld geïdentifiseer word. Die krag van hierdie benadering moet nie onderskat word nie. Interessante mutante word gereeld in Drosophila verkry deur genetiese skerms te gebruik en die identifisering van die bestaan ​​van ooreenstemmende gene in mense kan geweldig belangrik wees. Net so, as gevolg van die groot bevolking van mense in die noukeurige monitering van hul mediese sorg, bewys menslike genetiese siektes 'n oorvloedige bron van interessante gene en uiteindelik interessante cDNS's. Die bepaling van die bestaan ​​van sulke cDNA's in modelstelsels kan dan uiters waardevol wees. Goeie voorbeelde hiervan kom uit die veld van apoptose. Sommige van die oorspronklike gene soos die ICE-protease is oorspronklik in studies van C. elegans geïdentifiseer en daarna is menslike homoloë van hierdie gene geïsoleer. Net so is die menslike onkogeen, bcl 2, aanvanklik geïsoleer deur genetiese studies wat gelei het tot die isolasie van die cDNA en daarna is homoloë in modelstelsels geïdentifiseer.

    PCR-gebaseerde skerms. PCR-gebaseerde sifting is ook 'n metode om nuwe cDNS's te isoleer. Nadat twee of meer lede van 'n familie geïsoleer is, kan streke van homologie geïdentifiseer word. Hierdie streke van homologie word binne die familie bewaar, PCR-inleiders kan ontwerp en gebruik word om omgekeerde transkriptase-produkte van mRNA's in 'n toepaslike weefsel te amplifiseer. Die molekulêre gewig van bekende lede van die familie kan voorspel word en nuwe mRNA's kan aanleiding gee tot nuwe amplifikasieprodukte. Sien die afdeling oor proteïene vir 'n goeie voorbeeld hiervan. Hierdie amplifikasieprodukte kan op hul beurt gebruik word om cDNA-biblioteke te skerm. In sommige gevalle kan selfs 'n enkele streek van bewaarde struktuur voldoende wees om nuwe gene te isoleer deur die volgende strategie te gebruik. Omgekeerde transkriptase kan gebruik word om 'n primer wat gemaak is na 'n gekonserveerde volgorde uit te brei. Sulke produkte kan natuurlik heterogeen wees omdat verskillende omgekeerde transkriptase molekules tot verskillende grade sal strek. Sommige beperkingsensieme is egter in staat om enkelstrengs DNA te splits en behandeling van so 'n produk met 'n ensiem van hierdie tipe sal 'n fragment van 'n unieke grootte produseer. So 'n fragment kan dan homo-polimeerstert (d.w.s. 'n volgorde van Cs kan aan die einde van die molekule gevoeg word) met behulp van terminale transferase. Hierdie volgorde van Cs kan dan as 'n plek gebruik word om 'n oligonukleotied-primer wat 'n stuk Gs bevat, te anker. As hierdie primer verleng word, sal die resulterende produk geskik wees vir PCR-amplifikasie tussen die twee primers wat in die skepping daarvan gebruik is.

    Plus/minus sifting en differensiële vertoning* . Nog 'n nuttige benadering om cDNA's van belang te isoleer, berus nie op kennis van hul primêre struktuur nie, maar eerder op aannames oor hul uitdrukking. Beide plus/minus sifting en differensiële vertoning maak staat op strategieë wat poog om cDNA's wat in een situasie uitgedruk word, maar nie 'n ander nie, te isoleer. Dit is byvoorbeeld bekend dat groeifaktore soos NGF of PDGF en hormone soos estrogeen die uitdrukking van nuwe gene veroorsaak. Dus, 'n populasie van selle wat gekweek of gegroei word in die teenwoordigheid en afwesigheid van so 'n eksperimentele manipulasie (bv. +/-NGF, +/-estrogeen, +/- retinoïensuur) behoort sommige gene in gemeen uit te druk, maar het 'n paar afsonderlike mRNA's. Net so kan weefsels in verskillende ontwikkelingstadia uitdrukkingspatrone hê wat van spesiale belang is. Weefsels wat verwant is, maar afsonderlik is, kan ook interessante subset van gene uitdruk. Daar is vermoedelik interessante gene wat in die serebellum uitgedruk word, maar nie basale ganglia of in T-selle nie, maar nie B-selle nie. 'n Isolasie van daardie gene kan 'n leidraad gee tot die funksie van daardie weefsels of die manier waarop geenuitdrukking gereguleer word.

    • In plus/minus sifting word mRNA uit twee populasies selle geïsoleer en omgekeerd getranskribeer om 'n populasie van cDNA's te produseer. Porties van hierdie cDNA's kan dan deur ewekansige heksamer-priming na sonde omgeskakel word en gebruik word om duplikaatopheffings vanaf 'n biblioteek te skerm (dws twee nitrosellulosefilters wat uit dieselfde plaat plate of selle vervaardig word. Enige gedenkplaat of kolonie wat duplikaatopheffings uit 'n biblioteek hibridiseer vir een sonde, maar nie die ander nie, is 'n potensiële kandidaat vir belangstelling, en differensiële uitdrukking kan getoets word deur noordelike analise of 'n verwante benadering.
    • Differensiële vertoning is 'n eenvoudige wysiging van PCR-versterking. In hierdie benadering word mRNA omgekeerd getranskribeer deur 'n reeks primers te gebruik. Dikwels word primers gekies om 'n ewekansige stel oligonukleotied en 'n oligo-dT-afdeling te hê wat met 'n poli-A-stert sal hibridiseer. mRNA's wat homoloog is aan die ewekansig gekose volgorde moet omgekeerd getranskribeer word, wat 'n enkelstrengige cDNA produseer. Die byvoeging van 'n ander primer, weer, ewekansig gekies, sal amplifikasie van 'n subset van die omgekeerde getranskribeerde cDNA's moontlik maak. Afhangende van die afstand tussen die twee primers, sal fragmente van verskillende molekulêre gewigte verkry word. Deur hierdie prosedure te doen met mRNA wat uit twee verskillende selpopulasies geïsoleer is, kan die uitdrukkingspatroon tussen die twee seltipes of seltoestande bepaal word. Weereens, 'n versterkte produk wat vermoedelik uniek is aan 'n spesifieke seltipe, kan dan 'n sonde gebruik word om 'n biblioteek te skerm of uitdrukking te toets deur noordelike analise.Beide hierdie metodes is gebruik om 'n groot aantal interessante gene te isoleer deur slegs hul uitdrukkingspatroon te gebruik.

    Twee baster sifting. Een van die meer aktiewe benaderings om cDNA te isoleer is die twee-hibriede skerms*. Hierdie skerms word genoem omdat hulle voordeel trek uit 'n spesifieke proteïen-proteïen interaksie wat plaasvind tussen twee proteïene wat elk self 'n hibriede proteïen is. Die hele toets maak staat op die vermoë van een deel van elk van die hibriede proteïene om 'n spesifieke interaksie te vorm wat redelik stabiel is onder fisiologiese toestande met die ander. 'n Aantal variasies van hierdie benadering is ontwikkel, maar hulle maak almal staat op dieselfde kenmerk.

    • In die mees eenvoudige weergawe word 'n toetssel geproduseer wat 'n maklik getoetste geen, soos beta-galaktosidase, onder die beheer van 'n goed gekarakteriseerde promotor uitdruk. Die promotor word so gekies dat dit 'n lae basale aktiwiteit het in die afwesigheid van stimulasie van 'n spesifieke regulerende element.
    • Dieselfde sel word dan getransfekteer met 'n uitdrukkingsvektor vir 'n hibriede proteïen. Een deel van die hibriede proteïen is afgelei van 'n transkripsiefaktor wat ontwerp is om die DNA-regulerende element te herken. Binding aan die terrein is egter nie voldoende om geenuitdrukking te induseer nie, maar 'n spesifieke meganisme om transkripsie te aktiveer word vereis. 'n Tweede deel van hierdie hibriede proteïen sluit 'n volgorde in wat uit 'n spesifieke geen van belang geïsoleer is. Hierdie proteïen kan afgelei word van 'n ander transkripsiefaktor, van 'n strukturele proteïen, of van 'n intrasellulêre seinproteïen. Die enigste vereiste is dat die baster self nie voldoende is om uitdrukking van die verslaggewergeen te aktiveer nie.
    • Hierdie selstelsel word dan getransfekteer met 'n uitdrukkingsbiblioteek wat ook 'n versameling saamgesmelte proteïen uitdruk. In hierdie geval bestaan ​​die samesmeltingsproteïen uit twee dele. Een deel van die samesmeltingsproteïen word gekodeer deur die versameling van die cDNA-biblioteke wat die eksperimentele hoop 'n proteïen kan kodeer wat met teiken in die hibriede proteïen wat reeds in die sel uitgedruk is, sal in wisselwerking tree. Die tweede deel van hierdie samesmeltingsproteïen is 'n aktiveerder van transkripsie, dikwels die aktiverende gebied van VP16, 'n kragtige transkripsiefaktor. As 'n sel getransfekteer word met 'n hibriede proteïen wat nie die hibriede proteïen herken wat reeds in die sel (die vlermuis) teenwoordig is nie, behoort niks te gebeur nie.
    • In die seldsame geval waar VP16 uitgedruk word as 'n baster met die proteïen wat interaksie het met die baster wat reeds in die sel teenwoordig is, behoort dit te lei tot aktivering van beta-galaktosidase. Die skerm dien dus as 'n aanvanklike toets vir proteïen-proteïen-interaksie en is so gestruktureer dat 'n groot aantal lede van 'n cDNA-biblioteek vinnig gekeur en geselekteer kan word vir toetsing vir spesifieke interaksie. Natuurlik is daar altyd die moontlikheid dat aktivering deur 'n nie-spesifieke meganisme kan plaasvind, maar hierdie moontlikheid kan sonder te veel moeite getoets word.

    Sifting deur databasisse. Die vinnige ophoping van volgorde-inligting en genetiese data laat wetenskaplikes dikwels die stappe omseil wat nodig is om cDNA's te isoleer. Byvoorbeeld, as gedeeltelike proteïenvolgorde of gedeeltelike cDNA-volgorde beskikbaar is, kan soek na databasisse lei tot die identifisering van kandidaatklone wat georden en getoets kan word om te bepaal of hulle die 'regte' kloon is. Databasisse sluit die volgorde van hele genome in sowel as kort volgordes van cDNA's wat dien om individuele klone (EST's*, of uitgedrukte volgorde-merkers) te merk.

    Opsomming. Elkeen van hierdie metodes van sifting van 'n cDNA-biblioteek verskaf 'n spesifieke skerm of toets vir cDNA's wat van belang kan wees. Net soos dit waar is dat wanneer 'n proteïen gesuiwer word, 'n mens waarskynlik kry waarvoor 'n mens evalueer, sal 'n mens waarskynlik kry waarvoor 'n mens sift. Om vas te stel of die cDNA wat geïsoleer is, inderdaad die een is wat vir die eksperimentele die meeste van belang is, vereis addisionele toetse. In die afwesigheid van begrip van wat daardie toetse moet wees, sal dit min sin maak om aanvanklike vertonings te doen. Net so sal noukeurige oorweging van wat die beste skerms vir 'n spesifieke doel is, waarskynlik lei tot 'n meer vrugbare soektog met 'n hoër persentasie suksesse.

    Waarom cDNA's isoleer? Die laaste onderwerp om in hierdie afdeling te oorweeg, is die vraag waarom isolasie van cDNA's so 'n kragtige benadering is. 'n Aantal antwoorde duik vinnig op.

    1. Deur cDNA's te isoleer, kan die eksperimenteel die cDNA gebruik om uitdrukkingsvektore te ontwikkel sodat proteïene van belang in groot hoeveelhede geproduseer kan word, wat die taak van proteïensuiwering aansienlik vereenvoudig (bv. sien baculovirus-uitdrukking* .)

    2. Om die volgorde van 'n aminosuur te ken, gee onmiddellik toegang tot die volgorde van die proteïen. Deur proteïenstruktuur te waardeer en die algemene motiewe teenwoordig in bekende proteïene te bestudeer, kan 'n groot hoeveelheid inligting afgelei word oor die moontlike struktuur en/of funksie van die proteïen wat deur 'n bekende cDNA gekodeer word. Die teenwoordigheid van volgordes kan maklik voorstel dat die proteïenproduk gefosforileer kan wees of 'n spesifieke klein biochemiese molekule, soos GTP, kan bind.

