Inligting

7.12: Gereedskap van Genetiese Ingenieurswese - Biologie

7.12: Gereedskap van Genetiese Ingenieurswese - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

7.12: Gereedskap van Genetiese Ingenieurswese

Top 4 gereedskap van genetiese ingenieurswese

Die skepping van genomiese biblioteek behels kloning van hele genomiese DNA. Daarom is 'n genomiese biblioteek 'n versameling van rekombinante DNS-molekule (plasmiede, fage) sodat die somtotaal van DNS-insetsels in hierdie versameling die hele genoom van die organisme verteenwoordig. Afhangende van die grootte van genoom, prokarioties of eukarioties, kan vektor gekies word. Op hierdie manier kan die hele genoom in stukke gesny en in vektore of deur PCR-tegniek gekloon word. Dit kan na verwys word as genomiese kloning.

Die maak van genomiese biblioteek sluit die volgende stappe in:

1. Isolasie van chromosomale DNA

2. Fragmentasie van DNA word uitgevoer deur meganiese skeer of sonikasie of deur 'n geskikte endonuklease te gebruik vir gedeeltelike vertering van DNA (Fig. 15.1). Meganiese skeerwerk genereer stomp punte terwyl endonuklease samehangende punte produseer. Volledige vertering word vermy aangesien dit fragmente genereer wat te heterogeen in grootte is om gebruik te word.

3. Ligering van DNA-fragmente- Die gedeeltelike vertering van genomiese DNA word aan agarosegelelektroforese onderwerp vir skeiding van fragmente van vereiste grootte. Die fragmente van toepaslike grootte word uit gel geëlueer. Hierdie fragmente word dan in 'n geskikte vektor ingevoeg. Hierdie vektore word met dieselfde beperkingsensieme gesny. Daarna word die DNA-fragmente met behulp van DNA-ligase in vektor geligeer (Fig. 15.2). Deur hierdie tegniek kan ongeveer 25kb DNA-fragmente in vektore ingevoeg word.

4. Identifikasie van die verlangde kloon- Identifikasie van die bakteriese kolonie wat die verlangde DNA-fragment bevat deur 'n geskikte hibridisasie-probe in kolonie-hibridisasie te gebruik. Die sonde kan mRNA van die geen, cDNA van sy mRNA, homoloë geen van 'n ander organisme wees, of 'n sintetiese oligonukleotied wat die volgorde van 'n deel van die verlangde geen/DNA-fragment verteenwoordig. Om hibridisasie op te spoor moet die sonde gewoonlik met 'n radio-gemerkte isotoop gemerk word.

Alternatiewe vektorstelsels vir die maak van genomiese biblioteek:

Vir prokariote (kleiner genome) lewensvatbaar om geenbiblioteke in plasmiede te maak. Plasmied voeg gewoonlik -5-10 kb in, dus benodig slegs 'n paar duisend rekombinante vir 'n verteenwoordigende biblioteek. Eukariote (groter genome), het regtig vektore nodig wat baie groter insetsel-DNS-fragmente kan hou (Tabel 15.1).

Bakteriofage lambda toon baie meer doeltreffende infeksie van E. coli as wat deur plasmiedtransformasie bereik kan word. Faag lambda bind aan reseptore op die oppervlak van E. coli en spuit DNA in. Infeksie deur lambda is baie meer doeltreffend as plasmied transformasie – kan kry

10 9 plate per mikrogram DNA, vs

10 6 kolonies per mikrogram plasmied DNA.

Soos die bakteriese selle liseer, vorm 'n gedenkplaat, wat versprei soos meer selle besmet raak en liseer. Die gedenkplaat bevat die aansteeklike virale deeltjies of virions en elkeen verteenwoordig 'n individuele lambda-kloon (soortgelyk aan 'n bakteriese kolonie wat 'n individuele plasmiedkloon verteenwoordig).

Die voorkoms is van 'n duidelike sirkel in 'n ‘wolk’ van bakteriële selle (die bakteriese ‘grasperk’) (Fig. 15.3). As dit vir lang tydperke geïnkubeer word, sal hierdie sirkels aanhou groei (wat meer en meer virale deeltjies bevat) en versprei totdat alle bakteriese selle uitgewis is. Om 'n enkele lambda-kloon te kies, word die gedenkplaat ‘gepons’ uit die agarplaat en gestoor in 'n houoplossing. Dit kan dan gebruik word om meer bakteriese selle te infekteer en om meer van die rekombinante lambda DNA te repliseer.

