Inligting

Is daar studies gedoen om onsterflikheid van kankerselle in kultuur te toets?

Is daar studies gedoen om onsterflikheid van kankerselle in kultuur te toets?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hierdie webwerf oor gekweekte kankerselle () sê kankerselle onsterflik kan wees.

Ek wonder of daar enige navorsing gedoen is om vas te stel of kankerselle werklik onsterflik is.

  1. Hoe oud is die nog lewende oudste kultuur van kankerselle?
  2. Is daar enige navorsing gedoen oor replikatiewe veroudering van kankerselle in vitro?

Wysig 1:

As daar data is wat verband hou met die aantal herhalings wat die selle ondergaan het, sal dit baie nuttig wees


Die HeLa-sellyn is ongetwyfeld die mees gebruikte en ondersoek mens onsterflike tumorsellyn. Onttrek uit 'n servikale gewas van Henrietta Lacks in 1951 by die Johns Hopkins-hospitaal, Baltimore, MD, was hierdie selle onsterflik en word vandag steeds in baie, baie laboratoriums wêreldwyd gebruik. Dit is die oudste menslike sellyn wat gebruik word en dus die oudste menslike tumorsellyn (Callaway, 2013).

In terme van veroudering van onsterflike selle; HeLa-selle is onsterflik en word dus nie as sodanig oud nie. Hulle is egter onderhewig aan mutasies en die genetiese profiel van HeLa-selle verander wel met verloop van tyd. Dus, hoewel hulle dalk nie oud word nie, verouder hulle wel in die sin dat mutasies in aaneenlopende sellyne ophoop.

Verwysings
Callaway, Natuur (2013); 500: 132-3


Ek dink 'n storie oor Alexis Carrel en Leonard Hayflick is hier gepas.

In die begin van die 20ste eeu het 'n Nobelpryswenner medikus/bioloog Alexis Carrel 'n reeks referate gepubliseer waarin hy beweer dat groei van 'n kultuur van selle van normale somatiese gedifferensieerde weefsel onbepaald gehandhaaf kan word sonder om sellulêre veroudering te ondergaan. Hierdie verkeerde resultaat is vir baie jare vir 'n feit gehou, voordat dit weerlê is deur Leonard Hayflick, wat getoon het dat normale somatiese selle 'n beperkte aantal verdelings ondergaan voordat hulle sterf en verewig in kankerselle plaasvind. Dit is die moeite werd om te noem dat die oorsaak van Dr.Carrel se fout dalk aan sy persoonlikheid toegeskryf kan word. Byvoorbeeld (aanhaling uit Wikipedia):

Carrel het die bestaan ​​van 'n "oorerflike biologiese aristokrasie" beweer en aangevoer dat "afwykende" menslike tipes onderdruk moet word deur tegnieke soortgelyk aan dié wat later deur die Nazi's gebruik is, te gebruik.

Die resultate van sy bevinding kan dus toegeskryf word aan 'n weergawe dat hy net sy laboratoriumlede so bang gemaak het dat hulle in die geheim 'n verslegtende kultuur met 'n nuwe een begin vervang het.

Ek is dalk rof op die hoeke en skryf sondes toe aan die man, waarvan hy onskuldig is. Vir 'n "regverdige verhoor" met bewyse ens., moet jy beter hierdie vraestel aanspreek: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1082700/

Sien ook hierdie gewilde koerant: http://www.theguardian.com/science/2015/feb/18/haruko-obokata-stap-cells-controversy-scientists-lie


Terminologie wat betrokke is, maak alles 'n bietjie lieg.

Al die “onsterflikheid” en so kompliseer dinge bietjie. Ons sien die lewe as die lewe van ons individuele liggame. As ons liggaam dus onsterflik is, beteken dit dat dit aanhoudend is, sonder dat ons ons steur aan ons individuele selle.

Maar daar is geen onderskeid soos dié in enkelsel-organismes waar selle self as "individue" beskou word nie. Wanneer sel verdeel, is daar gewoonlik geen onderskeid tussen watter een "ma" en watter een "dogter" is nie. Albei nuwe selle is gewoonlik dieselfde. Dit mag dus óf lyk asof selle onsterflik is omdat hulle nie deur ouderdom sterf nie, óf dat ons nuwe selle as nuwe individue definieer en dus het die ou een gesterf om twee nuwes te gee.

Maar ons kan ook sekere aspek van hierdie standpunt oor meersellige organismes inneem. Ons liggame word defacto geskep deur baie ou sellyn (of in seksueel betrokke organisme, twee sellyne) en dan het hierdie sellyn voertuig vir homself geskep. Vanuit hierdie oogpunt, wat nie baie verskil van die standpunt wat geneem word wanneer oor hierdie laboratoriumsellyne gepraat word nie, is die hele lewe enkelsellyn. En vanuit hierdie oogpunt is die lewe self onsterflik.

Die hele probleem is dus dat ons standpunt, waaroor ons onsterflikheid en individue definieer, slegs vir spesiale tipes organismes gemaak is, soos dit geen sin het wanneer ons van enkelsel-organismes praat nie. Onsterflikheid van kankerselle is dus slegs modewoord.


Hoe bereik kankerselle onsterflikheid?

Meer as 'n derde van Amerikaanse volwassenes sal kanker kry. In 2018 alleen sal meer as 1,7 miljoen nuwe kankergevalle gediagnoseer word. Vroeëre opsporing en meer presiese behandelingsopsies verbeter die uitkomste vir pasiënte, maar met 'n geskatte 14 miljoen kankeroorlewendes wat in die VSA woon, bly kankerherhaling 'n groot bedreiging. Kankerselle, anders as die normale selle in ons liggame, kan vir ewig groei. Kankersel onsterflikheid lei tot massiewe gewasse, metastatiese verspreiding en moontlik heropkoms. JAX postdoktorale medewerker Floris BarthelOntplooi volgende generasie volgordebepalingstegnieke om breingewasbiologie en telomeermeganika te verstaan Floris Barthel, M.D., het 'n Pathway to Independence-toekenning (of &ldquoK99&rdquo) van die NIH&rsquos National Cancer Institute ontvang om te bepaal hoe kankerselle onsterflikheid bereik.