    3. Die beskikbaarheid van 'n mRNA laat 'n mens toe om vinnig toetse te ontwerp vir die bestudering van die uitdrukking van die mRNA etikettering cDNA kan gebruik word om die uitdrukking van mRNA te bepaal deur gebruik te maak van beide noordelike analise en RNase beskerming en die subsellulêre verspreiding van RNase kan bepaal word deur in situ verbastering. Elkeen van hierdie benaderings bied 'n spesifieke waarde.

    -- Northern-analise* kan vinnig bepaal of die uitdrukkingsvlak verander met geneesmiddelbehandeling, hormone of ontwikkelingstadium. Dit onthul of daar verskeie verskillende mRNA's is wat uitgedruk word. Northern-analise maak staat op die fraksionering van geïsoleerde mRNA's op agarose (of soms akrielamied) gels wat dan na nitrosellulose oorgedra word. Die oorgedrade mRNA s word dan opgespoor deur hibridisasie na 'n gemerkte cDNA-probe.

    -- RNase-beskerming* is 'n meer sensitiewe metode om mRNA-oorvloed te bepaal. In teenstelling met noordelike analise, berus RNase-beskerming op die weerstand van 'n bastermolekule teen vertering. Terwyl mRNA normaalweg uiters sensitief is vir ribonuklease, as RNA geïsoleer word en dan gehibridiseer word na 'n gemerkte sonde (óf RNA of DNA), dan kan die hibriede molekule of 'n gedeelte van 'n hibriede molekule beskerm word teen ribonuklease aktiwiteit. Die hoeveelheid beskermde sonde sowel as die grootte daarvan kan maklik gemeet word.

    - DNA-skikkings laat die bepaling van die uitdrukking van groot getalle mRNA's in 'n enkele eksperiment toe. Dit is gebaseer op die hibridisasie aan nukleïensure wat aan 'n vastefase-ondersteuning geheg is.

    -- RT-PCR.* selfs in die afwesigheid van 'n gemerkte cDNA-probe, kan kennis van die volgorde van 'n cDNA 'n kwantifisering van uitdrukking toelaat. Om 'n cDNA se volgorde te ken, kan PCR-inleiders ontwerp en gebruik word om 'n omgekeerde transkripsieproduk te amplifiseer alhoewel daar beslis probleme is om dit kwantitatief te doen, dit kan ook 'n nuttige en kragtige tegniek wees. Hierdie benadering kan ook aangepas word vir in situ benaderings.

    -- in situ hibridisasie*. Die cDNA kan ook gebruik word om te bepaal watter selle, weefsels of ontwikkelingstadia 'n spesifieke mRNA produseer deur gebruik te maak van in situ hibridisasie. Gemerkte nukleïensuur word met vaste weefsel of selle geïnkubeer onder toestande waar slegs spesifiek gebonde baster stabiel is. Outo-radiografie onthul die posisie van endogene RNA. Kontroles met RNase help om te bewys dat hibridisasie na RNA is nie genetiese materiaal nie.

    3. Soos ons reeds hierbo opgemerk het, kan kennis van mRNA-volgorde die kloning van homoloë volgordes van óf verskillende spesies óf addisionele lede van die geenfamilies binne 'n spesie toelaat.

    4. Beskikbaarheid van 'n cDNA maak produksie van beide poliklonale en monoklonale teenliggaampies baie makliker. Om die volgorde van 'n proteïen te ken, stel 'n mens in staat om 'n peptied te ontwerp en te sintetiseer wat as 'n antigeen (anti-peptiedantigeen) gebruik kan word. Dus, in sommige gevalle kan 'n teenliggaam wat 'n spesifieke proteïen herken, geproduseer word sonder om ooit daardie proteïen te suiwer. Dit laat ook toe dat die uitdrukking en suiwering van 'n proteïen as 'n antigeen gebruik word.

    5. Terwyl uitdrukkingsvektore buitengewoon nuttig is om produksie van groot hoeveelhede van 'n proteïen toe te laat, is hulle miskien selfs meer bruikbaar deurdat hulle produksie van nie net 'n wildtipe proteïen toelaat nie, maar ook produksie van 'n mutante proteïen. Tesame met plekgerigte mutagenese is dit moontlik om proteïene te verander tot byna enige doel wat die eksperimenteerder verlang. Dit laat toetse van spesifieke struktuur-funksie verwantskappe toe. Byvoorbeeld, die belangrikheid van 'n spesifieke fosforileringsplek in die aktiwiteit van 'n proteïen of 'n spesifieke residu in die binding van DNA kan bestudeer word deur mutante proteïene uit te druk. Natuurlik moet alle sulke studies bewus wees van die moontlikheid dat mutante proteïene swak uitgedruk of onstabiel kan wees. Meer alledaagse gebruike van uitgedrukte proteïene wat spesifieke mutasies insluit, sluit die produksie van spesifieke proteïene in wat vir biochemiese reagense of biochemiese produkte gebruik kan word. Sou die bekendstelling van addisionele sulfhidrale bindings die termostabiliteit van 'n spesifieke proteïen verhoog sodat dit beter sou wees vir gebruik in PCR of selfs beter as 'n protease-gebaseerde vlekverwyderaar in wasmiddel?

    6. Isolasie van cDNA's beteken dat die in vivo funksie van 'n proteïen getoets kan word deur 'n wye verskeidenheid benaderings te gebruik. 'n Proteïen kan óf ooruitgedruk word óf sy uitdrukking kan verminder word óf die funksie van 'n proteïen kan op 'n aantal verskillende maniere verander word.

    • Miskien is die eenvoudigste benadering om 'n anti-sinvolgorde vir 'n spesifieke cDNA te ontwerp deur gebruik te maak van óf normale DNA óf fosothionaat basisse wat relatief meer stabiel is vir hidrolise. Byvoeging van antisense kan in sommige gevalle die uitdrukking van 'n proteïen verminder wat 'n toets van proteïenfunksie in 'n spesifieke sisteem moontlik maak.
    • Nog 'n kragtige benadering is om kort rye van RNA (RNAi of siRNA) te gebruik om die degradasie van die RNA wat vir 'n proteïen van belang kodeer, te bevorder.
    • Net so kan cDNA's 'n manier bied om die geen wat die mRNA produseer, te wysig. Homoloë rekombinasie bied 'n weg waarin enige geen van belang ontwrig of selfs voorwaardelik ontwrig kan word (elders bespreek). Studie van die eienskap van so 'n mutante organisme is 'n kragtige manier om die funksie van 'n bepaalde geen te bepaal. Sien uitklop en inklop .
    • 'n Geen kan óf in 'n sellyn óf in 'n organisme ooruitgedruk word. Die bekendstelling van 'n geen onder 'n bepaalde promotor in die kiemlyn laat voortplanting van 'n organisme toe wat 'n bepaalde geen verkeerd uitdruk of selfs voorwaardelik verkeerd uitdruk. Sulke transgene is weer 'n uiters kragtige manier om werklike biologiese funksie te bepaal.
    • Indien daar voldoende kennis is van die struktuur-funksie-verwantskappe van 'n proteïen, is dit soms moontlik om biologiese funksie te ontwrig sonder om met die uitdrukking van die endogene gene in te meng. Dikwels is dit moontlik om 'n gemodifiseerde proteïen te ontwerp wat, wanneer dit uitgedruk word, op 'n dominante wyse met die funksie van die endogene geen inmeng. Byvoorbeeld, uitdrukking van mutante vorms van die regulatoriese subeenheid van die cAMP-afhanklike proteïenkinase meng in met die funksie van die wildtipe regulatoriese subeenhede in 'n sel. Hierdie interferensie is te wyte aan die feit dat die kinase normaalweg saamgestel is uit 2 regulatoriese en 2 katalitiese subeenhede. As daar 'n ooruitdrukking is van 'n mutante regulatoriese vorm wat nie cAMP bind nie, dan is dit voldoende om die aktiwiteit van enige kinase molekule wat selfs 'n enkele regulatoriese subeenheid inkorporeer heeltemal te ontwrig. Net so, ooruitdrukking van mutante vorme van seinmolekules soos ras wat so gewysig is dat hulle nie 'n sein kan oordra nie, maar voldoende inheemse struktuur behou sodat hulle seininligting kan ontvang, kan help om die rol van ras of verwante molekules in 'n seinpad te bepaal. Dit word dikwels 'n dominante negatiewe benadering* genoem.

    Dus, die beskikbaarheid van cDNA-klone bring baie van die logiese benaderings van klassieke genetika na die molekulêre bioloog en laat kritiese toetse van in vivo-funksie toe wat andersins nie moontlik sou wees nie.

    cDNA's en eksperimentele ontwerp

    Die moeite gedoen om 'n cDNA te isoleer en te karakteriseer word goed beloon deur die groot aantal gebruike wat van so 'n reagens gemaak kan word.

    1. Die mees voor die hand liggende gebruik van 'n cDNA is om uitdrukking van mRNA te bestudeer. Dit kan gedoen word deur noordelike analise, deur RNase-beskermingstoets, deur PCR-gebaseerde opsporing, of deur in situ hibridisasie. Om mRNA's deur noordelike analise* op te spoor, moet mRNA's voorberei en gefraksioneer word deur gelelektroforese om mRNA's van verskillende molekulêre gewig te skei. Die RNA op die jel kan dan oorgedra word na nitrosellulose en opgespoor word deur hibridisasie met 'n gemerkte cDNA. Etiket word oor die algemeen in cDNA's geïnkorporeer deur primer-verlenging met behulp van 'n ewekansige seleksie van oligonukleotied-heksemere. Hierdie tegniek het die vermoë om mRNA's van verskillende molekulêre gewigte te onderskei en kan dus alternatiewelik gesplitste produkte openbaar. RT-PCR* word gereeld gekies omdat dit 'n meer sensitiewe metode is om mRNA's te identifiseer. In hierdie tegniek word 'n sonde gegenereer deur 'n vektor te gebruik wat 'n promotor vir 'n RNA-polimerase inkorporeer. Hierdie promotor kan dan 'n hoë spesifieke aktiwiteit RNA in vitro transkribeer, waarvan 'n deel ontwerp kan word om homoloog te wees aan enige cDNA. Hierdie gesintetiseerde RNA is natuurlik uiters sensitief vir ribonuklease-behandeling, maar as dit gehibridiseer word met 'n preparaat van mRNA wat 'n komplementêre volgorde insluit, sal 'n baster gevorm word en dit sal die RNA bestand teen RNase-vertering maak. In sommige gevalle kan die hoeveelheid beskermde RNA direk gemeet word, maar dit kan ook op gels gefraksioneer word om die molekulêre gewig van die beskermde spesie te bepaal. Nog 'n nuttige benadering is om voordeel te trek uit volgorde-inligting en RT-PCR* (omgekeerde transkripsie-polimerase kettingreaksie) te gebruik. In hierdie benadering word mRNA geïsoleer, omgekeerd getranskribeer om 'n komplementêre DNA te genereer, en hierdie komplementêre DNA word dan geamplifiseer deur gebruik te maak van PCR-inleiders. Weereens is dit 'n sensitiewe metode om mRNA op te spoor, maar sorg word vereis om kwantitatiewe aansprake te maak oor die hoeveelheid mRNA wat in verskeie monsters teenwoordig is. Laastens kan hibridisasie in vaste weefsels uitgevoer word om te bepaal watter seltipes mRNA uitdruk. Weereens kan mRNA opgespoor word op grond van sy hibridisering met 'n gemerkte sonde. Alternatiewelik kan 'n gewysigde RT-PCR protokol ook in situ gedoen word. Al hierdie metodes het dus die vermoë om mRNA-oorvloed en veranderinge in mRNA tussen verskeie seltipes op te spoor in reaksie op ontwikkeling, en in reaksie op hormone of ander seinmolekules.