Vektore vir die maak van biblioteke met groter insetsels:

Kosmiedbiblioteke word gebruik vir die kloning van gene met groot introne en vir die volgordebepaling van groter stukke van die genoom. Kosmied vektore is basters van plasmied en bakteriofaag lambda λ DNA ('n klein

5 kb plasmied wat die plasmied oorsprong van replikasie (ori), 'n antibiotika weerstand geen soos amp en 'n geskikte beperking plek vir kloning saam met die COS volgorde van faag λ DNA bevat. As gevolg van die COS-volgorde, kan kosmied-rekombinante in virale deeltjies verpak word (wat hoë doeltreffendheid transformasie moontlik maak).

Aangesien die meeste van Genomiese biblioteke in kosmied vektor, die λ DNA weggegooi is kan dit vervang word deur die DNA van belang, solank dit nie die 50 kb limiet vir verpakking in die virale kop oorskry nie. Die insetselgroottes is van die orde van 35-45 kb. Aangesien die rekombinante DNA nie vir enige lambda-proteïene kodeer nie, vorm kosmiede nie virale deeltjies (of plate) nie, maar vorm eerder groot sirkelvormige plasmiede en die kolonies wat ontstaan ​​kan op antibiotiese plate geselekteer word, soos ander plasmied DNA-transformante.

Kosmiedklone kan op soortgelyke wyse gemanipuleer word, wat die gemak van plasmiedisolasie moontlik maak. Aangesien baie eukariotiese gene in die orde van 30 – 40 kb is, word die waarskynlikheid dat 'n DNA-kloon wat die hele geenvolgorde bevat, aansienlik verhoog wanneer 'n kosmiedbiblioteek gebruik word.

YAC-biblioteke word gebruik vir die kloning van baie groot DNA-fragmente (van meer as 1 Mb), en is nuttig vir die kloning van groot gene (soos die 250 kb sistiese fibrose-geen) en vir die skep van biblioteke van groot oorvleuelende klone, soos vir individuele chromosome wat geïsoleer is. van organismes (chromosomale biblioteke). Dit is wyd gebruik vir die kartering van genome van komplekse organismes (bv. Homo sapiens).

YAC's is gis kunsmatige chromosome en is basters van bakteriële plasmied DNA en gis DNA. Die komponente wat benodig word vir replikasie/segregasie van natuurlike gischromosome is gekombineer met E. coli plasmied DNA. YACs word in die gis Saccharomomyces cerevesiae gekweek en bevat dus kiesbare merkers wat geskik is vir die gasheerstelsel. Eerder as antibiotika seleksie, maak gis selekteerbare merkers groei van die transformant moontlik op selektiewe media wat nie spesifieke voedingstowwe het nie. (Nie-transformante kan nie groei nie). Die gisrasse wat gebruik word, is outotroof – dit wil sê, hulle is nie in staat om 'n spesifieke verbinding te maak nie.

Byvoorbeeld, Trpl mutante kan’t maak triptofaan so kan net groei op media aangevul met triptofaan. As die mutantstam getransformeer word met 'n YAC wat 'n ongeskonde Trpl-geen bevat, sal dit kompenseer vir die onaktiewe geen (komplement) en die getransfekteerde sel kan groei op media wat triptofaan ontbreek.

YAC's word nie meer so omvattend gebruik nie as gevolg van inherente probleme. YAC-klone kan byvoorbeeld nie-aangrensende segmente van die genoom bevat. Dit beteken dat 2 of meer DNA-fragmente van afsonderlike dele van die genoom in 'n individuele YAC geïntegreer kan word (omdat hulle in staat is om taamlik groot insetsels te ondersteun). 'n Tweede probleem is dat YAC's onstabiel is en gereeld dele van die DNA tydens voortplanting verloor.

BAC-biblioteke word ook gebruik vir die kloning van baie groot DNA-fragmente en was veral nuttig vir die volgordebepaling van groot genome. BAC's is bakteriële kunsmatige chromosome, en is gebaseer op 'n natuurlik voorkomende groot bakteriële plasmied, die F-faktor. BAC-vektore kan DNS-inserts tot 300 kb akkommodeer, steeds redelik gerespekteer wanneer groot gene gekloon moet word of komplekse genome moet karteer en volgorde. BAC's het verskeie voordele bo YAC's, wat beteken dat hulle nou meer omvattend gebruik word. Die meeste van die menslike genoom is georden met behulp van BAC eerder as YAC klone.