Die normale selle in ons liggame word oud en sterf. Die punte van die chromosome, gespesialiseerde DNA-volgordes wat telomere genoem word, hou tred met sellulêre ouderdom. Met elke seldeling word telomere verkort totdat dit uiteindelik te kort word om die chromosome te beskerm en die sel sterf. Kankers word onsterflik deur die normale telomere-verkortingsproses om te keer en eerder hul telomere te verleng. Barthel, wat saam met professor werk Roel Verhaak, Ph.D.Breingewasse, volgordebepaling, berekeningsbiologie. Roel Verhaak, Ph.D., by JAX&rsquos Genomic Medicine-kampus in Farmington, Connecticut, ontdek hoe kankerselle die sellulêre prosesse wat telomeerlengte beheer, opneem.

Die sellulêre masjien wat hoofsaaklik verantwoordelik is vir die verlenging van telomere is die proteïen telomerase: dit voeg telomere DNA by die punte van chromosome. In ons liggame word telomerase gewoonlik afgeskakel. Dit word aangeskakel wanneer sperm en eiers gemaak word en in sommige baie vroeë stadiums van die lewe &ndash in selle wat baie sal moet verdeel. En dit word aangeskakel wanneer selle kankeragtig word. Kankerselle kan telomerase heraktiveer deur die DNA te verander rondom een ​​van die gene wat telomerase maak, genaamd TERT. Barthel is veral daarop gefokus om te bepaal hoe chemiese veranderinge aan die TERT DNA laat telomerase weer aangeskakel word.

Die resultate van Barthel & rsquos navorsing kan nuwe maniere identifiseer om telomerase af te skakel. Om kankerselle sterflik &mdash onderhewig te maak aan die normale sellulêre lewensduur wat deur telomere-verkorting &mdash opgelê word, sal die potensiaal vir genesing dramaties verander, insluitend vir kankers met nog min effektiewe behandelingsopsies. Die toekenning &mdash $230,000 oor twee jaar gevolg deur 'n opsionele driejaarfase &mdash stel Barthel in staat om te ontdek hoe telomerase-heraktivering op die DNS-vlak plaasvind en om sy onafhanklike navorsingslaboratorium te vestig.

&ldquoTerapieë wat telomerase direk teiken, is gevind dat dit giftig is vir nie-kankerselle, en om presies te verstaan ​​hoe telomerase in kanker aangeskakel word, kan ons toelaat om dit te omseil,&rdquo het Barthel gesê. &ldquoUiteindelik hoop ek dat ek kan bydra tot die ontwikkeling van nuwe kankerterapieë wat telomerase-aktiwiteit verminder of uitskakel sonder om nie-kankerselle te beïnvloed.&rdquo

&ldquoNIH K99-toekennings stel die mees talentvolle junior wetenskaplike in staat om optimaal voor te berei vir 'n loopbaan as onafhanklike navorser,&rdquo het Verhaak gesê. &ldquoIn die geval van Floris Barthel is daar by my geen twyfel dat hy sal voortgaan om ontdekkings te maak wat uiteindelik tot verbeterde uitkomste vir kankerpasiënte sal lei nie.&rdquo


Agtergrond

Genetiese heterogeniteit, wat so vroeg as 1958 erken word (Huxley 1958), is 'n goed gevestigde verskynsel in tumorselle, veral tydens metastatiese stadiums (Torres et al. 2007 Park et al. 2010 Patel et al. 2014 Alizadeh et al. 2015). Studies het getoon dat selle van 'n enkele kanker tipies veelvuldige geneties afsonderlike subgroepe bevat (Cleary et al. 2014 Meacham en Morrison 2013 Gay et al. 2016 Marusyk en Polyak 2010). Sulke hoë vlak van heterogeniteit dra by tot die rede waarom kanker moeilik is om te genees (McGranahan en Swanton 2017 Mann et al. 2016 Koren en Bentires-Alj 2015). Tot op hede word die rede en omvang van tumorselheterogeniteit egter steeds nie goed verstaan ​​nie (Alizadeh et al. 2015). Twee hoofteorieë is voorgestel om die oorsprong van tumorselheterogeniteit te verduidelik: die bestaan ​​van kankerstamselle (Magee et al. 2012) en klonale evolusie (McGranahan en Swanton 2017). Hierdie twee teorieë probeer om die heterogeniteit in onderskeidelik ekologiese en evolusionele aspekte te verduidelik, en bewyse bestaan ​​vir elke teorie (Shackleton et al. 2009). Verder bied nuwe insig in geen-regulerende netwerke 'n raamwerk om die breë heterogeniteit te verduidelik sonder die behoefte aan oormatige mutasie-aktiwiteit (Huang 2012a Huang 2013 Huang 2012b). Variasies in geenuitdrukking lei tot molekulêre variasies wat weer sellulêre vorm en funksie beïnvloed.

Nog 'n goed gevestigde verskynsel wat verband hou met gewasse is veranderinge in sellulêre styfheid. Selle struktureer en reguleer aktief die verskillende elemente van die sitoskelet, die hoofbydraer van sellulêre styfheid en inskiklikheid (Huber et al. 2013). Trouens, verskillende komponente van die sitoskelet dra by tot verskillende strukturele en meganiese take, bv. Aktien dra by tot sel-elastisiteit in reaksie op klein stamme terwyl mikrotubuli reaksies op groot stamme beïnvloed (Lautenschlager et al. 2009 Kubitschke et al. 2017). Die meganika van selle is bestudeer met veelvuldige eksperimentele gereedskap (Kubitschke et al. 2018 Pawlizak et al. 2015), insluitend atoomkragmikroskopie (AFM) (Hayashi en Iwata 2015), kwantitatiewe vervormbaarheidsitometrie (q-DC) (Nyberg et al. . 2017), intydse vervormbaarheidsitometrie (Mietke et al. 2015 Otto et al. 2015), mikrofluïdiese optiese selstrekers (Farzbod en Moon 2018) en hidrodinamiese vloeistrekers (Dudani et al. 2013 Gossett et al. 2012). Aangesien metastase verantwoordelik is vir meer as 90% van kankersterftes (Wirtz et al. 2011 Mehlen en Puisieux 2006 Taketo 2011), is groot moeite gedoen om die meganiese eienskappe van metastatiese tumorselle te bestudeer en om te verstaan ​​hoe meganiese eienskappe van tumorselle beïnvloed hul metastatiese vermoë. ’n Aantal studies het bevind dat metastatiese tumorselle sagter is as hul nie-metastatiese eweknieë sowel as normale selle (Lekka et al. 2012 Plodinec et al. 2012 Swaminathan et al. 2011). Daarbenewens het studies die potensiaal voorgestel van die gebruik van meganiese eienskappe as 'n biomerker van metastase (Xu et al. 2012) en vir kankerdiagnose (Remmerbach et al. 2009).