    2. Die volgorde van 'n mRNA is die vinnigste en mees betroubare manier om die volgorde van die gekodeerde proteïen te identifiseer. Die volgorde van 'n gekloonde DNA kan relatief vinnig bepaal word deur óf Maxam-Gilbert Sequencing * óf Sanger Sequencing *. Met die vinnig groeiende DNS-databasis en die waardering van hoe spesifieke aminosuurvolgordes gebruik kan word om bepaalde domeine in proteïene te definieer, kan die volgorde-inligting uiters winsgewend gebruik word. Byvoorbeeld, die volgorde van 'n proteïen kan gebruik word om die waarskynlikheid te bepaal dat spesifieke streke van 'n proteïen 'n alfa-heliks-konfigurasie sal aanneem. Net so word bepaalde rye geassosieer met bepaalde funksies of spesifieke strukture. Die sinkvingermotief is 'n spesifieke proteïenstruktuur wat sinkatome met hoë affiniteit kan bind en hierdie struktuur word gereeld in DNA-bindende proteïene aangetref. Net so word die heliks-lus-heliksstruktuur wat twee alfa-heliks insluit wat deur 'n lus verbind is, gereeld in transkripsiefaktore gevind. Die katalitiese triade is 'n volgorde van 3 aminosure wat in baie proteases voorkom. Proteïenvolgorde sal ook die teenwoordigheid van spesifieke plekke vir post-translasionele modifikasie openbaar. Die volgordes vir byvoeging van koolhidrate, vetsure of fosfaatgroepe is redelik goed bewaar en die teenwoordigheid van hierdie volgordes is 'n sterk aanduiding van die post-translasionele modifikasie van 'n proteïen. As alfa-helikse voorspel word en 'n hoë konsentrasie hidrofobiese groepe op hul oppervlak toon, is dit 'n sterk aanduiding dat proteïen 'n transmembraansegment kan hê. 'n Herhaalde patroon van so 'n motief word in baie seinmolekules gevind. Byvoorbeeld, die klassieke sewe transmembraanpatroon wat oorspronklik in bakteriese rodopsien gevind is, is ook teenwoordig in baie sel-oppervlak reseptore. Natuurlik moet enige voorspelling wat gemaak word op grond van aminosuurvolgorde bevestig word, maar primêre volgorde is dikwels 'n kragtige aanduiding van watter eksperimente gedoen moet word.

    3. Die beskikbaarheid van 'n cDNA-kloon laat toe dat die proteïen in 'n verskeidenheid kontekste uitgedruk word. 'n cDNA kan vir verskillende doeleindes in 'n verskeidenheid uitdrukkingsvektore ingevoeg word. Miskien is die mees voor die hand liggende gebruik van so 'n benadering om uitdrukkings tot uiters hoë vlakke te dryf. Dit produseer 'n ryk bron van proteïen wat die moeilikheid van proteïensuiwering aansienlik vergemaklik. Dit kan oorvloedige voorraad proteïen beskikbaar stel vir fisiologiese toetsing of gebruik as 'n reagens. 'n Meer opvallende gebruik van uitdrukkingsisteem was in die vermoë om mutante proteïene uit te druk. Aangesien dit moontlik is om DNA-volgordes in wese na goeddunke te muteer, is dit moontlik om nie net die wilde tipe proteïene uit te druk nie, maar ook verwante proteïene wat spesifieke mutasies het. Hierdie mutasies, indien goed ontwerp, kan gebruik word om bepaalde struktuur-funksie verwantskappe binne 'n proteïen te toets. Hulle kan bepaal of 'n spesifieke oorblyfsel belangrik is vir katalitiese aktiwiteit of vir assosiasie met 'n ander proteïen. Op 'n verwante en meer praktiese manier kan proteïene vir spesifieke gebruike aangepas word. Mens kan disulfiedbindings inkorporeer om die termiese stabiliteit van proteïene wat industriële en kommersiële toepassings het, te verhoog. Reagense wat in molekulêre toepassings gebruik word, kan aangepas word sodat ongewenste aktiwiteite onderdruk word. Byvoorbeeld, nuklease-aktiwiteite kan gedissosieer word van polimerase-aktiwiteite in DNA-plolimerases. Een van die interessantste voorbeelde van die uitdrukking van mutante proteïene kan gevind word in die ontwerp van dominante negatiewe mutant van 'n proteïen wat kan inmeng met die aktiwiteit van 'n endogene proteïen. Byvoorbeeld, as dit moontlik is om die DNA-bindende domein en die RNA-polimerase-aktiverende domein van 'n transkripsiefaktor te skei, kan daar verwag word dat uitdrukking van die DNA-bindende domein in die afwesigheid van die aktiveerdomein met die aktiwiteit van die endogene inmeng. domein. Baie proteïene funksioneer as 'n multimere, dus uitdrukking van 'n mutante proteïen kan dikwels inmeng met die aktiwiteit van 'n endogene proteïen deur inmenging met proteïen-proteïen dimerisasie. Hierdie strategie was uiters nuttig in die studie van spesifieke transkripsiefaktore. Net so vereis intrasellulêre sein opeenvolgende interaksies van 'n reeks proteïene. Uitdrukking van 'n mutante proteïen wat in wisselwerking kan tree met een lid van die kaskade, maar nie die daaropvolgende stroomaf lede nie, kan inmeng met die funksie van endogene proteïen.Hierdie strategie is baie winsgewend gebruik deur die maak van afgeknotte mutante van reseptore wat slegs die ekstrasellulêre maar nie die intrasellulêre domein van 'n proteïen uitdruk nie of deur mutante weergawe van ras of ander GTP-bindende proteïene uit te druk wat die sein binne die sel oordra.

    4. Die beskikbaarheid van mRNA-volgorde maak ook die moontlikheid oop om 'n genetiese benadering te volg om proteïenfunksie te verstaan. In baie gevalle kan uitdrukking van 'n antisense oligonukleotied * of die teenwoordigheid van 'n hoë konsentrasie sintetiese anti-sin oligonukleotiede die translasie van 'n endogene mRNA onderdruk, wat lei tot 'n sel wat uitgeput is van 'n proteïen van belang. Ontleding van so 'n sel of weefsel kan help om die funksie van 'n proteïen in vivo vas te stel. Net so kan inligting oor die volgorde van 'n cDNA of die geen wat dit kodeer, gebruik word om 'n strategie te ontwikkel om die geen wat vir die c-DNA kodeer, te ontwrig of te wysig. Deur homoloë rekombinasie te gebruik, is dit moontlik om óf die uitdrukking van 'n geen te ontwrig en uit te skakel óf om die uitdrukking van 'n veranderde geenproduk af te dwing.

    6. Dit is ook moontlik om die effek van 'n gedwonge uitdrukking van enige geenproduk in enige weefsel van belang te bestudeer. Deur voordeel te trek uit die begrip van 'n bepaalde promotor-elemente (bespreek op 'n ander bladsy) wat benodig word vir die uitdrukking van 'n proteïen in 'n spesifieke weefsel op 'n spesifieke tyd, is dit moontlik om 'n geen of 'n hibriede geen te maak wat enige proteïen van belang uitdruk . Dit is dus moontlik om die effek te bepaal, byvoorbeeld van ooruitdrukking van 'n neuropeptiedgeen op neurale ontwikkeling of die vorming van 'n spesifieke verbinding in die senuweestelsel. Dit is moontlik om te bepaal of die uitdrukking van 'n wilde tipe of 'n dominante negatiewe vorm van 'n proteïen kan inmeng met enige ontwikkelingsproses of kan lei tot die ontwikkeling van bekende siektes. Met die ontwikkeling van gereguleerde uitdrukkingsvektore is dit moontlik om die uitdrukking van proteïene te beheer deur klein molekules soos tetrasiklien te gebruik (sien tTA* )

    7. Soos ons hierbo opgemerk het, is dit ook moontlik om voordeel te trek uit cDNA-volgordes om homoloë gene te isoleer. Deur gebruik te maak van óf lae-stringensie-hibridisasie óf 'n PKR-benadering gebaseer op kennis van bewaarde streke van gene, is dit dikwels moontlik om addisionele gene te identifiseer wat lede van die familie is en dalk biologies belangrik is in die afwesigheid van enige kennis van hul funksie.

    8. Om die cDNA-volgorde van 'n proteïen te ken sal dikwels die ontwikkeling van teenliggaampies en monoklonale teenliggaampies fasiliteer. Die eenvoudigste, 'n ooruitgedrukte proteïen kan gesuiwer word en as 'n antigeen gebruik word. Alternatiewelik kan noukeurige oorweging van 'n cDNA-volgorde en die waarskynlike struktuur van die gekodeerde proteïen gebruik word om peptiede te ontwerp wat as antigene vir die produksie van óf poliklonale óf monoklonale teenliggaampies gebruik kan word, en dit sal bespreek word in die bladsy wat aan teenliggaampies gewy is * .

    9. Laastens kan 'n cDNA-volgorde as 'n sonde gebruik word om genomiese biblioteke te sift en die geen wat vir 'n spesifieke cDNA kodeer, te isoleer. Dit is 'n uiters waardevolle benadering, want dit bied 'n brug tussen cDNA-kloning en klassieke genetiese analise. Sodra die geen vir 'n cDNA gekarteer is, kan dit getoets word vir sy assosiasie met 'n spesifieke ontwikkelings- of siektefenotipes. Dit is moontlik om klassieke genetiese benaderings te gebruik om te bepaal of mutasies in 'n spesifieke geen saam-segregeer met veranderinge in die geen of sy cDNA.

    Ten slotte, die beskikbaarheid van 'n cDNA maak so 'n wye verskeidenheid eksperimentele benaderings oop en cDNA-kloning is so 'n kragtige tegnologie, dat die isolering van 'n cDNA oorweeg moet word, ongeag die uiteindelike eksperimentele doelwit.


    OEFENVRAE

    A) bevat in die presiese volgorde van hul nukleotiede die inligting vir die bepaling van die aminosuurvolgorde, en
    vandaar die struktuur en funksie, van alle proteïene van 'n sel.

    B) is kritieke funksionele komponente van die sellulêre makromolekulêre fabrieke wat aminosure selekteer en hulle in die korrekte volgorde belyn soos 'n polipeptiedketting gesintetiseer word.

    C) 'n aantal fundamentele chemiese reaksies in selle te kataliseer, insluitend die vorming van peptiedbindings tussen aminosure tydens proteïensintese.

    D) reguleer die uitdrukking van gene.

    A) DNA-string het inherente polariteit wat bepaal word deur die ligging van die vrye fosfaatgroep en die vrye deoksiribose-hidroksielgroep.

    B) Aangrensende nukleotiede word verbind deur fosfoesterbindings wat 3'- en 5'-koolstowwe verbind.

    C) Die DNA-dubbelheliks word gebou deur waterstofbindingskomplementariteit tussen stikstofbasisse.

    RNA bestaan ​​uitsluitlik as 'n enkelstrengige polimeer, terwyl DNA 'n dubbelstrengs heliks is.

    Die ekstra hidroksielgroep op ribose kan as 'n nukleofiel optree wat fosfodiesterbindings aanval en dus RNA-polimere hidroliseer.

    Die smelttemperatuur van 'n DNS-string is 'n funksie van die aantal waterstofbindings tussen basisse.

    A) Oordrag-RNA het 'n komplekse sekondêre struktuur wat nodig is vir sy adapterfunksie.

    B) Boodskapper-RNA is die volopste RNA in die sel.

    C) Ribosomale RNA funksioneer katalities in translasie.

    A) oorgeërfde mutasies in gene wat nodig is vir homoloë rekombinasie is verantwoordelik vir sommige familie kankers.

    B) Homoloë rekombinasie kan gebruik word om ineengestorte rekombinasievurke en dubbele draadbreuke te herstel.

    Homoloë rekombinasie is 'n hoogs fout-geneigde herstelpad.

    Spesifisiteit van siRNAs hang af van cDNA-probe

    Selbehandeling Aantal virusse/ml
    Beheer 1 X10^7
    siRNA-p24 3 X10^6
    siRNA-p25 2 X10^6
    siRNA-p24 + siRNA-p251X10^4
    siRNA na virale proteïen 1X10^2

    siRNA-p24 is die doeltreffendste om die aantal virusse te verminder

    siRNA-p25 is die doeltreffendste om die aantal virusse te verminder

    siRNA-p24 + siRNA-p25 is die doeltreffendste om die aantal virusse te verminder

    in lewerweefsel is die verwydering van p24-funksie alleen voldoende om infeksie te voorkom

    in longweefsel is die verwydering van p25-funksie alleen voldoende om infeksie te voorkom.