Gereedskap # 2. cDNA en cDNA Lbiblioteek:

Komplementêre DNA (cDNA) is sintetiese DNA wat van mRNA gemaak word met die gebruik van 'n spesiale ensiem genaamd omgekeerde transkriptase (RNA-afhanklike DNA-polimerase wat in 1970 deur Temin en Baltimore ontdek is). Oorspronklik is hierdie ensiem van reterovirusse geïsoleer. Hierdie ensiem voer soortgelyke reaksies as DNA-polimerase uit en benodig 'n onderlaag met 'n vrye 3′ OH-terminaal. Met die gebruik van 'n mRNA as 'n templaat sintetiseer omgekeerde transkriptase 'n enkelstring-DNS-molekule wat dan as templaat vir dubbelstring-DNS gebruik kan word (Fig. 15.4). Omdat dit van mRNA gemaak word, is cDNA sonder beide stroomop en stroomaf regulatoriese volgordes en van introne.

Dit beteken dat cDNA van eukariote vertaal kan word in funksionele proteïen in bakterieë, 'n belangrike kenmerk wanneer eukariotiese gene in bakteriële gasheer uitgedruk word. 'n Kort oligo (dT) ketting word gehibridiseer met die poli (A) stert van mRNA string. Die oligo (dT) segment dien as 'n primer vir die werking van omgekeerde transkriptase, wat die mRNA as templaat vir die sintese van cDNA-string gebruik. Die gevolglike cDNA eindig in 'n haarnaaldlus. Wanneer die mRNA, van RNA-DNA baster, afgebreek is deur behandeling met NaOH of RNase H, word 'n kort stukkie RNA agtergelaat. Hierdie haarpenlus word 'n onderlaag vir DNA-polimerase I, wat die gepaarde DNA-string voltooi.

Die lus word dan deur SI-nuklease (wat slegs op die enkelstrengs lus inwerk) gekloof om 'n dubbelstrengs cDNA-molekule te produseer. Hierdie dubbelstring-DNS kan ingevoeg word in plasmied-, kosmied-, faag-lambda-, kloningsvektore deur stomp-einde ligasie.

'n cDNA-biblioteek is 'n populasie van bakteriële transforrante of faag-lisate waarin elke mRNA wat uit 'n organisme of weefsel geïsoleer is, voorgestel word as sy cDNA-invoeging in 'n plasmied of 'n faagvektor. Die frekwensie van spesifieke cDNA in so 'n biblioteek sal afhang van die frekwensie van die betrokke mRNA in daardie weefsel.

Gereedskap # 3. Ontleding van gene en geentranskripsies:

Rekombinante DNA-tegnologie behels lokalisering van geen van belang. Hierdie geen kan óf geïsoleer óf gesintetiseer word voordat dit gemanipuleer word en gebruik word vir transformasie wat lei tot die produksie van transgeniese plante en diere. Verskillende tegnieke is gebruik vir isolasie van verskillende variëteite van gene soos ribosomale RNA geen, geen vir fenotipiese eienskappe met onbekende geenproduk, vir spesifieke proteïenprodukte, en gene betrokke by regulatoriese funksies, bv. promotor gene ens.

Isolasie van Ribosomale RNA-gene:

Die ribosomale RNA maak die 80% van die totale RNA en word gesintetiseer op ribosomale geen wat geïsoleer kan word. Isolasie van hierdie geen was maklik as gevolg van sekere kenmerke kenmerke van rRNA (a) ribomsomale gene is teenwoordig in veelvuldige kopieë (b) verskil tussen ribosomale gene en ander gene, as gevolg van hul relatief hoë G + C inhoud in rRNA. Die ribosomale geen is vir die eerste keer in 1965 deur H. Wallace en M.L. Birnstiel in 'n amfibie genaamd Xenopus.

Die verskillende stappe betrokke by isolasie van rRNA-gene is die volgende:

1. rRNA word uit die ribosome geïsoleer en word radio-gemerk gemaak deur hulle toe te laat om te repliseer in getritieerde uridienbevattende medium.

2. Ribosomale DNA word geïsoleer deur digtheidsgradiënt sentrifugering (hoë G+C inhoud van rDNA maak dit maklik om dit te skei deur sentrifugering van res van DNA) gevolg deur die denaturering daarvan.