In hierdie vraestel neem ons eerste stappe om hierdie twee fenotipes van metastatiese tumorselle te verbind - veranderinge in selheterogeniteit en selstyfheid. Alhoewel die meeste selmeganika-studies op die enkelselvlak uitgevoer word, is analise en interpretasie van data oor die algemeen beperk tot gemiddeldes, wat dus heterogeniteit as 'n belangrike aspek van die metastatiese fenotipe weglaat. Vorige werk (Plodinec et al. 2012 Kiessling et al. 2013) het belangrike wenke opgelewer dat meganiese eienskappe in werklikheid heterogeen is – die gemete verdelings vir die viskoelastiese eienskappe van selle, selfs in 'n enkele sellyn, is nie Gaussiaans nie, wat aandui dat verskeie meganiese eienskappe fenotipes is teenwoordig, byvoorbeeld, verteenwoordig deur uitskieters van die gewone langstertverspreidings.

In hierdie vraestel gebruik ons ​​'n mikrofluïdiese optiese selstreker om meganiese eienskappe van enkelselle van drie epiteelsellyne te meet en te kontrasteer: MCF-10A, MDA-MB-231 en MDA-MB-436, en ons gebruik die heterogeniteit van die sel meganiese eienskappe van elke sellyn om die verskillende fenotipes te kontrasteer. Hierdie drie sellyne verteenwoordig 'n goed gevestigde borskankerselpaneel. MCF-10A is 'n nie-tumorigene epiteel sellyn terwyl MDA-MB-436 en MDA-MB-231 bors karsinoom sellyne is met 'n mesenchimaal-agtige metastatiese fenotipe. Met enkelseldata-analise wys ons dat heterogeniteit van sellulêre styfheid beide binne en tussen sellyne bestaan. Ons neem veral twee groepe MDA-MB-231-selle waar. Selle in een van die groepe is aansienlik sagter as selle in die ander. Daarbenewens vind ons dat alhoewel MDA-MB-231 en MDA-MB-436 albei trippel-negatiewe borskankersellyne is (dws hulle druk nie estrogeenreseptore, progesteroonreseptore of menslike epidermale groeifaktorreseptor [HER]2 uit nie) met metastatiese neiging, is hulle eerder van mekaar verskil in vergelyking met die nie-kwaadaardige sellyn MCF-10A.


Ontwikkeling van kankersellynpanele

'n Belangrike paradigmaskuif het in die laat 1980's plaasgevind in reaksie op die beperkte sukses in die kliniek van verbindings wat deur middel van skerms geïdentifiseer is met behulp van oorplantbare muriene neoplasmas vir soliede gewasse (14). Gevolglik is die ontwikkeling van 'n in vitro mensgebaseerde hulpmiddel vir geneesmiddelontdekking gesoek om die translasie sukses van nuut geïdentifiseerde antikankerverbindings te verhoog. Die idee het dus ontstaan ​​om 'n paneel sellyne te ontwikkel wat die wisselvalligheid van die chemoterapie-reaksie wat in die kliniek vir 'n spesifieke gewastipe waargeneem is, sal rekapituleer. Op daardie tydstip het die waargenome responskoers van baie gewasse op konvensionele chemoterapie gewissel van 25% tot 70%. Daarom is aanvaar dat ses tot nege sellyne per tumortipe voldoende sou wees om hierdie veranderlikheid vas te vang. In die Verenigde State is die National Cancer Institute 60 (NCI-60) paneel van kankersellyne, wat 60 kankersellyne ingesluit het wat nege verskillende kankertipes verteenwoordig, in 1990 bekendgestel (15). ’n Paar jaar later het die Japannese Stigting vir Kankernavorsing sy eie paneel van 39 kankersellyne ontwikkel, wat ook nege kankertipes (16) verteenwoordig het. Alhoewel daardie paneel 30 sellyne in gemeen het met die NCI-60, het dit ook 'n subpaneel van ses maagkankersellyne verskaf weens die voorkoms van maagkanker in die Japannese bevolking. Daardie platforms het gelei tot die generering van 'n magdom inligting, maar het ook gelei tot verdere verwarring oor die oorsprong van sommige sellyne en tot die ontwikkeling van nuwe analitiese metodologieë om hoë-deursetdata te integreer (15,17). Nietemin, onlangse pogings is uitgevoer deur die American Type Culture Collection Standards Development Organisation Workgroup ASN-0002 om 'n gestandaardiseerde protokol en 'n publiek soekbare databasis te ontwikkel vir die verifikasie van menslike sellyne deur gebruik te maak van kort tandem-herhalingsprofilering (18�). Dit is 'n belangrike stap om sellyn verkeerde identifikasie te minimaliseer, indien nie om uit te roei nie.


Studie bevestig veiligheid en doeltreffendheid van COVID-19-inenting by mense met kanker

Sedert die vroeë dae van die COVID-19-pandemie was daar vrae oor hoe mense in aktiewe kankerbehandeling sou vaar as hulle met SARS-CoV-2 besmet sou word. Die bekommernisse was grootliks te wyte aan die uitwerking wat kanker en die behandeling daarvan op die immuunstelsel kan hê. Noudat COVID-19-entstowwe wyd beskikbaar is, het kommer verskuif na die veiligheid en doeltreffendheid van inenting in hierdie potensieel kwesbare bevolking. 'n Studie gepubliseer 5 Junie in die joernaal Kankersel poog om daardie vrese te besweer.

In 'n oorsig van 200 pasiënte met 'n wye spektrum van kankerdiagnose, het navorsers by Montefiore Health System en Albert Einstein College of Medicine in die Bronx, NY, bevind dat na volle inenting, 94% van pasiënte algehele serokonversie getoon het, wat bepaal is deur die teenwoordigheid van teenliggaampies teen die SARS-CoV-2-puntproteïen. Reaksiekoerse was baie hoog onder pasiënte met soliede gewasse en was laer in mense met sekere bloedkankers, maar selfs die meerderheid van daardie pasiënte het 'n immuunreaksie opgedoen.