    DNA-volgordebepaling

    DNA-volgordebepaling is tipies die eerste stap om die genetiese samestelling van 'n organisme te verstaan, wat help om:

    • Vind regulatoriese en geenvolgordes
    • Vergelyk homoloë gene oor spesies heen
    • Identifiseer mutasies

    Volgordebepaling gebruik biochemiese metodes om die volgorde van nukleotiedbasisse (adenien, guanien, sitosien en timien) in 'n DNA-oligonukleotied te bepaal. Om die volgorde van 'n spesifieke geen te ken, sal help met verdere ontleding om die funksie van die geen te verstaan. PCR word gebruik om die geen van belang te amplifiseer voordat volgordebepaling uitgevoer kan word. Baie biotegnologie-maatskappye bied opeenvolgingsinstrumente aan, maar hierdie instrumente kan duur wees. As gevolg hiervan, voer baie navorsers gewoonlik PCR in-huis uit en stuur dan hul monsters na volgordebepalingslaboratoriums.


    Isoleer geen van belang uit 'n groot string DNA - Biologie

    Abstrak

    Die term siekte verwys breedweg na enige toestand wat normale funksie benadeel, en word dus geassosieer met disfunksie van normale homeostase. Wanneer die funksionering van een of meer organe of stelsels van die liggaam nadelig beïnvloed word, gekenmerk deur verskeie tekens en simptome, sê ons dat ons nie gesond is nie, dit wil sê ons het 'n siekte.

    Gesondheid kan gedefinieer word as 'n toestand van volledige fisiese, geestelike en sosiale welstand. Wanneer mense gesond is, is hulle meer doeltreffend by die werk. Dit verhoog produktiwiteit en bring ekonomiese welvaart. Gesondheid verhoog ook die lang lewe van mense en verminder baba- en moedersterftes.

    Op grond van die oorsaak kan siektes breedweg geklassifiseer word as:

    Infeksies

    Dit is siektes wat veroorsaak word as gevolg van indringing van 'n vreemde parasitiese organisme. Hulle is tydelik omdat die immuunstelsel van organismes sulke patogene (siekteveroorsakende organismes) tot 'n sekere mate kan beveg en dus help om die siekte te voorkom. Die immuunstelsel kan ook aangehelp word met die gebruik van verskeie middels. Benewens maklike behandeling kan hulle ook maklik voorkom word

    Lewenstyl Siektes

    Lewenstylsiektes (ook soms genoem siektes van lang lewe of siektes van die beskawing uitruilbaar) is siektes wat blykbaar in frekwensie toeneem namate lande meer geïndustrialiseer word en mense langer leef. Dit kan Alzheimer se siekte, asma en vetsug insluit. Dieet en leefstyl is belangrike faktore wat vermoedelik vatbaarheid vir baie siektes beïnvloed. Dwelmmisbruik, tabakrook en alkoholgebruik, sowel as 'n gebrek aan oefening, kan ook die risiko verhoog om sekere siektes te ontwikkel, veral later in die lewe. Hierdie siektes kan heeltemal voorkom word deur 'n gesonde leefstyl te lei.

    Genetiese afwykings

    'n Genetiese afwyking is 'n siekte wat veroorsaak word deur een of meer abnormaliteite in die genoom, veral 'n toestand wat vanaf geboorte teenwoordig is (aangebore). Hulle is mediese afwykings wat verband hou met geenmutasie. Genetiese afwykings is oorerflik en word van die ouers se gene oorgedra. Ander defekte kan veroorsaak word deur nuwe mutasies of veranderinge aan die DNA. In sulke gevalle sal die gebrek slegs oorerflik wees as dit in die kiemlyn voorkom. Dieselfde siekte, soos sommige vorme van kanker, kan veroorsaak word deur 'n oorgeërfde genetiese toestand in sommige mense, deur nuwe mutasies in ander mense, en deur nie-genetiese oorsake in nog ander mense. Hierdie siektes is heeltemal lukraak en moeilik om te voorkom aangesien dit nie deur eksterne agente veroorsaak word nie. Omdat hul oorsaak ook in die genoom van die organisme lê, is hul genesing onmoontlik geag totdat die deurbraaknavorsing wat die geheime van DNA ontsluit het wat gelei het tot die ontwikkeling van biotegnologie en dus geenterapie.

    Geenterapie

    Ons kan aan 'n mediese toestand of siekte dink as 'n " gebreekte venster." Baie mediese toestande spruit uit gebreke, of mutasies, in een of meer van 'n persoon se gene. Mutasies veroorsaak dat die proteïen wat deur daardie geen gekodeer word, wanfunksioneer. Wanneer 'n proteïen wanfunksioneer, kan selle wat op daardie proteïen se funksie staatmaak, nie normaal optree nie, wat probleme vir hele weefsels of organe veroorsaak. Mediese toestande wat verband hou met geenmutasies word genetiese afwykings genoem.

    Dus, as 'n gebrekkige geen ons " gebreekte venster" veroorsaak het," kan ons dit " regmaak"? Wat is ons opsies?

    1. Bly stil: ignoreer die genetiese afwyking en niks word reggemaak nie.

    2. Probeer om die afwyking met dwelms of ander benaderings te behandel: afhangende van die afwyking, kan behandeling 'n goeie langtermynoplossing wees of nie.

    3. Plaas 'n normale, funksionele kopie van die geen: as jy dit kan doen, kan dit dalk die probleem oplos!

    As dit suksesvol is, bied geenterapie 'n manier om 'n probleem by die bron daarvan op te los. Deur 'n gekorrigeerde kopie van die geen by te voeg, kan die geaffekteerde selle, weefsels en organe behoorlik werk. Geenterapie verskil van tradisionele medisyne-gebaseerde benaderings, wat die probleem kan behandel, maar wat nie die onderliggende genetiese fout herstel nie.

    Teikens vir geenterapie

    Maar nou ontstaan ​​'n vraag, watter afwykings of siektes kan ons teiken met behulp van geenterapie? Baie afwykings of mediese toestande kan met geenterapie behandel word, maar ander is dalk nie geskik vir hierdie benadering nie. Vir 'n siekte om deur geenterapie geteiken te word, moet dit aan die volgende voorwaardes voldoen:

    1. Die toestand moet voortspruit uit mutasies in een of meer gene

    2. Om 'n genetiese gebrek te behandel, is die kennis van watter geen(ne) om na te streef absoluut noodsaaklik. Ook 'n DNS-kopie van daardie geen beskikbaar in die laboratorium. Die beste kandidate vir geenterapie is die sogenaamde "enkelgeen" afwykings - wat deur mutasies in slegs een geen veroorsaak word.

    3. Om die beste moontlike benadering te ontwerp, word kennis vereis oor hoe die geen in die afwyking inwerk. Byvoorbeeld:

     Watter weefsels word aangetas?

     Watter rol speel die proteïen wat deur die geen gekodeer word binne die selle van daardie weefsel?

     Presies hoe beïnvloed mutasies in die geen die proteïen se funksie?

    4. Die byvoeging van 'n normale kopie van die geen behoort die probleem in die aangetaste weefsel op te los. Dit lyk dalk of dit vanselfsprekend is, maar dit is nie. Wat as die gemuteerde geen 'n proteïen kodeer wat verhoed dat die normale proteïen sy werk doen? Gemuteerde gene wat op hierdie manier funksioneer, word dominant negatief genoem en die byvoeging van die normale proteïen sal nie die probleem oplos nie.

    5. Die geenlewering aan selle van die aangetaste weefsel moet moontlik wees. Dit hang af van:

     Hoe toeganklik is die weefsel? Is dit redelik maklik (vel, bloed of longe), of moeiliker om te bereik (interne organe)?

     Wat is die beste manier van aflewering?

    Die tegnieke van biotegnologie het dit moontlik gemaak om die vereiste geen in die laboratorium te isoleer en ook die geen af ​​te lewer.

    Isolasie van geen van belang

    Die eerste stap is om die geen wat in die geneties gemodifiseerde organisme ingevoeg sal word, te vind en te isoleer. Om die regte geen te vind om in te voeg, berus gewoonlik op jare se wetenskaplike navorsing oor die identiteit en funksie van nuttige gene. Sodra dit bekend is, moet die DNA op spesifieke plekke gesny word om die geen van belang te isoleer. Dit kan gedoen word deur gebruik te maak van beperkingsensieme, ook bekend as molekulêre skêr, wat DNS sny op spesifieke plekke wat palindromiese DNS-volgordes bevat. Maar om die DNA met beperkingsensieme te sny, moet dit in suiwer vorm wees, vry van ander makro-molekules.

    Isolasie van DNA

    Aangesien die DNA binne die membrane ingesluit is, moet ons die sel oopbreek om DNA saam met ander makromolekules soos RNA, proteïene, polisakkariede en ook lipiede vry te stel. Dit kan bereik word deur die bakteriële selle/plant- of dierweefsel te behandel met ensieme soos lisosiem (bakterieë), sellulase (plantselle), chitinase (swam). Gene is geleë op lang DNA-molekules wat met proteïene soos histone verweef is. Die RNA kan verwyder word deur behandeling met ribonuklease terwyl proteïene verwyder kan word deur behandeling met protease. Ander molekules kan verwyder word deur toepaslike behandelings en gesuiwerde DNA presipiteer uiteindelik uit na die byvoeging van verkoelde etanol. Dit kan gesien word as versameling van fyn drade in die skorsing.

    Sny van DNA

    Beperkingsensiemverterings word uitgevoer deur gesuiwerde DNA-molekules met die beperkingsensiem te inkubeer, by die optimale toestande vir daardie spesifieke ensiem. Die sny van DNA deur beperking endonukleases lei tot die fragmente van DNA. Hierdie fragmente kan geskei word deur 'n tegniek bekend as gelelektroforese. Aangesien DNA-fragmente negatief gelaaide molekules is, kan hulle geskei word deur hulle te dwing om na die anode te beweeg onder 'n elektriese veld deur 'n medium/matriks. Die geskeide DNS-bande word vir die vereiste geen ontleed en dan word dit uit die agarosegel uitgesny en uit die gelstuk onttrek. Hierdie stap staan ​​bekend as eluering.

    Vermenigvuldiging van geen (PCR)

    PCR of polimerase kettingreaksie word dan gebruik om veelvuldige kopieë van die geen van belang te skep. In hierdie reaksie word veelvuldige kopieë van die geen (of DNS) van belang in vitro gesintetiseer deur gebruik te maak van twee stelle primers (klein chemies gesintetiseerde oligonukleotiede wat komplementêr is tot die streke van DNS) en die ensiem DNS-polimerase. Die ensiem brei die primers uit deur die nukleotiede wat in die reaksie voorsien word en die genomiese DNA as templaat te gebruik. As die proses van replikasie van DNA baie keer herhaal word, kan die segment van DNA tot ongeveer biljoen keer geamplifiseer word, dit wil sê, 1 biljoen kopieë word gemaak.

    Gene Targeting

    Geenlewering is een van die grootste uitdagings op die gebied van geenterapie.

    1. TEKEN die regte selle.

    2. AKTIVEERING van die geen. ’n Geen se reis is nie verby wanneer dit die sel binnegaan nie. Dit moet na die sel se kern gaan en " aangeskakel" word, wat beteken dat die transkripsie en translasie daarvan geaktiveer word om die proteïenproduk te produseer wat deur die geen gekodeer word. Vir geenlewering om suksesvol te wees, moet die proteïen wat geproduseer word behoorlik funksioneer.

    3. INTEGRATERING van die geen in die selle. Die geen moet bly sit en aanhou werk in die teikenselle. Indien wel, moet verseker word dat die geen integreer in, of deel word van die gasheersel se genetiese materiaal, of dat die geen 'n ander manier vind om in die kern te oorleef sonder om verwerp te word.

    4. VERMY skadelike newe-effekte. Elke keer wanneer 'n onbekende biologiese stof in die liggaam ingebring word, is daar 'n risiko dat dit giftig sal wees of dat die liggaam 'n immuunreaksie daarteen sal opdoen. As die liggaam immuniteit teen 'n spesifieke geen-afleweringsvoertuig ontwikkel, sal toekomstige rondes van die terapie ondoeltreffend wees.

    Die keuse van die beste vektor

    Daar is geen "perfekte vektor" wat elke versteuring kan behandel nie. Soos enige tipe mediese behandeling, moet 'n geenterapie-vektor aangepas word om die unieke kenmerke van die versteuring aan te spreek. Ons het die les geleer om gene na plante en diere oor te dra vanaf bakterieë en virusse, wat dit al eeue lank weet en hoe om gene te lewer om eukariotiese selle te transformeer en hulle te dwing om te doen wat die bakterieë of virusse wil hê.