3. Enkelstrengs DNA word dan op filtreerpapier vasgemaak en gemerkte RNA word by die papier gevoeg.

4. Nou vind DNA- en RNA-hibridisasie plaas en oortollige gemerkte RNA word afgewas.

5. Radioaktiwiteit word gemeet en dupleksbaster wat by denaturering enkelstrengs DNA sal gee wat dubbelstrengs gemaak kan word. Dit is hoe rRNA geen geïsoleer kan word.

Isolasie van geen van spesifieke proteïene:

Dit is moontlik deur die gebruik van ensiem-omgekeerde transkriptase. Hierdie ensiem kan kopie/komplementêre DNA (cDNA) van RNA maak. Dit is dus nodig dat tegnieke vir isolasie van mRNA beskikbaar moet wees.

Die verskillende stappe betrokke is die volgende:

1. Proteïenproduk van die geen word gesuiwer.

2. Teenliggaampies word teen hierdie proteïenprodukte geproduseer deur diere soos konyn en muis te immuniseer.

3. Presipitasie van polisome word gedoen wat besig is met die sintetisering van spesifieke proteïene. Dit word gedoen met behulp van teenliggaampies wat geproduseer word.

4. mRNA word uit die polisoomfraksies geïsoleer en gesuiwer. Hierdie mRNA word gebruik vir die sintetisering van cDNA.

5. Hierdie cDNA word dan in kloningsvektore ingevoeg vir voorbereiding van cDNA-biblioteek. Daarna word immunologiese en elektroforetiese ontleding van die translasieprodukte van cDNA-klone gedoen, om die spesifieke cDNA-kloon te identifiseer, met geen vir spesifieke proteïen van belang.

6. Spesifieke cDNA-probes word dan geselekteer vir identifikasie en isolasie van die geen vanaf genomiese DNA deur middel van sifting van 'n volledige of gedeeltelike genomiese biblioteek.

Isolasie van geen van onbekende produkte (met weefselspesifieke uitdrukking):

Dit is maklik om die geneprodukte wat weefselspesifiek is, te isoleer. Byvoorbeeld, gene vir stoorproteïene word slegs in ontwikkelende sade uitgedruk, globien-geen word in eritrosiete uitgedruk. Sulke gene kan maklik geïsoleer word omdat mRNA wat uit sulke weefsel onttrek word grootliks van geen van belang sal wees. Ander mRNA kan uitgeskakel word, wat geïdentifiseer kan word deur isolasie en vergelyking van mRNA uit die weefsel waar hierdie geen nie uitgedruk word nie. Dan word hierdie geïsoleerde mRNA gebruik vir sintese van cDNA deur ensiem-omgekeerde transkriptase te gebruik. Dan is die proses dieselfde as beskryf in isolasie van gene wat vir bekende spesifieke proteïene kodeer.

Isolasie van gene deur gebruik te maak van DNA- en RNA-probes:

As die spesifieke molekulêre probes (DNA en RNA probes) beskikbaar is, kan dit gebruik word vir isolasie van spesifieke gene. Hierdie probes kan óf van 'n ander plantspesie verkry word óf kan kunsmatig gesintetiseer word deur 'n deel van die aminosuurvolgorde van die proteïenproduk van die geen van belang te gebruik. Die probes wat van een plantspesie verkry word en vir 'n ander plantspesie gebruik word, word heteroloë probes genoem.

Daar is gevind dat hierdie heteroloë probes effektief is in die identifisering van geenklone tydens koloniehibridisasie of plaakhibridisasie of op suidelike klad. Byvoorbeeld, die geen vir chalcone sintase is geïsoleer vanaf Antirrhinum majus en Petunia hybrida deur gebruik te maak van heteroloë sonde van parsely. Heteroloë probes word gewoonlik saam met die cDNA-biblioteek gebruik.

Nou met ons kennis van die sintetisering van cDNA-probes, kan hierdie probes nuttig wees in die sintese van sintetiese probes. In hierdie prosedure word die gesuiwerde proteïen met behulp van die tweedimensionele gelelektroforese gebruik vir mikro-volgordebepaling van 5-15 opeenvolgende aminosure, hierdie inligting kan gebruik word vir die sintese van ooreenstemmende oligonukleotiede met behulp van outomatiese DNA-sintetiseerders. Hierdie oligonukleotiede kan dan direk gebruik word vir sifting van cDNA of genomiese biblioteek vir isolasie van geen van belang.