"Studies van vroeg in die pandemie het bevind dat kankerpasiënte wat COVID-19 kry, hoër syfers van morbiditeit en mortaliteit het in vergelyking met die algemene bevolking," sê senior mede-outeur Amit Verma, direkteur van die Afdeling Hemato-Onkologie by Montefiore en professor van medisyne en van ontwikkelings- en molekulêre biologie by Einstein, en mede-direkteur, translasiewetenskap, Albert Einstein Kankersentrum. "Ons het regtig pogings nodig om hierdie kwesbare pasiënte teen infeksie te beskerm. Hierdie studie moet mense help om gerus te voel dat hierdie entstowwe baie goed werk, selfs in diegene wat chemoterapie of immunoterapie ontvang."

"Hierdie studie bevestig dat dit nie nodig is vir pasiënte om te wag vir inenting totdat hulle hul chemoterapie of immunoterapie voltooi nie," sê senior mede-outeur Balazs Halmos (@DrSteveMartin), direkteur van die Multidissiplinêre Torakale Onkologie-program by Montefiore, professor in medisyne by Albert Einstein College of Medicine, en 'n lid van die Albert Einstein Cancer Centre (AECC). "Die newe-effekte van inenting wat in hierdie bevolkings gesien is, was nie wesenlik erger as in ander groepe nie. Nie 'n enkele pasiënt moes na die noodkamer gaan of in die hospitaal opgeneem word as gevolg van newe-effekte van die entstowwe nie."

Hierdie studie was die grootste van sy soort om te kyk na serokonversiekoerse by kankerpasiënte wat ten volle ingeënt is. Vorige studies het na baie kleiner bevolkings gekyk of teenliggaampies ontleed na slegs die eerste dosis van twee-dosis-entstowwe.

In serumtoetse om te kyk vir IgG-vlakke na inenting, het die navorsers bevind dat onder pasiënte met soliede gewasse, 98% serokonversie getoon het. Onder pasiënte met hematologiese kankers was die tempo van serokonversie 85%.

Pasiënte wat sommige behandelings ontvang het, het slegter gevaar as ander. Diegene wat terapieë ontvang het vir bloedkankers wat werk deur B-selle dood te maak (soos rituximab- of CAR T-terapieë) het serokonversiekoerse van 70% gehad. Vir diegene wat onlangs beenmurg- of stamseloorplantings gehad het, was die koers 74%. Maar daardie tariewe was steeds baie hoër as wat verwag is, sê die navorsers.

"Alhoewel diegene wat behandelings ontvang het wat B-selle affekteer nie so goed gevaar het nie, het pasiënte met bloedkankers wat die myeloïede selle eerder as die limfoïede selle aantas 'n redelik goeie reaksie gehad met betrekking tot seropositiwiteit," sê eerste skrywer Astha Thakkar (@asthakkar15) 'n Montefiore hematologiese onkologie-genoot. "Dit sluit mense in met akute myeloïede leukemie en myelodisplastiese sindroom."

Die navorsers sê een van die redes waarom hul data so betekenisvol is, is dat dit pasiënte insluit wat 'n wye reeks kankers gehad het en wat 'n aantal verskillende behandelings ondergaan het. "Die pasiënte self was ook uiteenlopend en was verteenwoordigend van die pasiënte wat ons in die Bronx behandel," sê Halmos. “Ongeveer een derde was swart en 40% was Spaans.

“Inenting onder hierdie bevolkings was laer, al is hierdie groepe die swaarste getref deur die pandemie,” sluit Verma af. "Dit is belangrik om te beklemtoon hoe goed hierdie pasiëntpopulasies met die entstowwe gevaar het."

Befondsingsondersteuning is verskaf deur die Nasionale Kankerinstituut (NCI) en die NCI Gemeenskapsonkologienavorsingsprogram (NCORP).


Bioloë skep 'n beter metode om selle te kweek om dwelmtoksisiteit te toets

Wanneer 'n nuwe geneesmiddel ontwikkel word, is die eerste vraag: "Werk dit?" Die tweede vraag is: "Doen dit skade?" Maak nie saak hoe effektief 'n terapie is nie, as dit die pasiënt in die proses benadeel, het dit min waarde.

Doktorale student Robert Skolik en medeprofessor Michael Menze, Ph.D., in die Departement Biologie aan die Universiteit van Louisville, het 'n manier gevind om selkulture nader aan normale selle te laat reageer, wat dit moontlik maak om dwelms vroeër vir toksisiteit te ondersoek. die navorsingstydlyn.

Die oorgrote meerderheid selle wat vir biomediese navorsing gebruik word, is afkomstig van kankerweefsels wat in biobewaarplekke gestoor word. Hulle is goedkoop om te onderhou, maklik om te groei en vinnig te vermeerder. Spesifiek, lewerkankerselle is wenslik om die toksisiteit van dwelms vir enige aantal siektes te toets.

"Jy hou daarvan om lewerselle te gebruik, want dit is die orgaan wat enige middel sal ontgift vir watter behandeling jy ook al toets," het Menze gesê. "Wanneer nuwe middels vir diabetes of 'n ander siekte ontwikkel word, is een van die bekommernisse of dit giftig is vir die lewer."

Die selle kom egter met beperkings. Aangesien hulle kankerselle is, is hulle dalk nie so sensitief vir gifstowwe as normale selle nie, so hulle mag nie probleme met toksisiteit openbaar wat baie later in die dwelmtoetsproses kan voorkom nie.

Skolik en Menze het ontdek dat deur die verandering van twee komponente van die media wat gebruik word om die selle te kweek, hulle lewerkankerselle meer soos normale lewerselle kan laat optree. Eerder as om standaardserum te gebruik wat glukose bevat, het hulle serum gebruik waaruit die glukose verwyder is met dialise en galaktose - 'n ander vorm van suiker - by die media gevoeg. Die tumorselle metaboliseer galaktose teen 'n baie stadiger tempo as glukose. Dit verander die metabolisme van die selle sodat hulle meer soos normale lewerselle optree.

Deur selle te gebruik wat met hierdie gemodifiseerde serum gekweek is, kan dwelms effektief vroeër in die navorsingsproses vir toksisiteit gekeur word, wat moontlik miljoene dollars bespaar.