    Deel van die uitdaging in geenterapie is om die mees geskikte vektor vir die behandeling van die afwyking te kies. Sommige vektore wat algemeen gebruik word, is:

    Virusse

    Gewoonlik as ons aan virusse dink, dink ons ​​daaraan wat siektes soos verkoue, griep en MIV/VIGS veroorsaak. Toe hulle te kampe het met die probleem van geenlewering, het wetenskaplikes na virusse gekyk. Hoekom die wiel herontdek as daar 'n goeie een daar buite is? As ons virusse kan verander om gene te lewer sonder om mense siek te maak, kan ons 'n goeie stel geenterapie-instrumente hê.

    Algemene voordele van virale vektore:

    -Hulle is baie goed om selle te teiken en binne te gaan.

     -Sommige virale vektore kan ontwerp word om spesifieke tipes selle te teiken.

     -Hulle kan gewysig word sodat hulle nie die sel kan repliseer en vernietig nie.

    Algemene nadele van virale vektore:

     'n Virus kan nie " uitbrei" om 'n stuk genetiese materiaal te pas wat groter is as wat dit natuurlik gebou is om te dra nie. Daarom kan sommige gene te groot wees om by 'n sekere tipe virus in te pas.
     Virusse kan immuunreaksies by pasiënte veroorsaak, wat tot twee potensiële uitkomste lei:

     'n Pasiënt se immuniteit teen 'n virus kan hom verhoed om op herhaalde behandelings te reageer.

    Moderne virale vektore is egter ontwerp sonder die meeste van die proteïene wat 'n immuunrespons sou veroorsaak.

    Nie-virale vektore

    Alhoewel virusse genetiese materiaal effektief in 'n pasiënt se selle kan lewer, het hulle 'n paar beperkings. Dit is soms meer doeltreffend om 'n geen af ​​te lewer deur 'n nie-virale vektor te gebruik, wat minder groottebeperkings het en wat nie 'n immuunrespons sal genereer nie.

    Nie-virale vektore is tipies sirkelvormige DNA-molekules, ook bekend as plasmiede. In die natuur gebruik bakterieë plasmiede om gene van sel na sel oor te dra.

    Wetenskaplikes gebruik bakterieë en plasmiede om gene van belang van enige organisme maklik en doeltreffend te berg en te repliseer.

    Vektore wat tans gebruik word, is so ontwerp dat hulle maklike koppeling van vreemde DNA en seleksie van rekombinante van nie-rekombinante help.

    Dit is nie die enigste manier om uitheemse DNA in gasheerselle in te voer nie. In 'n metode bekend as mikro-inspuiting, word rekombinante DNA direk in die kern van 'n diersel ingespuit. In 'n ander metode, geskik vir plante, word selle gebombardeer met hoë snelheid mikro-deeltjies van goud of wolfraam wat met DNA bedek is in 'n metode wat bekend staan ​​as biolistiek of geengeweer.

    Sistiese fibrose

    Sistiese fibrose (CF), ook bekend as mukoviscidose, is 'n outosomale resessiewe genetiese afwyking wat die longe, en ook die pankreas, lewer en derm die kritiesste affekteer. Dit word gekenmerk deur abnormale vervoer van chloried en natrium oor 'n epiteel, wat lei tot dik, viskeuse afskeidings, wat verhoed dat die silia puin skoonmaak wat simptome soos hoes, swak spysvertering en verhoogde kwesbaarheid vir infeksie veroorsaak.

    CF word veroorsaak deur 'n mutasie in die geen vir die proteïen sistiese fibrose transmembraangeleidingreguleerder (CFTR) geen op chromosoom 7. Mees algemeen is die mutasie in die CFTR geen 'n drie-basis-paar delesie. Hierdie proteïen is nodig om die komponente van sweet, spysverteringsvloeistowwe en slym te reguleer. CFTR reguleer die beweging van chloried en natriumione oor epiteelmembrane, soos die alveolêre epiteel wat in die longe geleë is. Aangesien al die selle van 'n CF-pasiënt die gebrekkige proteïen het, bou groot hoeveelhede dik, taai slym regdeur die longe en ander organe op. Dit lei tot die erns van simptome wat by CF-pasiënte gesien word.

    Is dit 'n goeie teiken vir geenterapie?

    Om dit na te gaan moet 'n paar vrae beantwoord word:

     Is die toestand die gevolg van mutasie? Ja.

     Is die biologie van die versteuring bekend? Ja.

     Sal die byvoeging van 'n normale kopie van die geen die probleem in die aangetaste weefsel oplos? Ja. Terwyl die gemuteerde CFTR-geen 'n nie-funksionele ioonkanaalproteïen kodeer, sal dit nie verhoed dat 'n normale CFTR-kanaalproteïen behoorlik werk nie. Daarom behoort die byvoeging van 'n normale kopie van die CFTR-geen die probleem op te los

     Is dit haalbaar om die geen aan die selle van die aangetaste weefsel te lewer? Ja, gedeeltelik. Die behandeling van die longe van pasiënte met CF kan moontlik wees, aangesien die longoppervlaktes aan die lug blootgestel is en ietwat maklik bereikbaar is. Omdat die spysverteringstelsel minder toeganklik is, kan dit egter 'n moeiliker streek wees om te behandel.
    Daarom kan ons tot die gevolgtrekking kom dat dit 'n perfekte siekte is om deur geenterapie behandel te word.

    Uitdagings

    Sommige van die faktore wat geneterapie daarvan weerhou het om 'n doeltreffende behandeling vir genetiese siektes te word, is:

    &bul Kortstondige aard van geenterapie -

    Voordat geenterapie 'n permanente kuur vir enige toestand kan word, moet die terapeutiese DNS wat in teikenselle ingebring word, funksioneel bly en die selle wat die terapeutiese DNS bevat, moet langlewend en stabiel wees. Probleme met die integrasie van terapeutiese DNA in die genoom en die vinnig verdelende aard van baie selle verhoed dat geenterapie enige langtermynvoordele behaal. Pasiënte sal verskeie rondes geenterapie moet ondergaan.

    &bul Immuunreaksie -

    Elke keer wanneer 'n vreemde voorwerp in menslike weefsel ingebring word, is die immuunstelsel ontwerp om die indringer aan te val. Die risiko om die immuunstelsel te stimuleer op 'n manier wat die doeltreffendheid van geenterapie verminder, is altyd 'n potensiële risiko. Verder maak die immuunstelsel se verbeterde reaksie op indringers wat dit al voorheen gesien het dit moeilik vir geenterapie om by pasiënte herhaal te word.

    &bul Probleme met virale vektore -

    Virusse, hoewel die voorkeurdrager in die meeste geenterapiestudies, bied 'n verskeidenheid potensiële probleme aan die pasiënt - toksisiteit, immuun- en inflammatoriese reaksies, en geenbeheer- en teikenkwessies. Daarbenewens is daar altyd die vrees dat die virale vektor, sodra dit binne die pasiënt is, sy vermoë om siekte te veroorsaak, kan herstel.

    &bul Multigene versteurings -

    Toestande of afwykings wat voortspruit uit mutasies in 'n enkele geen is die beste kandidate vir geenterapie. Ongelukkig word sommige van die mees algemene afwykings, soos hartsiektes, hoë bloeddruk, Alzheimer se siekte, artritis en diabetes, veroorsaak deur die gekombineerde uitwerking van variasies in baie gene. Multigene of multifaktoriale afwykings soos hierdie sal veral moeilik wees om effektief te behandel deur gebruik te maak van geenterapie.

    Onlangse Opkomende

    CRISPR

    CRISPR staan ​​vir gegroepeerde, gereeld tussenafstande kort palindromiese herhalings. Hierdie RNA-volgordes dien 'n immuunfunksie in archaea en bakterieë, maar in die laaste jaar of wat het wetenskaplikes hulle aangegryp om gene te herskryf. Die RNA-volgorde dien as 'n gids om 'n DNS-volgorde in byvoorbeeld 'n sigoot of 'n stamsel te teiken. Die gidsvolgorde lei 'n ensiem, Cas9, na die DNS van belang. Cas9 kan die dubbele string sny, dit knip, of selfs geenuitdrukking afbreek. Nadat Cas9 die DNA beseer het, herstel herstelstelsels die volgorde – of nuwe rye kan ingevoeg word.

    Dit is nie die eerste of enigste metode van geenherstelterapie wat ontwikkel is nie, maar die CRISPR-tegnologie, sê Ramesar, is so spesiaal omdat, anders as vorige metodes wat meer moeisaam was en net een soort sel in die liggaam kon teiken, dit blyk 'n "one size fits all delivery" te wees, aanpasbaar vir verskillende weefsels. Die prosedure lyk ook relatief eenvoudig om uit te voer.

    Hoe opwindend die ontwikkeling ook al mag wees, sal CRISPR nog net onmiddellike kure lewer.

    Ramesar sê, uit sy aanvanklike indrukke van die literatuur, dat dit wil voorkom asof gelokaliseerde, toeganklike abnormale weefsel (soos in die retina of vel) makliker geteiken kan word.

    Toestande wat die liggaam meer sistemies affekteer, soos sekere ontwikkelingsindroom of sentrale senuweestelselafwykings, kan egter problematies wees in terme van om die hersteltegnologie in genoeg van die teikenselle in daardie weefsel te kry om 'n effektiewe verskil te maak.

    "Dit kan ook afhang van die stadium wat 'n mens probeer om die terapie uit te voer, in terme van die pasiënt se ouderdom en vlak van vordering van die siekte," sê Ramesar.

    GEVOLGTREKKINGS

    Alhoewel vroeë kliniese mislukkings daartoe gelei het dat baie geenterapie as oorverhitting afgemaak het, het kliniese suksesse sedert 2006 nuwe optimisme in die belofte van geenterapie versterk. Dit sluit in suksesvolle behandeling van pasiënte met die retinale siekte Leber se aangebore amaurose, X-gekoppelde SCID, ADA-SCID, adrenoleukodistrofie, chroniese limfositiese leukemie (CLL), akute limfositiese leukemie (ALL), veelvuldige myeloom, hemofilie en Parkinson se siekte. Hierdie onlangse kliniese suksesse het gelei tot 'n hernieude belangstelling in geenterapie, met verskeie artikels in wetenskaplike en gewilde publikasies wat 'n beroep op volgehoue ​​belegging in die veld doen.


    Die proses van genetiese ingenieurswese

    Genetiese ingenieurswese word wyd gebruik in biologiese navorsing. Muismodelle is ontwerp vir biomediese studies, bakterieë is ontwerp om medikasie soos insulien te produseer, en gewasse is ontwerp vir landbou. Al hierdie produkte van genetiese ingenieurswese is geskep deur dieselfde basiese stappe te gebruik: die identifisering van 'n eienskap van belang, die isolering van daardie genetiese eienskap, die invoeging van daardie eienskap in die genoom van 'n gewenste organisme, en dan die groei van die gemanipuleerde organisme (Figuur 1). Hierdie stappe word hieronder in detail verduidelik, met behulp van voorbeelde van Monsanto, aangesien die besonderhede van hul tegnologieë publiek beskikbaar is. Ander groot maatskappye soos Syngenta, BASF, Dow, Bayer en Du Pont gebruik soortgelyke metodes, soos kortliks uiteengesit op hul onderskeie webwerwe [3, 4, 5, 6, 7].

    Stap 1: Identifiseer 'n eienskap van belangstelling
    Om 'n gewenste nuwe eienskap te identifiseer, kyk wetenskaplikes meestal na die natuur. Suksesvolle ontdekking van 'n nuwe genetiese eienskap van belangstelling is dikwels 'n kombinasie van kritiese denke en geluk. Byvoorbeeld, as navorsers op soek is na 'n eienskap wat 'n gewas in staat sal stel om in 'n spesifieke omgewing te oorleef, sal hulle na organismes soek wat natuurlik in daardie spesifieke omgewing kan oorleef. Of as navorsers daarop gemik is om die voedingsinhoud van 'n gewas te verbeter, sal hulle 'n lys van plante sif wat hulle vermoed 'n voedingstof van belang produseer.