Gereedskap # 4. Kolonieverbastering:

Koloniehibridisasie is die sifting van 'n biblioteek met 'n gemerkte sonde (radioaktief, bioluminescent, ens.) om 'n spesifieke volgorde van DNA, RNA, ensiem, proteïen of teenliggaampie te identifiseer (Fig. 15.5).

Hibridisering het twee belangrike kenmerke:

1. Hibridiseringsreaksies is spesifieke probes wat slegs bind aan plekke wat komplimentêre volgordes het.

2. Hibridiseringsreaksies vind plaas in die teenwoordigheid van groot hoeveelhede molekules wat soortgelyk is maar nie identies aan die plek is nie. Dit beteken 'n sonde kan een molekule teiken in 'n mengsel van miljoene verwante maar nie-komplementêre molekules vind.

Hierdie spesifisiteit laat 'n mens toe om 'n spesifieke volgorde te vind in 'n komplekse mengsel vol soortgelyke rye. 'n Hibridiseringstegniek stel wetenskaplikes ook in staat om die molekule van belang uit baie komplekse mengsels te kies en die molekule op sy eie te bestudeer.

Metode van Kolonieverbasing:

Die volgende stappe word vereis:

1. Isoleer en groei kulture in 'n geskikte medium (agar).

2. Dra 'n monster van die kolonies oor op 'n soliede matriks soos 'n nitrosellulose of nylonmembraan.

3. Die selle op die membraan word gelys en die DNA word dan gedenatureer.

4. 'n Gemerkte probe word by die matriks gevoeg en hibridisasie vind plaas.

5. Die matriks word gespoel om die nie-gehibridiseerde sondemolekules te verwyder.

6. Vir radioaktiewe probes word outoradiografie gebruik en die matriks word op X-straalfilm geplaas.

7. Die film word waargeneem vir swart kolle wat ooreenstem met kolonies wat met die sonde gehibridiseer het.

8. Vergelyk die X-straalfilm met die meesterplaat om te sien watter kolonies proefhibridisasie gehad het. Dit is die kolonies wat die spesifieke volgorde bevat het wat eintlik met die sonde gehibridiseer het.

9. Kolonies op die meesterplaat wat die verlangde volgorde het, kan dan sub-gekweek word indien verlang.

Voordele:

1. Laat jou toe om een ​​molekule van belang uit miljoene te kies.

2. Vereis nie die isolasie van nukleïensure nie.

3. Dit is moontlik om mikroörganismes wat die gehybridiseerde volgorde bevat, te kweek en te identifiseer.

Nadele:

1. Tydrowend, neem tyd vir kolonies om te inkubeer en vir die verbastering om op die X-straalfilm te wys.

2. Wanneer mikroörganismes geïdentifiseer word, sal die prosedure slegs werk as die organismes sal groei en 'n waarneembare kolonie vorm.


Hier is 'n lys van 'n genetiese ingenieur se molekulêre gereedskap/ensieme wat die meeste in genetiese ingenieurswese eksperimente gebruik word:

1. Polimerase kettingreaksie (PCR)

Polimerase kettingreaksie (PCR) is die proses om veelvuldige kopieë van die gene van belang te repliseer. Die ontdekking van termostabiele DNA-polimerases, soos Taq Polimerase, het dit moontlik gemaak om DNA-replikasie in die laboratorium te manipuleer. Dit versterk die hoeveelhede DNA-segmente. Primers word gebruik om die geen van belang te identifiseer en dit te herhaal. Hierdie kopieë kan dan geskei en gesuiwer word met behulp van gelelektroforese.

2. Beperkingsensieme (molekulêre skêr)

Die ontdekking van ensieme bekend as beperking-endonukleases was noodsaaklik vir proteïen-ingenieurswese. Op grond van die nukleotiedvolgorde sny hierdie ensieme DNA op spesifieke plekke. DNA wat met 'n beperkingsensiem gesny is, produseer baie kleiner fragmente van verskillende groottes. Dit kan geskei word met behulp van gelelektroforese of chromatografie.

3. Gel Elektroforese

Om DNA van selkultuur te suiwer, of dit te sny deur gebruik te maak van beperkingsensieme, sou nie veel nut wees as ons nie die DNS kon visualiseer nie. Gelelektroforese help om die grootte en tipe DNA wat met PCR en beperkingsensieme onttrek word, te visualiseer. Dit word ook gebruik om DNS-invoegings en uitkloppe op te spoor.