"Dit het begin net as 'n manier om selle sensitief te maak vir mitochondriale aktiwiteit, die sellulêre kragbron, maar toe het ons besef ons het 'n manier om te ondersoek hoe ons kankermetabolisme verskuif," het Skolik gesê. "In kort, ons het 'n manier gevind om kankerselle te herprogrammeer om meer soos 'n normale sel te lyk en op te tree."

Die navorsing word op die voorblad van die April-uitgawe van Amerikaanse Tydskrif vir Fisiologie-Selfisiologie. Die voorbladbeeld was die werk van Nilay Chakraborty, Ph.D., en Jason Solocinski aan die Universiteit van Michigan-Dearborn, wat 'n nuwe proses ontwikkel het om lewendige beelde van die verspreiding van energiemolekules in selle te verkry, wat wys hoe selle op veranderinge reageer in die selkultuur toestande.

Om die effek wat hy berig het ten volle te besef, het Skolik die selle ook vir 'n langer tydperk as gewoonlik gekweek.

"In die verlede sou mense 'n 12-uur aanpassing aan hierdie nuwe media doen. Maar wat ons gewys het, is as jy hulle vir 4 tot 5 weke kweek, het jy 'n baie meer robuuste verskuiwing," het Skolik gesê.

"Wanneer dit by gene-uitdrukking kom, kry jy baie meer bang vir die geld as jy hulle vir 'n langer tydperk aanpas."

Alhoewel die gemodifiseerde serum vir die kulture die bykomende stap van dialise en langer kultuurtyd vereis, kan dit voordele in latere toetsstadiums oplewer.

"Jy sal hierdie proses reserveer vir sleuteleksperimente of toksisiteitsifting," het Menze gesê. "As jy egter in 'n Fase 1-kliniese proef gaan en daar toksisiteit vind, is dit baie duurder as om hierdie metode te gebruik."


HeLa selle (1951)

Henrietta Lacks, 'n swart vrou, was 'n 31-jarige ma van vyf toe sy in 1951 aan servikskanker gesterf het. Haar naam en nagedagtenis leef voort in die vorm van 'n merkwaardige geslag van selle wat voortdurend verdeel, wat in alle opsigte "onsterflikheid" bereik het. Haar kankerselle het voortgegaan om ver na haar dood in laboratoriums regoor die wêreld te leef, wat so produktief repliseer dat hulle van einde tot einde drie keer om die aarde gedraai kon word.

Toe Henrietta in Januarie 1951 'n kankerkliniek by Johns Hopkins in Baltimore bygewoon het, die enigste hospitaal in die gebied om Afro-Amerikaners op daardie stadium te behandel, het sy min besef dat sy 'n soort onsterflikheid sou bereik. Haar chirurg, Howard Jones, het sonder haar medewete of toestemming 'n weefselbiopsie van haar kankeragtige baarmoeder geneem, wat deurgegee is aan George Otto Gey, 'n geneesheer en kankernavorser in dieselfde Baltimore-hospitaal wat verstom was oor die vermoë van die selle om te repliseer in laboratorium kultuur.

Normaalweg sal kankerselle 'n paar keer verdeel en afsterf voordat enige ordentlike studies daarmee gedoen kon word. Maar Henrietta's het net aangehou verdeel en verdeel, net solank hulle die regte mengsel van voedingstowwe gevoer is vir hulle om te groei. Henrietta se kankerselle het die eerste menslike "sellyn" geword wat in kultuur gevestig is en Gey het hulle na die eerste twee letters van haar naam genoem - HeLa (uitgespreek "hee-la").

HeLa-selle het sedertdien die mees gebruikte menslike sellyn in biologiese navorsing geword en was van kritieke belang vir baie biomediese deurbrake van die afgelope halfeeu. Jonas Salk het dit byvoorbeeld in 1954 gebruik om die polio-entstof te ontwikkel en in die 1980's het VIGS-navorsers dit gebruik om die menslike immuniteitsgebrekvirus (MIV) te identifiseer en te isoleer, terwyl HeLa-selle in onlangse jare kritiek was vir die "omics"-revolusie, van genomika tot transkriptomika en proteomika.

Sowat 70 000 studies is gepubliseer wat die gebruik van HeLa-selle behels en hulle is wydverspreid in die veld van immunologie. Minstens twee Nobelpryse is onlangs toegeken vir navorsing wat HeLa-selle betrek, een oor die verband tussen menslike papillomavirus en servikale kanker (2008 deur Harald zur Hausen), wat met die ontdekkers van MIV (Luc Montagnier en Francoise Barre-Sinoussi) gedeel is ), en die ander in die rol wat die telomerase-ensiem speel om chromosoomafbraak te voorkom (2009 deur Elizabeth Blackburn, Carol Greider en Jack Szostak).

Wat Henrietta se uitgebreide familie betref, is hulle tot relatief onlangs in die duister gehou oor wat met hul voorvader se onbewuste bemaking aan die mediese wetenskap gebeur het, 'n skokkende toesig wat in die VSA gelei het tot 'n verandering in die etiese grondreëls wat die neem en gebruik van hospitaalbiopsies sonder ingeligte toestemming. Die verhaal van Lacks se lewe en hiernamaals kan beter verstaan ​​word “Die onsterflike lewe van Henrietta Lacks”, 'n roman geskryf deur Rebecca Skloot.


Die vloeistof wat tumorselle voed

Beelde vir aflaai op die MIT News-kantoorwebwerf word beskikbaar gestel aan nie-kommersiële entiteite, pers en die algemene publiek onder 'n Creative Commons Attribution Non-Commercial No Derivatives-lisensie. Jy mag nie die prente wat verskaf word verander nie, behalwe om hulle in grootte te sny. 'n Kredietlyn moet gebruik word wanneer beelde gereproduseer word as een nie hieronder verskaf word nie, krediteer die beelde aan "MIT."

Vorige prent Volgende prent

Voordat dit in diere of mense getoets word, word die meeste kankermedisyne geëvalueer in tumorselle wat in 'n laboratoriumskottel gekweek word. In onlangse jare was daar egter 'n groeiende besef dat die omgewing waarin hierdie selle gekweek word nie die natuurlike omgewing van 'n gewas akkuraat naboots nie, en dat hierdie verskil onakkurate resultate kan lewer.

In 'n nuwe studie het MIT-bioloë die samestelling van die interstisiële vloeistof wat normaalweg pankreasgewasse omring, ontleed en gevind dat die voedingstofsamestelling daarvan verskil van dié van die kultuurmedium wat normaalweg gebruik word om kankerselle te laat groei. Dit verskil ook van bloed, wat die interstisiële vloeistof voed en afvalprodukte verwyder.