    'n Voorbeeld van 'n eienskap wat tans in GMO's is wat deur hierdie kombinasie van geluk en kritiese denke geïdentifiseer is, is verdraagsaamheid teenoor die onkruiddoder Roundup (sien hierdie artikel). Monsanto het "Roundup Ready"-plante geskep nadat hulle bakterieë gevind het wat naby 'n Roundup-fabriek groei wat 'n geen bevat het wat hulle toegelaat het om in die teenwoordigheid van die onkruiddoder te oorleef [8]. Alhoewel dit nie in die Verenigde State op die mark is nie, het Syngenta Golden Rice ontwerp met 'n verhoogde hoeveelheid pro-vitamien A, wat die menslike liggaam in die vitamien A kan verander (sien hierdie artikel). Navorsers by Syngenta het die geenvolgorde geïdentifiseer wat pro-vitamien A produseer en 'n lys plante saamgestel om met daardie volgorde te sif [9]. Met 'n bietjie geluk was daar 'n plant in die natuur, mielies, wat 'n geen bevat het wat Goue Rys pro-vitamien A sou laat produseer op 'n vlak wat in die voedingsbehoeftes van vitamien A-tekort gemeenskappe kan voorsien.

    Stap 2: Isoleer die genetiese eienskap van belang
    Vergelykende analise word gebruik om te dekodeer watter deel van 'n organisme se genetiese samestelling die eienskap van belang bevat. Die genome van plante met die eienskap word vergelyk met genome in dieselfde spesie sonder die eienskap, met die doel om gene wat slegs in eersgenoemde teenwoordig is te identifiseer [8]. Die genome van verskillende spesies met dieselfde eienskap kan ook vergelyk word om 'n geen te identifiseer, soos die geval was tydens die ontwikkeling van Goue Rys [9]. As daar geen databasis van genetiese inligting vir vergelyking is nie, sal wetenskaplikes doelbewus dele van die genoom van belang uitvee, of "uitslaan", totdat die verlangde eienskap verlore gaan, en sodoende die gene identifiseer wat tot die eienskap lei.

    Om hierdie proses te bespoedig, het Monsanto 'n metode ontwikkel en gepatenteer wat bekend staan ​​as saadversplintering [8]. Deur hierdie metode skeer Monsanto dele van sade af vir hoë-deurset genetiese volgordebepaling terwyl die res van die sade lewensvatbaar gelaat word vir plant. Dit skep 'n genetiese databasis vir plante nog voordat hulle gekweek word, waar 'n strepieskodestelsel gebruik word om plante by hul genotipes te pas. Navorsers kan dan hierdie databasis gebruik om nuwe eienskappe van belang te identifiseer asook om die gewenste eienskappe in 'n gewas te optimaliseer deur te selekteer vir die beste genotipes gebaseer op plantfenotipes.

    Stap 3: Voeg die verlangde genetiese eienskap in 'n nuwe genoom in
    Dit is moeilik om die genoom van plantsade te verander weens hul rigiede struktuur. Baie biotegnologiemaatskappye gebruik "geengewere" wat metaaldeeltjies wat met DNA bedek is in plantweefsel inskiet met 'n .22-kaliber lading [8]. Monsanto gebruik nie meer geengewere nie, maar trek eerder voordeel uit bakterieë, genaamd Agrobacterium tumefaciens, wat natuurlik sade binnedring en plante verander deur stukke van hul eie DNA in 'n plant se genoom in te voeg.

    In biotegnologie-navorsing is dit algemeen om bakterieë geneties te manipuleer om 'n gewenste proteïen te produseer. Dit word gedoen deur ensieme te gebruik om 'n DNS-string van belang te sny en in 'n plasmied te plak, wat 'n klein, sirkelvormige DNA-molekule [10] is. Bakterieë word dan met hitte of elektrisiteit geskok sodat die selle die gemanipuleerde plasmied aanvaar. Deur te wysig A. tumefaciens, wat makliker is om te verander as plantsade self, kan navorsers die bakterieë se natuurlik indringergedrag as 'n Trojaanse perd gebruik om gewenste eienskappe in 'n gewas se genoom in te voeg.

    Stap 4: Kweek die GMO
    Nadat 'n genetiese eienskap suksesvol in 'n organisme se genoom ingevoeg is, moet die gemodifiseerde organisme dan kan groei en repliseer met sy nuutgemanipuleerde genoom. Eerstens moet die genotipe van die organismes nagegaan word sodat navorsers slegs organismes voortplant waarin die genoom korrek aangepas is.

    Biotegnologiemaatskappye belê groot bedrae om hierdie plante aan die lewe te hou en voort te plant sodra hulle suksesvol geskep is. Die maatskappye gebruik spesiale klimaatbeheerde groeikamers, en bioloë kyk dikwels met die hand na die plante om seker te maak dat hulle groei soos verwag [8].

    Tydens hierdie proses sal biotegnologiemaatskappye outomatiese masjiene, soos Monsanto se GenV-planter, gebruik om plante op te spoor en optimale saai- en groeitoestande te bereken om die beste moontlike opbrengste te skep. GMO-sade kom dikwels met instruksies oor spasiëring en voeding wat uit hierdie studies voortspruit.


    Verwante

    Wyss Instituut
    Sentrum vir Lewenswetenskap Bldg.
    3 Blackfan-kring
    Boston, MA 02115
    Kaart en aanwysings


    Inhoud

    Baie verskillende ontdekkings en vooruitgang het gelei tot die ontwikkeling van genetiese ingenieurswese. Mensgerigte genetiese manipulasie het begin met die makmaak van plante en diere deur kunsmatige seleksie in ongeveer 12 000 vC. [1] : 1 Verskeie tegnieke is ontwikkel om te help met teling en seleksie. Hibridisering was een manier waarop vinnige veranderinge in 'n organisme se genetiese samestelling ingebring kon word. Gewashibridisasie het heel waarskynlik die eerste keer plaasgevind toe mense geneties afsonderlike individue van verwante spesies in die nabyheid begin kweek het. [2] : 32 Sommige plante kon deur vegetatiewe kloning voortgeplant word. [2] : 31

    Genetiese oorerwing is vir die eerste keer in 1865 deur Gregor Mendel ontdek, na eksperimente wat ertjies gekruis het. [3] In 1928 het Frederick Griffith die bestaan ​​bewys van 'n "transformerende beginsel" betrokke by oorerwing, wat in 1944 deur Oswald Avery, Colin MacLeod en Maclyn McCarty as DNS geïdentifiseer is. Frederick Sanger het in 1977 'n metode ontwikkel vir die volgordebepaling van DNS, wat die genetiese inligting wat aan navorsers beskikbaar is, aansienlik vergroot het.

    Nadat die bestaan ​​en eienskappe van DNS ontdek is, moes gereedskap ontwikkel word wat dit moontlik gemaak het om te manipuleer. In 1970 het Hamilton Smith se laboratorium beperkingsensieme ontdek, wat wetenskaplikes in staat gestel het om gene van 'n organisme se genoom te isoleer. [4] DNS-ligases, wat gebroke DNS saamvoeg, is vroeër in 1967 ontdek. [5] Deur die twee ensieme te kombineer het dit moontlik geword om DNS-volgordes te "knip en te plak" om rekombinante DNS te skep. Plasmiede, wat in 1952 ontdek is, [6] het belangrike hulpmiddels geword vir die oordrag van inligting tussen selle en die replisering van DNS-volgordes. Polimerase kettingreaksie (PCR), wat in 1983 deur Kary Mullis ontwikkel is, het toegelaat dat klein dele van DNS geamplifiseer (gerepliseer) word en het die identifikasie en isolasie van genetiese materiaal aangehelp.

    Benewens die manipulering van DNS, moes tegnieke ontwikkel word vir die invoeging daarvan in 'n organisme se genoom. Griffith se eksperiment het reeds getoon dat sommige bakterieë die vermoë het om op natuurlike wyse vreemde DNA op te neem en uit te druk. Kunsmatige bevoegdheid is geïnduseer in Escherichia coli in 1970 deur hulle met kalsiumchloriedoplossing (CaCl2). [7] Transformasie deur gebruik te maak van elektroporasie is in die laat 1980's ontwikkel, wat die doeltreffendheid en bakteriese omvang verhoog het. [8] In 1907 'n bakterie wat plantgewasse veroorsaak het, Agrobacterium tumefaciens, ontdek is. In die vroeë 1970's is gevind dat hierdie bakterieë sy DNA in plante ingevoeg het deur 'n Ti-plasmied te gebruik. [9] Deur die gene in die plasmied wat die gewas veroorsaak het te verwyder en nuwe gene by te voeg, kon navorsers plante met A. tumefaciens en laat die bakterieë hul gekose DNA in die genome van die plante invoeg. [10]

    Die eerste stap is om die teikengeen of -gene te identifiseer om in die gasheerorganisme in te voeg. Dit word gedryf deur die doelwit vir die resulterende organisme. In sommige gevalle word slegs een of twee gene aangetas. Vir meer komplekse doelwitte kan hele biosintetiese weë wat veelvuldige gene behels, betrokke wees. Sodra dit gevind is, kan gene en ander genetiese inligting van 'n wye reeks organismes in bakterieë ingevoeg word vir berging en modifikasie, wat in die proses geneties gemodifiseerde bakterieë skep. Bakterieë is goedkoop, maklik om te groei, klonaal, vermeerder vinnig, relatief maklik om te transformeer en kan byna onbepaald by -80 °C geberg word. Sodra 'n geen geïsoleer is, kan dit in die bakterieë gestoor word wat 'n onbeperkte voorraad vir navorsing bied. [11]

    Genetiese siftings kan uitgevoer word om potensiële gene te bepaal, gevolg deur ander toetse om die beste kandidate te identifiseer. ’n Eenvoudige skerm behels die lukraak mutasie van DNA met chemikalieë of bestraling en dan die selektering van dié wat die verlangde eienskap vertoon. Vir organismes waar mutasie nie prakties is nie, soek wetenskaplikes eerder individue onder die bevolking wat die kenmerk deur natuurlik voorkomende mutasies aanbied. Prosesse wat na 'n fenotipe kyk en dan probeer om die geen verantwoordelik te identifiseer, word vorentoe genetika genoem. Die geen moet dan gekarteer word deur die oorerwing van die fenotipe met bekende genetiese merkers te vergelyk. Gene wat naby mekaar is, sal waarskynlik saam geërf word. [12]

    Nog 'n opsie is omgekeerde genetika. Hierdie benadering behels om 'n spesifieke geen met 'n mutasie te teiken en dan waar te neem watter fenotipe ontwikkel. [12] Die mutasie kan ontwerp word om die geen te deaktiveer of slegs onder sekere omstandighede aktief te laat word. Voorwaardelike mutasies is nuttig om gene te identifiseer wat normaalweg dodelik is as dit nie funksioneel is nie. [13] Aangesien gene met soortgelyke funksies soortgelyke volgordes (homoloë) deel, is dit moontlik om die waarskynlike funksie van 'n geen te voorspel deur die volgorde daarvan te vergelyk met dié van goed bestudeerde gene van model-organismes. [12] Die ontwikkeling van mikroskikkings, transkriptome en genoomvolgordebepaling het dit baie makliker gemaak om gewenste gene te vind. [14]

    Die bakterieë Bacillus thuringiensis is die eerste keer in 1901 ontdek as die veroorsakende middel in die dood van sywurms. As gevolg van hierdie insekdodende eienskappe, is die bakterieë gebruik as 'n biologiese insekdoder, wat in 1938 kommersieel ontwikkel is. Die huilproteïene is in 1956 ontdek om die insekdodende aktiwiteit te verskaf, en teen die 1980's het wetenskaplikes die geen wat hierdie proteïen kodeer, suksesvol gekloon en uitgedruk dit in plante. [15] Die geen wat weerstand bied teen die onkruiddoder glifosaat is gevind na sewe jaar se soektog in bakterieë wat in die uitvloeipyp van 'n Monsanto RoundUp-vervaardigingsfasiliteit woon. [16] By diere is die meerderheid gene wat gebruik word, groeihormoongene. [17]

    Alle genetiese ingenieursprosesse behels die modifikasie van DNA. Tradisioneel is DNA uit die selle van organismes geïsoleer. Later het gene uit 'n DNS-segment gekloon na die skepping van 'n DNS-biblioteek of kunsmatig gesintetiseer. Sodra dit geïsoleer is, word addisionele genetiese elemente by die geen gevoeg sodat dit in die gasheerorganisme uitgedruk kan word en om seleksie te help.