4. DNA Ligase

DNA-ligase kan kovalente bindings tussen nukleotiedkettings skep. Dit word gedoen om rekombinante stringe te skep of 'n sirkelvormige string te sluit wat deur beperkingsensieme gesny is. Die ensieme DNA-polimerase I en polinukleotiedkinase is ook belangrik om onderskeidelik gapings in te vul of die 5'-punte te fosforileer.

5. Plasmiede

Plasmiede is klein, sirkelvormige stukkies DNA wat nie deel van die bakteriese genoom is nie, maar in staat is tot selfreplikasie. Dit word as vektore gebruik om gene tussen mikroörganismes te vervoer. Sodra die geen van belang met PCR geamplifiseer is, word die geen en plasmied deur beperkingsensieme gesny en saam gelig. Die gevolglike kombinasie staan ​​bekend as Rekombinante DNA. Virale (bakteriofaag) DNA kan ook as 'n vektor gebruik word, net soos kosmiede, wat rekombinante plasmiede is wat bakteriofaaggene bevat.

6. Transformasie/Transduksie

Transformasie is die proses om genetiese materiaal in 'n vektor, soos 'n plasmied, na gasheerselle oor te dra. Die gasheerselle word blootgestel aan 'n omgewingsverandering, soos elektroporasie, wat hulle "bevoeg" of tydelik deurlaatbaar maak vir die vektor. Hoe groter die plasmied, hoe laer is die doeltreffendheid waarmee dit deur selle opgeneem word.

Groter DNA-segmente word makliker gekloon met behulp van bakteriofaag, retrovirus of ander virale vektore of kosmiede in 'n metode genaamd Transduksie. Faag- of virale vektore word dikwels in regeneratiewe medisyne gebruik, maar kan die invoeging van DNA in dele van ons chromosome veroorsaak waar ons dit nie wil hê nie, wat komplikasies en selfs kanker veroorsaak.

7. Identifisering van transgeniese organismes

Nie alle selle sal DNA tydens transformasie opneem nie. Daarom is dit noodsaaklik om die selle te identifiseer wat 'n transformasie ondergaan en die wat nie het nie. Oor die algemeen dra plasmiede gene vir antibiotiese weerstand, en transgeniese selle kan gekies word op grond van die uitdrukking van daardie gene en hul vermoë om te groei op media wat daardie antibiotika bevat. Alternatiewe metodes van seleksie hang af van die teenwoordigheid van ander verslaggewerproteïene soos die x-gal/lacZ stelsel, of groen fluoressensie proteïen, wat keuse moontlik maak gebaseer op kleur en fluoressensie, onderskeidelik.


Toepassings van Genetiese Ingenieurswese [Terug na bo]

Hierdie afdeling bevat bykomende inligting wat nie direk by AS Biology ingesluit is nie. Dit kan egter nuttig wees om GE-tegnieke te ondersteun en te konsolideer.

Ons het nou gekyk na sommige van die vele tegnieke wat deur genetiese ingenieurs gebruik word. Wat kan met hierdie tegnieke gedoen word? Verreweg die meeste toepassings is steeds as navorsingsinstrumente, en die tegnieke hierbo help genetici om komplekse genetiese stelsels te verstaan. Ten spyte van al die ophef, het genetiese ingenieurswese steeds baie min suksesvolle kommersiële toepassings, hoewel dit elke jaar toeneem. Die aansoeke tot dusver kan nuttig in drie groepe oorweeg word.

gebruik van geneties gemodifiseerde organismes (gewoonlik mikrobes) om chemikalieë te produseer, gewoonlik vir mediese of industriële toepassings.

gebruik van geentegnologie om die eienskappe van organismes (gewoonlik plaasdiere of gewasse) te verander

gebruik van geentegnologie op mense om 'n siekte te behandel

Gene produkte [Terug na bo]

Die grootste en suksesvolste soort genetiese ingenieurswese is die vervaardiging van geenprodukte. Hierdie produkte is van mediese, landbou- of kommersiële waarde. Hierdie tabel toon 'n paar van die voorbeelde van geneties gemanipuleerde produkte wat reeds beskikbaar is.