Die bevindinge dui daarop dat die groei van kankerselle in 'n kultuurmedium wat meer soortgelyk is aan hierdie vloeistof navorsers kan help om beter te voorspel hoe eksperimentele middels kankerselle sal beïnvloed, sê Matthew Vander Heiden, 'n medeprofessor in biologie aan MIT en 'n lid van die Koch Institute for Integrative Kankernavorsing.

"Dit is soort van 'n ooglopende stelling dat die tumoromgewing belangrik is, maar ek dink in kankernavorsing het die slinger so ver na gene geswaai, mense was geneig om dit te vergeet," sê Vander Heiden, een van die senior skrywers van die studie.

Alex Muir, 'n voormalige Koch Instituut postdoktors wat nou 'n assistent professor aan die Universiteit van Chicago is, is ook 'n senior skrywer van die koerant, wat in die uitgawe van 16 April van die tydskrif verskyn eLife. Die hoofskrywer van die studie is Mark Sullivan, 'n MIT-gegradueerde student.

Omgewing maak saak

Wetenskaplikes weet al lank dat kankerselle voedingstowwe anders metaboliseer as die meeste ander selle. Hierdie alternatiewe strategie help hulle om die boustene te genereer wat hulle nodig het om aan te hou groei en te verdeel en nuwe kankerselle te vorm. In onlangse jare het wetenskaplikes probeer om middels te ontwikkel wat met hierdie metaboliese prosesse inmeng, en een so 'n middel is in 2017 goedgekeur om leukemie te behandel.

'n Belangrike stap in die ontwikkeling van sulke middels is om dit te toets in kankerselle wat in 'n laboratoriumskottel gekweek word. Die groeimedium wat tipies gebruik word om hierdie selle te laat groei, sluit koolstofbronne (soos glukose), stikstof en ander voedingstowwe in. In die afgelope paar jaar het Vander Heiden se laboratorium egter gevind dat kankerselle wat in hierdie medium gekweek word anders op dwelms reageer as wat hulle in muismodelle van kanker doen.

David Sabatini, ’n lid van die Whitehead-instituut en professor in biologie aan MIT, het ook gevind dat dwelms kankerselle anders beïnvloed as dit in ’n medium gekweek word wat na die voedingstofsamestelling van menslike plasma lyk, pleks van die tradisionele groeimedium.

"Daardie werk, en soortgelyke resultate van 'n paar ander groepe regoor die wêreld, het voorgestel dat omgewing baie saak maak," sê Vander Heiden. "Dit was regtig 'n wekroep vir ons dat om regtig te weet hoe om die afhanklikhede van kanker te vind, ons die omgewing moet regkry."

Vir daardie doel het die MIT-span besluit om die samestelling van interstisiële vloeistof te ondersoek, wat die weefsel bad en voedingstowwe dra wat diffundeer uit bloed wat deur die kapillêre vloei. Die samestelling daarvan is nie identies aan dié van bloed nie, en in gewasse kan dit baie anders wees omdat gewasse dikwels swak verbindings met die bloedtoevoer het.

Die navorsers het gekies om deels op pankreaskanker te fokus omdat dit bekend is dat dit veral voedingstowwe ontneem is. Nadat interstisiële vloeistof van pankreasgewasse in muise geïsoleer is, het die navorsers massaspektrometrie gebruik om die konsentrasies van meer as 100 verskillende voedingstowwe te meet, en ontdek dat die samestelling van die interstisiële vloeistof verskil van dié van bloed (en van dié van die kweekmedium normaalweg). gebruik om selle te laat groei). Verskeie van die voedingstowwe wat die navorsers gevind het om in tumor-interstisiële vloeistof uitgeput te wees, is aminosure wat belangrik is vir immuunselfunksie, insluitend arginien, triptofaan en sistien.

Nie alle voedingstowwe was uitgeput in die interstisiële vloeistof nie - sommige was meer volop, insluitend die aminosure glisien en glutamaat, wat bekend is dat dit deur sommige kankerselle geproduseer word.

Ligging, ligging, ligging

Die navorsers het ook gewasse wat in die pankreas en die longe groei, vergelyk en gevind dat die samestelling van die interstisiële vloeistof kan verskil op grond van gewasse se ligging in die liggaam en op die plek waar die gewas ontstaan ​​het. Hulle het ook geringe verskille gevind tussen die vloeistof rondom gewasse wat op dieselfde plek gegroei het, maar verskillende genetiese samestelling het, maar die genetiese faktore wat getoets is, het nie so 'n groot impak gehad soos die gewasligging nie.

"Dit sê waarskynlik dat wat bepaal watter voedingstowwe in die omgewing is, sterk gedryf word deur interaksies tussen kankerselle en nie-kankerselle binne die gewas," sê Vander Heiden.

Wetenskaplikes het voorheen ontdek dat daardie nie-kankerselle, insluitend ondersteunende stromale selle en immuunselle, deur kankerselle gewerf kan word om die omgewing rondom die gewas te help herskep om kankeroorlewing en verspreiding te bevorder.

Vander Heiden se laboratorium en ander navorsingsgroepe werk nou aan die ontwikkeling van 'n kultuurmedium wat die samestelling van tumor interstisiële vloeistof nader sal naboots, sodat hulle kan ondersoek of tumorselle wat in hierdie omgewing gekweek word, gebruik kan word om meer akkurate voorspellings te genereer van hoe kankermedisyne sal selle in die liggaam beïnvloed.

The research was funded by the National Institutes of Health, the Lustgarten Foundation, the MIT Center for Precision Cancer Medicine, Stand Up to Cancer, the Howard Hughes Medical Institute, and the Ludwig Center at MIT.


From Bacteria to Breakthrough

Known as CRISPR-Cas9, this technology has led to a breakthrough in genomic engineering. Unlike earlier tools for genome editing, such as zinc-finger nucleases and transcription activator-like effector nucleases (TALENs), the technology makes it much easier and faster for cancer researchers to study mutations identified by The Cancer Genome Atlas and test new therapeutic targets.

You can parallel what CRISPR has done for genome editing with what microarrays have done for gene expression—it’s a vast improvement on the speed and throughput of the technology.