    Onttrekking uit selle Wysig

    Eers moet die sel liggies oopgemaak word en die DNA blootstel sonder om te veel skade daaraan te veroorsaak. Die metodes wat gebruik word, wissel na gelang van die tipe sel. Sodra dit oop is, moet die DNA van die ander sellulêre komponente geskei word. 'n Gebarste sel bevat proteïene en ander selafval. Deur te meng met fenol en/of chloroform, gevolg deur sentrifugering, kan die nukleïensure van hierdie puin geskei word in 'n boonste waterfase. Hierdie waterige fase kan verwyder word en verder gesuiwer word indien nodig deur die fenol-chloroform stappe te herhaal. Die nukleïensure kan dan uit die waterige oplossing deur gebruik te maak van etanol of isopropanol gepresipiteer word. Enige RNA kan verwyder word deur 'n ribonuklease by te voeg wat dit sal afbreek. Baie maatskappye verkoop nou kits wat die proses vereenvoudig. [18]

    Gene isolasie Wysig

    Die geen van belang moet van die onttrekte DNA geskei word. As die volgorde nie bekend is nie, is 'n algemene metode om die DNA op te breek met 'n ewekansige verteringmetode. Dit word gewoonlik bewerkstellig deur gebruik te maak van beperkingsensieme (ensieme wat DNA sny). 'n Gedeeltelike beperkingsvertering sny slegs sommige van die beperkingsplekke, wat lei tot oorvleuelende DNA-fragmentsegmente.Die DNA-fragmente word in individuele plasmiedvektore geplaas en in bakterieë gegroei. Sodra dit in die bakterieë is, word die plasmied gekopieer soos die bakterieë verdeel. Om te bepaal of 'n bruikbare geen in 'n bepaalde fragment aanwesig is, word die DNS-biblioteek gekeur vir die gewenste fenotipe. As die fenotipe opgespoor word, is dit moontlik dat die bakterieë die teikengeen bevat.

    As die geen nie 'n waarneembare fenotipe het nie of 'n DNS-biblioteek nie die korrekte geen bevat nie, moet ander metodes gebruik word om dit te isoleer. As die posisie van die geen met behulp van molekulêre merkers bepaal kan word, is chromosoomloop een manier om die korrekte DNA-fragment te isoleer. As die geen noue homologie met 'n bekende geen in 'n ander spesie uitdruk, kan dit geïsoleer word deur te soek vir gene in die biblioteek wat nou ooreenstem met die bekende geen. [19]

    Vir bekende DNS-volgordes kan beperkingsensieme wat die DNS aan weerskante van die geen sny, gebruik word. Gelelektroforese sorteer dan die fragmente volgens lengte. [20] Sommige gels kan rye skei wat met 'n enkele basispaar verskil. Die DNA kan gevisualiseer word deur dit met etidiumbromied te kleur en onder UV-lig te fotografeer. 'n Merker met fragmente van bekende lengtes kan langs die DNA gelê word om die grootte van elke band te skat. Die DNS-band op die regte grootte moet die geen bevat, waar dit uit die jel gesny kan word. [18] : 40–41 Nog 'n tegniek om gene van bekende volgordes te isoleer, behels polimerase kettingreaksie (PCR). [21] PCR is 'n kragtige instrument wat 'n gegewe volgorde kan versterk, wat dan deur middel van gelelektroforese geïsoleer kan word. Die doeltreffendheid daarvan daal met groter gene en dit het die potensiaal om foute in die volgorde in te voer.

    Dit is moontlik om gene kunsmatig te sintetiseer. [22] Sommige sintetiese reekse is kommersieel beskikbaar, met afstand van baie van hierdie vroeë stappe. [23]

    Wysiging Wysig

    Die geen wat ingevoeg moet word, moet met ander genetiese elemente gekombineer word sodat dit behoorlik kan werk. Die geen kan op hierdie stadium gewysig word vir beter uitdrukking of doeltreffendheid. Sowel as die geen wat ingevoeg moet word, bevat die meeste konstrukte 'n promotor- en terminatorgebied sowel as 'n selekteerbare merkergeen. Die promotorstreek inisieer transkripsie van die geen en kan gebruik word om die ligging en vlak van geenuitdrukking te beheer, terwyl die terminatorstreek transkripsie beëindig. 'n Selekteerbare merker, wat in die meeste gevalle antibiotika weerstand verleen aan die organisme waarin dit uitgedruk word, word gebruik om te bepaal watter selle met die nuwe geen getransformeer word. Die konstrukte word gemaak deur gebruik te maak van rekombinante DNA-tegnieke, soos beperkingsverterings, afbindings en molekulêre kloning. [24]

    Sodra die geen gekonstrueer is, moet dit stabiel in die teikenorganismes genoom geïntegreer word of as ekstrachromosomale DNA bestaan. Daar is 'n aantal tegnieke beskikbaar vir die invoeging van die geen in die gasheergenoom en dit wissel na gelang van die tipe organisme wat geteiken word. In meersellige eukariote, as die transgeen in die gasheer se kiemlynselle geïnkorporeer word, kan die resulterende gasheersel die transgeen na sy nageslag oorgee. As die transgeen in somatiese selle geïnkorporeer word, kan die transgeen nie geërf word nie. [25]

    Transformasie wysig

    Transformasie is die direkte verandering van 'n sel se genetiese komponente deur die genetiese materiaal deur die selmembraan te laat beweeg. Ongeveer 1% van bakterieë is natuurlik in staat om vreemde DNA op te neem, maar hierdie vermoë kan in ander bakterieë geïnduseer word. [26] Om die bakterieë met 'n hitteskok of elektroporasie te beklemtoon, kan die selmembraan deurlaatbaar maak vir DNS wat dan in die genoom geïnkorporeer kan word of as ekstrachromosomale DNS kan bestaan. Tipies word die selle geïnkubeer in 'n oplossing wat tweewaardige katione (dikwels kalsiumchloried) bevat onder koue toestande, voordat dit aan 'n hittepuls (hitteskok) blootgestel word. Kalsiumchloried ontwrig die selmembraan gedeeltelik, wat die rekombinante DNA in staat stel om die gasheersel binne te dring. Daar word voorgestel dat die blootstelling van die selle aan tweewaardige katione in koue toestand die seloppervlakstruktuur kan verander of verswak, wat dit meer deurlaatbaar maak vir DNA. Daar word vermoed dat die hitte-puls 'n termiese wanbalans oor die selmembraan skep, wat die DNA dwing om die selle binne te gaan deur óf selporieë óf die beskadigde selwand. Elektroporasie is 'n ander metode om bevoegdheid te bevorder. In hierdie metode word die selle kortstondig geskok met 'n elektriese veld van 10-20 kV/cm, wat vermoedelik gate in die selmembraan skep waardeur die plasmied-DNS kan ingaan. Ná die elektriese skok word die gate vinnig toegemaak deur die sel se membraanherstelmeganismes. Opgeneemde DNA kan óf met die bakteriese genoom integreer óf, meer algemeen, as ekstrachromosomale DNA bestaan.

    In plante word die DNA dikwels ingevoeg met behulp van Agrobacterium-gemedieerde rekombinasie, [27] om voordeel te trek uit die Agrobacteriums T-DNA-volgorde wat natuurlike invoeging van genetiese materiaal in plantselle moontlik maak. [28] Plantweefsel word in klein stukkies gesny en in 'n vloeistof wat gesuspendeer bevat, geweek Agrobacterium. Die bakterieë sal heg aan baie van die plantselle wat deur die snye blootgestel word. Die bakterieë gebruik vervoeging om 'n DNA-segment genaamd T-DNA van sy plasmied na die plant oor te dra. Die oorgedrade DNA word na die plantselkern geloods en in die gasheerplants genomiese DNA geïntegreer. Die plasmied T-DNS word semi-lukraak in die genoom van die gasheersel geïntegreer. [29]

    Deur die plasmied te verander om die geen van belang uit te druk, kan navorsers hul gekose geen stabiel in die plantgenoom invoeg. Die enigste noodsaaklike dele van die T-DNS is sy twee klein (25 basispaar) grensherhalings, waarvan ten minste een nodig is vir planttransformasie. [30] [31] Die gene wat in die plant ingebring moet word, word in 'n planttransformasievektor gekloon wat die T-DNS-gebied van die plasmied bevat. 'n Alternatiewe metode is agro-infiltrasie. [32] [33]

    Nog 'n metode wat gebruik word om plantselle te transformeer, is biolistiek, waar deeltjies van goud of wolfram met DNS bedek word en dan in jong plantselle of plantembrio's ingeskiet word. [34] Sommige genetiese materiaal gaan die selle binne en transformeer hulle. Hierdie metode kan gebruik word op plante wat nie vatbaar is vir Agrobacterium infeksie en laat ook transformasie van plantplastiede toe. Plantselle kan ook getransformeer word deur elektroporasie te gebruik, wat 'n elektriese skok gebruik om die selmembraan deurlaatbaar vir plasmied DNA te maak. As gevolg van die skade wat aan die selle en DNA veroorsaak word, is die transformasiedoeltreffendheid van biolistiek en elektroporasie laer as agrobakteriese transformasie. [ aanhaling nodig ]

    Transfeksie wysig

    Transformasie het 'n ander betekenis in verhouding tot diere, wat vordering tot 'n kankertoestand aandui, so die proses wat gebruik word om vreemde DNA in dierselle in te voeg, word gewoonlik transfeksie genoem. [35] Daar is baie maniere om DNS direk in dierselle in te bring in vitro. Dikwels is hierdie selle stamselle wat vir geenterapie gebruik word. Chemies-gebaseerde metodes gebruik natuurlike of sintetiese verbindings om deeltjies te vorm wat die oordrag van gene in selle vergemaklik. [36] Hierdie sintetiese vektore het die vermoë om DNA te bind en groot genetiese oordragte te akkommodeer. [37] Een van die eenvoudigste metodes behels die gebruik van kalsiumfosfaat om die DNS te bind en dit dan aan gekweekte selle bloot te stel. Die oplossing, saam met die DNA, word deur die selle ingekapsuleer. [38] Liposome en polimere kan as vektore gebruik word om DNS in gekweekte dierselle af te lewer. Positief gelaaide liposome bind met DNA, terwyl polimere kan ontwerp wat met DNA in wisselwerking tree. [36] Hulle vorm onderskeidelik lipoplekse en poliplekse, wat dan deur die selle opgeneem word. Ander tegnieke sluit in die gebruik van elektroporasie en biolistiek. [39] In sommige gevalle kan getransfekteerde selle eksterne DNA stabiel in hul eie genoom integreer, hierdie proses staan ​​bekend as stabiele transfektasie. [40]

    Om transgeniese diere te skep, moet die DNA in lewensvatbare embrio's of eiers ingevoeg word. Dit word gewoonlik bewerkstellig met behulp van mikro-inspuiting, waar DNA deur die sel se kernomhulsel direk in die kern ingespuit word. [26] Superovulated bevrugte eiers word op die enkelselstadium versamel en gekweek in vitro. Wanneer die pronuklei van die spermkop en eiersel deur die protoplasma sigbaar is, word die genetiese materiaal in een van hulle ingespuit. Die oösiet word dan in die oviduct van 'n skyndragtige dier ingeplant. [41] Nog 'n metode is embrioniese stamsel-gemedieerde geneoordrag. Die geen word in embrioniese stamselle getransfekteer en dan word dit in muisblastosiste geplaas wat dan in pleegmoeders ingeplant word. Die gevolglike nageslag is chimeer, en verdere paring kan muise produseer wat ten volle transgenies is met die geen van belang. [42]

    Transduksie Wysig

    Transduksie is die proses waardeur vreemde DNA deur 'n virus of virale vektor in 'n sel ingebring word. [43] Geneties gemodifiseerde virusse kan as virale vektore gebruik word om teikengene na 'n ander organisme in geenterapie oor te dra. [44] Eers word die virulente gene van die virus verwyder en die teikengene word in plaas daarvan ingevoeg. Die volgordes wat die virus toelaat om die gene in die gasheerorganisme in te voeg, moet ongeskonde gelaat word. Gewilde virusvektore word uit retrovirusse of adenovirusse ontwikkel. Ander virusse wat as vektore gebruik word, sluit in lentivirusse, pokkevirusse en herpesvirusse. Die tipe virus wat gebruik word, sal afhang van die selle wat geteiken word en of die DNA permanent of tydelik verander moet word.