“The primary advantage of CRISPR is its ability to easily edit the genome in a precise fashion. You can parallel what CRISPR has done for genome editing with what microarrays have done for gene expression—it’s a vast improvement on the speed and throughput of the technology, said Ji Luo, Ph.D., of NCI’s Laboratory of Cancer Biology and Genetics.

Lou Staudt, M.D., Ph.D., of NCI’s Center for Cancer Research, called CRISPR-Cas9 a transformative technology that could yield insights into how the cancer cells are wired. “We know that mutated genes form abnormal regulatory networks within the cells, and some aspects of those molecular networks can be just as essential as the gene that is mutated,” he said. “Those regulatory networks can give you new targets for therapy. The promise of this technology is to expand the targets in cancer therapy beyond just those genes that are mutated.”

Jennifer Doudna, Ph.D., of the University of California, Berkeley, and Emmanuelle Charpentier, Ph.D., of Hannover Medical School, Germany, and Umeå University, Sweden, discovered CRISPR when they were studying bacterial immunity.

Bacteria use special sequences in their genome, called clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), to guide a DNA-cutting enzyme called Cas9 to specific sequences of DNA. Bacteria use this system to recognize and destroy foreign DNA, such as attacking viruses. But the system—a DNA-cutting enzyme guided by an RNA molecule to a specific sequence—is exactly the tool needed to make sequence-specific edits in the DNA of a human cell.


Excerpt: 'The Immortal Life of Henrietta Lacks'

The Immortal Life of Henrietta LacksBy Rebecca SklootHardcover, 368 pageskroonList price: $26

The Woman in the Photograph

There's a photo on my wall of a woman I've never met, its left corner torn and patched together with tape. She looks straight into the camera and smiles, hands on hips, dress suit neatly pressed, lips painted deep red. It's the late 1940s and she hasn't yet reached the age of thirty. Her light brown skin is smooth, her eyes still young and playful, oblivious to the tumor growing inside her — a tumor that would leave her five children motherless and change the future of medicine. Beneath the photo, a caption says her name is "Henrietta Lacks, Helen Lane or Helen Larson."

No one knows who took that picture, but it's appeared hundreds of times in magazines and science textbooks, on blogs and laboratory walls. She's usually identified as Helen Lane, but often she has no name at all. She's simply called HeLa, the code name given to the world's first immortal human cells — haar cells, cut from her cervix just months before she died.

Her real name is Henrietta Lacks.

I've spent years staring at that photo, wondering what kind of life she led, what happened to her children, and what she'd think about cells from her cervix living on forever --bought, sold, packaged, and shipped by the trillions to laboratories around the world. I've tried to imagine how she'd feel knowing that her cells went up in the first space missions to see what would happen to human cells in zero gravity, or that they helped with some of the most important advances in medicine: the polio vaccine, chemotherapy, cloning, gene mapping, in vitro fertilization. I'm pretty sure that she — like most of us — would be shocked to hear that there are trillions more of her cells growing in laboratories now than there ever were in her body.

There's no way of knowing exactly how many of Henrietta's cells are alive today. One scientist estimates that if you could pile all HeLa cells ever grown onto a scale, they'd weigh more than 50 million metric tons — an inconceivable number, given that an individual cell weighs almost nothing. Another scientist calculated that if you could lay all HeLa cells ever grown end-to-end, they'd wrap around the Earth at least three times, spanning more than 350 million feet. In her prime, Henrietta herself stood only a bit over five feet tall.

I first learned about HeLa cells and the woman behind them in 1988, thirty-seven years after her death, when I was sixteen and sitting in a community college biology class. My instructor, Donald Defler, a gnomish balding man, paced at the front of the lecture hall and flipped on an overhead projector. He pointed to two diagrams that appeared on the wall behind him. They were schematics of the cell reproduction cycle, but to me they just looked like a neon-colored mess of arrows, squares, and circles with words I didn't understand, like "MPF Triggering a Chain Reaction of Protein Activations."

I was a kid who'd failed freshman year at the regular public high school because she never showed up. I'd transferred to an alternative school that offered dream studies instead of biology, so I was taking Defler's class for high-school credit, which meant that I was sitting in a college lecture hall at sixteen with words like mitose en kinase inhibitors flying around. I was completely lost.

"Do we have to memorize everything on those diagrams?" one student yelled.

Yes, Defler said, we had to memorize the diagrams, and yes, they'd be on the test, but that didn't matter right then. What he wanted us to understand was that cells are amazing things: There are about one hundred trillion of them in our bodies, each so small that several thousand could fit on the period at the end of this sentence. They make up all our tissues — muscle, bone, blood — which in turn make up our organs.

Under the microscope, a cell looks a lot like a fried egg: It has a white (the sitoplasma) that's full of water and proteins to keep it fed, and a yolk (the kern) that holds all the genetic information that makes you jy. The cytoplasm buzzes like a New York City street. It's crammed full of molecules and vessels endlessly shuttling enzymes and sugars from one part of the cell to another, pumping water, nutrients, and oxygen in and out of the cell. All the while, little cytoplasmic factories work 24/7, cranking out sugars, fats, proteins, and energy to keep the whole thing running and feed the nucleus. The nucleus is the brains of the operation inside every nucleus within each cell in your body, there's an identical copy of your entire genome. That genome tells cells when to grow and divide and makes sure they do their jobs, whether that's controlling your heartbeat or helping your brain understand the words on this page.

Defler paced the front of the classroom telling us how mitosis — the process of cell division — makes it possible for embryos to grow into babies, and for our bodies to create new cells for healing wounds or replenishing blood we've lost. It was beautiful, he said, like a perfectly choreographed dance.

All it takes is one small mistake anywhere in the division process for cells to start growing out of control, he told us. Net een enzyme misfiring, just een wrong protein activation, and you could have cancer. Mitosis goes haywire, which is how it spreads.

"We learned that by studying cancer cells in culture," Defler said. He grinned and spun to face the board, where he wrote two words in enormous print: HENRIETTA LACKS.

Henrietta died in 1951 from a vicious case of cervical cancer, he told us. But before she died, a surgeon took samples of her tumor and put them in a petri dish. Scientists had been trying to keep human cells alive in culture for decades, but they all eventually died. Henrietta's were different: they reproduced an entire generation every twenty-four hours, and they never stopped. They became the first immortal human cells ever grown in a laboratory.

"Henrietta's cells have now been living outside her body far longer than they ever lived inside it," Defler said. If we went to almost any cell culture lab in the world and opened its freezers, he told us, we'd probably find millions — if not billions — of Henrietta's cells in small vials on ice.

Her cells were part of research into the genes that cause cancer and those that suppress it they helped develop drugs for treating herpes, leukemia, influenza, hemophilia, and Parkinson's disease and they've been used to study lactose digestion, sexually transmitted diseases, appendicitis, human longevity, mosquito mating, and the negative cellular effects of working in sewers. Their chromosomes and proteins have been studied with such detail and precision that scientists know their every quirk. Like guinea pigs and mice, Henrietta's cells have become the standard laboratory workhorse.

"HeLa cells were one of the most important things that happened to medicine in the last hundred years," Defler said.

Then, matter-of-factly, almost as an afterthought, he said, "She was a black woman." He erased her name in one fast swipe and blew the chalk from his hands. Class was over.

As the other students filed out of the room, I sat thinking, That's it? That's all we get? There has to be more to the story.

I followed Defler to his office.

"Where was she from?" I asked. "Did she know how important her cells were? Did she have any children?"

"I wish I could tell you," he said, "but no one knows anything about her."

After class, I ran home and threw myself onto my bed with my biology textbook. I looked up "cell culture" in the index, and there she was, a small parenthetical:

In culture, cancer cells can go on dividing indefinitely, if they have a continual supply of nutrients, and thus are said to be "immortal." A striking example is a cell line that has been reproducing in culture since 1951. (Cells of this line are called HeLa cells because their original source was a tumor removed from a woman named Henrietta Lacks.)

That was it. I looked up HeLa in my parents' encyclopedia, then my dictionary: No Henrietta.

As I graduated from high school and worked my way through college toward a biology degree, HeLa cells were omnipresent. I heard about them in histology, neurology, pathology I used them in experiments on how neighboring cells communicate. But after Mr. Defler, no one mentioned Henrietta.

When I got my first computer in the mid-nineties and started using the Internet, I searched for information about her, but found only confused snippets: most sites said her name was Helen Lane some said she died in the thirties others said the forties, fifties, or even sixties. Some said ovarian cancer killed her, others said breast or cervical cancer.

Eventually I tracked down a few magazine articles about her from the seventies. Ebony quoted Henrietta's husband saying, "All I remember is that she had this disease, and right after she died they called me in the office wanting to get my permission to take a sample of some kind. I decided not to let them." Straal said the family was angry — angry that Henrietta's cells were being sold for twenty-five dollars a vial, and angry that articles had been published about the cells without their knowledge. It said, "Pounding in the back of their heads was a gnawing feeling that science and the press had taken advantage of them."

The articles all ran photos of Henrietta's family: her oldest son sitting at his dining room table in Baltimore, looking at a genetics textbook. Her middle son in military uniform, smiling and holding a baby. But one picture stood out more than any other: in it, Henrietta's daughter, Deborah Lacks, is surrounded by family, everyone smiling, arms around each other, eyes bright and excited. Except Deborah. She stands in the foreground looking alone, almost as if someone pasted her into the photo after the fact. She's twenty-six years old and beautiful, with short brown hair and catlike eyes. But those eyes glare at the camera, hard and serious. The caption said the family had found out just a few months earlier that Henrietta's cells were still alive, yet at that point she'd been dead for twenty-five years.

All of the stories mentioned that scientists had begun doing research on Henrietta's children, but the Lackses didn't seem to know what that research was for. They said they were being tested to see if they had the cancer that killed Henrietta, but according to the reporters, scientists were studying the Lacks family to learn more about Henrietta's cells. The stories quoted her son Lawrence, who wanted to know if the immortality of his mother's cells meant that he might live forever too. But one member of the family remained voiceless: Henrietta's daughter, Deborah.

As I worked my way through graduate school studying writing, I became fixated on the idea of someday telling Henrietta's story. At one point I even called directory assistance in Baltimore looking for Henrietta's husband, David Lacks, but he wasn't listed. I had the idea that I'd write a book that was a biography of both the cells and the woman they came from — someone's daughter, wife, and mother.

I couldn't have imagined it then, but that phone call would mark the beginning of a decadelong adventure through scientific laboratories, hospitals, and mental institutions, with a cast of characters that would include Nobel laureates, grocery store clerks, convicted felons, and a professional con artist. While trying to make sense of the history of cell culture and the complicated ethical debate surrounding the use of human tissues in research, I'd be accused of conspiracy and slammed into a wall both physically and metaphorically, and I'd eventually find myself on the receiving end of something that looked a lot like an exorcism. I did eventually meet Deborah, who would turn out to be one of the strongest and most resilient women I'd ever known. We'd form a deep personal bond, and slowly, without realizing it, I'd become a character in her story, and she in mine.

Deborah and I came from very different cultures: I grew up white and agnostic in the Pacific Northwest, my roots half New York Jew and half Midwestern Protestant Deborah was a deeply religious black Christian from the South. I tended to leave the room when religion came up in conversation because it made me uncomfortable Deborah's family tended toward preaching, faith healings, and sometimes voodoo. She grew up in a black neighborhood that was one of the poorest and most dangerous in the country I grew up in a safe, quiet middle-class neighborhood in a predominantly white city and went to high school with a total of two black students. I was a science journalist who referred to all things supernatural as "woo-woo stuff" Deborah believed Henrietta's spirit lived on in her cells, controlling the life of anyone who crossed its paths. Including me.

"How else do you explain why your science teacher knew her real name when everyone else called her Helen Lane?" Deborah would say. "She was trying to get your attention." This thinking would apply to everything in my life: when I married while writing this book, it was because Henrietta wanted someone to take care of me while I worked. When I divorced, it was because she'd decided he was getting in the way of the book. When an editor who insisted I take the Lacks family out of the book was injured in a mysterious accident, Deborah said that's what happens when you piss Henrietta off.

The Lackses challenged everything I thought I knew about faith, science, journalism, and race. Ultimately, this book is the result. It's not only the story of HeLa cells and Henrietta Lacks, but of Henrietta's family — particularly Deborah — and their lifelong struggle to make peace with the existence of those cells, and the science that made them possible.

Excerpted from The Immortal Life of Henrietta Lacks by Rebecca Skloot Copyright 2010 by Rebecca Skloot. Excerpted by permission of Crown, a division of Random House Inc. All rights reserved.