    Regenerasie wysig

    Aangesien slegs 'n enkele sel dikwels met genetiese materiaal getransformeer word, moet die organisme uit daardie enkele sel geregenereer word. By plante word dit bewerkstellig deur die gebruik van weefselkultuur. [45] [46] Elke plantspesie het verskillende vereistes vir suksesvolle herlewing. As dit suksesvol is, produseer die tegniek 'n volwasse plant wat die transgeen in elke sel bevat. [47] By diere is dit nodig om te verseker dat die ingevoegde DNS in die embrioniese stamselle teenwoordig is. [27] Nageslag kan vir die geen gekeur word. Alle nageslag van die eerste generasie is heterosigoties vir die ingevoegde geen en moet ingeteel word om 'n homosigotiese monster te produseer. [ aanhaling nodig ] Bakterieë bestaan ​​uit 'n enkele sel en reproduseer klonaal so regenerasie is nie nodig nie. Selekteerbare merkers word gebruik om maklik getransformeerde van ongetransformeerde selle te onderskei.

    Selle wat suksesvol met die DNA getransformeer is, bevat die merkergeen, terwyl die wat nie getransformeer is nie, nie. Deur die selle te laat groei in die teenwoordigheid van 'n antibiotika of chemikalie wat die selle wat daardie geen uitdruk, selekteer of merk, is dit moontlik om gemodifiseerde van ongemodifiseerde selle te skei. Nog 'n siftingsmetode behels 'n DNS-ondersoek wat net aan die ingevoegde geen kleef. Hierdie merkers is gewoonlik teenwoordig in die transgeniese organisme, alhoewel 'n aantal strategieë ontwikkel is wat die selekteerbare merker van die volwasse transgeniese plant kan verwyder. [48]

    Bevestiging Wysig

    Om te vind dat 'n rekombinante organisme die ingevoegde gene bevat, is gewoonlik nie voldoende om te verseker dat hulle toepaslik in die beoogde weefsels uitgedruk sal word nie. Verdere toetsing deur gebruik te maak van PCR, Southern hibridisasie en DNA-volgordebepaling word uitgevoer om te bevestig dat 'n organisme die nuwe geen bevat. [49] Hierdie toetse kan ook die chromosomale ligging en kopienommer van die ingevoegde geen bevestig. Sodra dit bevestig is, word metodes wat die geenprodukte (RNA en proteïen) soek en meet, ook gebruik om geenuitdrukking, transkripsie, RNA-verwerkingspatrone en uitdrukking en lokalisering van proteïenproduk(te) te assesseer. Dit sluit in noordelike hibridisasie, kwantitatiewe RT-PCR, Western klad, immunofluoressensie, ELISA en fenotipiese analise. [50] Wanneer toepaslik, word die organisme se nageslag bestudeer om te bevestig dat die transgeen en gepaardgaande fenotipe stabiel oorgeërf word.

    Tradisionele metodes van genetiese ingenieurswese plaas gewoonlik die nuwe genetiese materiaal lukraak binne die gasheergenoom. Dit kan ander gene binne die organisme benadeel of verander. Metodes is ontwikkel wat die nuwe genetiese materiaal in spesifieke plekke binne 'n organismegenoom ingevoeg het. Vroeë metodes wat gene op sekere plekke binne 'n genoom geteiken het, het op homoloë rekombinasie staatgemaak. [51] Deur DNS-konstrukte te skep wat 'n sjabloon bevat wat by die geteikende genoomvolgorde pas, is dit moontlik dat die HR-prosesse binne die sel die konstruk by die verlangde plek sal invoeg. Die gebruik van hierdie metode op embrioniese stamselle het gelei tot die ontwikkeling van transgeniese muise met doelgerigte uitgeslaan. Dit was ook moontlik om gene in te klop of geenuitdrukkingspatrone te verander. [52]

    As 'n lewensbelangrike geen uitgeslaan word, kan dit dodelik wees vir die organisme. Ten einde die funksie van hierdie gene te bestudeer, is plekspesifieke rekombinases (SSR) gebruik. Die twee mees algemene tipes is die Cre-LoxP en Flp-FRT stelsels. Cre-rekombinase is 'n ensiem wat DNA verwyder deur homoloë rekombinasie tussen bindingsvolgordes bekend as Lox-P-plekke. Die Flip-FRT-stelsel werk op 'n soortgelyke manier, met die Flip-rekombinase wat FRT-reekse herken. Deur 'n organisme wat die rekombinase-terreine bevat wat die geen van belang flankeer, te kruis met 'n organisme wat die SSR uitdruk onder beheer van weefselspesifieke promotors, is dit moontlik om gene slegs in sekere selle uit te skakel of aan te skakel. Dit is ook gebruik om merkergene van transgeniese diere te verwyder. Verdere wysigings van hierdie stelsels het navorsers toegelaat om rekombinasie slegs onder sekere omstandighede te veroorsaak, sodat gene uitgeslaan of uitgedruk kan word op gewenste tye of stadiums van ontwikkeling. [52]

    Genoomredigering gebruik kunsmatig gemanipuleerde nukleases wat spesifieke dubbelstring-breuke op gewenste plekke in die genoom skep. Die onderbrekings is onderhewig aan sellulêre DNA-herstelprosesse wat uitgebuit kan word vir geteikende geen-uitklop, regstelling of invoeging teen hoë frekwensies. As 'n skenker-DNS wat die toepaslike volgorde (homologieë) bevat teenwoordig is, sal nuwe genetiese materiaal wat die transgeen bevat, met hoë doeltreffendheid by die geteikende plek geïntegreer word deur homoloë rekombinasie. [53] Daar is vier families van gemanipuleerde nukleases: meganukleases, [54] [55] ZFNs, [56] [57] transkripsie-aktiveerder-agtige effektor-nukleases (TALEN), [58] [59] die CRISPR/Cas (gereeld gegroepeer tussen die kort palindromiese herhaling/CRISPR-geassosieerde proteïen (bv. CRISPR/Cas9). [60] [61] Onder die vier tipes is TALEN en CRISPR/Cas die twee wat die meeste gebruik word. [62] Onlangse vooruitgang het gekyk na die kombinasie van verskeie stelsels om te ontgin die beste kenmerke van albei (bv. megaTAL wat 'n samesmelting van 'n TALE DNA-bindingsdomein en 'n meganuklease is). [63] Onlangse navorsing het ook gefokus op die ontwikkeling van strategieë om geen-uitklop of regstellings te skep sonder om dubbelstrengs breuke te skep (basisredigeerders ). [62]

    Meganukleases en sinkvingernukleases Wysig

    Meganukleases is die eerste keer in 1988 in soogdierselle gebruik. [64] Meganukleases is endodeoksiribonukleases wat funksioneer as beperkingsensieme met lang herkenningsplekke, wat hulle meer spesifiek vir hul teikenplek maak as ander beperkingsensieme. Dit verhoog hul spesifisiteit en verminder hul toksisiteit aangesien hulle nie soveel plekke binne 'n genoom sal teiken nie. Die meganukleases wat die meeste bestudeer is, is die LAGLIDADG-familie. Terwyl meganukleases nog redelik vatbaar is vir buite-teikenbinding, wat hulle minder aantreklik maak as ander geenredigeringsinstrumente, maak hul kleiner grootte hulle steeds aantreklik veral vir virale vektoriseringsperspektiewe. [65] [53]

    Sink-vinger-nukleases (ZFN's), wat vir die eerste keer in 1996 gebruik is, word tipies geskep deur die samesmelting van sink-vinger-domeine en die FokEk nuklease domein. ZFN'e het dus die vermoë om DNA by teikenplekke te splits. [53] Deur die sinkvingerdomein te ontwerp om 'n spesifieke plek binne die genoom te teiken, is dit moontlik om die genomiese volgorde op die verlangde plek te wysig. [65] [66] [53] ZFN'e het 'n groter spesifisiteit, maar hou steeds die potensiaal in om aan nie-spesifieke volgordes te bind.. Alhoewel 'n sekere hoeveelheid buite-teiken-splyting aanvaarbaar is vir die skep van transgeniese model-organismes, is hulle dalk nie optimaal vir alle menslike geenterapie-behandelings. [65]

    TALEN en CRISPR Edit

    Toegang tot die kode wat die DNS-herkenning deur transkripsie-aktiveerderagtige effektore (TALE) in 2009 beheer, het die weg oopgemaak vir die ontwikkeling van 'n nuwe klas doeltreffende TAL-gebaseerde geenredigeringsinstrumente. TALE, proteïene wat deur die Xanthomonas-plantpatogeen afgeskei word, bind met groot spesifisiteit aan gene binne die plantgasheer en inisieer transkripsie van die gene wat infeksie help. IngenieursVERHAAL deur die DNA-bindende kern aan die FokI nuklease katalitiese domein het die skepping van 'n nuwe instrument van ontwerper nuklease, die TALE nuklease (TALEN) moontlik gemaak. [67] Hulle het een van die grootste spesifisiteite van al die huidige gemanipuleerde nukleases. As gevolg van die teenwoordigheid van herhalende rye, is dit moeilik om te bou deur middel van standaard molekulêre biologie prosedure en maak staat op meer ingewikkelde metodes soos Golden gate kloning. [62]

    In 2011 is nog 'n groot deurbraaktegnologie ontwikkel wat gebaseer is op CRISPR/Cas (gegroepeerde gereelde kort palindromiese herhaling / CRISPR-geassosieerde proteïen) stelsels wat as 'n aanpasbare immuunstelsel in bakterieë en archaea funksioneer. Die CRISPR/Cas-stelsel laat bakterieë en archaea toe om teen indringer virusse te veg deur virale DNA te splits en stukkies van daardie DNA in hul eie genoom in te voeg. Die organisme transkribeer dan hierdie DNA in RNA en kombineer hierdie RNA met Cas9-proteïene om dubbelstrengs breuke in die indringende virale DNA te maak. Die RNA dien as 'n gids-RNA om die Cas9-ensiem na die regte plek in die virus-DNS te rig. Deur Cas-proteïene met 'n ontwerpte gids te koppel, kan RNA CRISPR/Cas9 gebruik word om dubbelstring-breuke op spesifieke punte binne DNA-volgordes te veroorsaak. Die breuk word herstel deur sellulêre DNA-herstel-ensieme, wat in die meeste gevalle 'n klein invoeging/uitwissingstipe mutasie skep. Geteikende DNA-herstel is moontlik deur 'n skenker-DNA-sjabloon te verskaf wat die verlangde verandering verteenwoordig en wat (soms) gebruik word vir dubbelstring-breekherstel deur homoloë rekombinasie. Dit is later gedemonstreer dat CRISPR/Cas9 menslike selle in 'n skottel kan redigeer. Alhoewel die vroeë generasie nie die spesifisiteit van TALEN het nie, is die groot voordeel van hierdie tegnologie die eenvoud van die ontwerp. Dit laat ook toe dat verskeie webwerwe gelyktydig geteiken word, wat die redigering van verskeie gene gelyktydig moontlik maak. CRISPR/Cpf1 is 'n meer onlangs ontdekte stelsel wat 'n ander gids-RNA vereis om spesifieke dubbelstring-breuke te skep (laat oorhange wanneer die DNA gesplits word) in vergelyking met CRISPR/Cas9. [62]

    CRISPR/Cas9 is doeltreffend teen geenontwrigting. Die skepping van MIV-weerstandige babas deur die Chinese navorser He Jiankui is miskien die bekendste voorbeeld van geenontwrigting deur hierdie metode te gebruik. [68] Dit is baie minder effektief by geenkorreksie. Metodes van basisredigering is onder ontwikkeling waarin 'n "nuklease-dooie" Cas 9-endonuklease of 'n verwante ensiem gebruik word vir geen-teikening terwyl 'n gekoppelde deaminase-ensiem 'n geteikende basisverandering in die DNA maak. [69] Die mees onlangse verfyning van CRISPR-Cas9 word Prime Editing genoem. Hierdie metode koppel 'n omgekeerde transkripsie aan 'n RNA-geleide gemanipuleerde nuklease wat slegs enkelstring-snitte maak, maar geen dubbelstring-breek nie.Dit vervang die gedeelte van DNS langs die snit deur die opeenvolgende aksie van nuklease en omgekeerde transkripsie, wat die gewenste verandering vanaf 'n RNA-sjabloon bekendstel. [70]


    Kyk die video: I am groot (September 2022).