menslike hormoon wat gebruik word om diabetes te behandel

menslike groeihormoon, wat gebruik word om dwerggroei te behandel

beesgroeihormoon, wat gebruik word om melkopbrengs van koeie te verhoog

menslike bloedstollingsfaktor, wat gebruik word om hemofilie te behandel

anti-bloedstollingsmiddel wat in chirurgie gebruik word

antibiotika, wat gebruik word om bakterieë dood te maak

hepatitis B-antigeen, vir inenting

ensiem wat gebruik word om sistiese fibrose en emfiseem te behandel

ensiem wat gebruik word om Pompe se siekte te behandel

ensiem wat gebruik word in die vervaardiging van kaas

ensiem wat in papierproduksie gebruik word

Die produkte is meestal proteïene, wat direk geproduseer word wanneer 'n geen uitgedruk word, maar dit kan ook nie-proteïenprodukte wees wat deur geneties gemanipuleerde ensieme geproduseer word. Die basiese idee is om 'n geen (dikwels mens) na 'n ander gasheerorganisme (gewoonlik 'n mikrobe) oor te dra sodat dit die geenproduk vinnig, goedkoop en eties sal maak. Dit is ook moontlik om ontwerperproteïene te maak deur geenvolgordes te verander, maar hoewel dit 'n nuttige navorsingsinstrument is, is daar nog geen kommersiële toepassings nie.

Aangesien die eindproduk net 'n chemiese stof is, kan in beginsel enige soort organisme gebruik word om dit te produseer. Verreweg die mees algemene groep gasheerorganismes wat gebruik word om geenprodukte te maak, is die bakterieë, aangesien hulle vinnig gegroei kan word en die produk uit hul selle gesuiwer kan word. Ongelukkig kan bakterieë nie altyd menslike proteïene maak nie, en onlangs is diere en selfs plante ook gebruik om geenprodukte te maak. In geen van die gevalle is dit gepas om die produk uit hul selle te onttrek nie, dus by diere moet die produk in melk of urine afgeskei word, terwyl die produk by plante van die wortels afgeskei moet word. Hierdie tabel toon sommige van die voordele en nadele van die gebruik van verskillende organismes vir die produksie van geneties-gemanipuleerde geenprodukte.

Geen kern so DNA maklik om te verander het plasmiede klein genoom genetika goed verstaan ​​ongeslagtelike so kan klein gekloon word en vinnig groeiende maklik om kommersieel te groei in fermenteerders sal goedkoop koolhidrate gebruik min etiese probleme.

Kan nie introne splits nie, geen post-translasionele modifikasie klein geengrootte nie

Kan splice introns kan post-translasie modifikasies kan groot gene aanvaar

Het nie plasmiede nie (behalwe gis) wat dikwels diploïed is, so twee kopieë van gene moet dalk ingevoeg word beheer van uitdrukking wat nie goed verstaan ​​word nie.

Ongeslagtelike kan dus haploïed gekloon word, so slegs een kopie wat nodig is, kan in kuipe gekweek word

Kan nie altyd dieregeneprodukte maak nie

Fotosintetiese so het nie veel voeding nodig nie, kan uit enkelselle gekloon word produkte kan van wortels of in sap afgeskei word.

Selwande wat moeilik is om te penetreer deur vektor stadig groei, moet in velde meersellig gekweek word

Dit is waarskynlik dat produkte van menslike proteïene in melk of urine afgeskei kan word

Meersellige stadig groeiend

Ons sal 'n paar voorbeelde in detail kyk

Menslike insulien [Terug na bo]

Insulien is 'n klein proteïenhormoon wat deur die pankreas geproduseer word om die bloedsuikerkonsentrasie te reguleer. In die siekte insulienafhanklike diabetes die pankreas selle produseer nie genoeg insulien nie, wat vermorsingsimptome en uiteindelik die dood veroorsaak. Die siekte kan suksesvol behandel word deur inspuiting van insulien wat uit die pankrease van geslagte koeie en varke onttrek word. Die insulien van hierdie spesies het egter 'n effens ander aminosuurvolgorde as menslike insulien en dit kan lei tot immuunverwerping en newe-effekte.

Die menslike insuliengeen is in die 1970's geïsoleer, gekloon en georden, en so het dit moontlik geword om hierdie geen in bakterieë in te voeg, wat dan menslike insulien in groot hoeveelhede kon produseer. Ongelukkig was dit nie so eenvoudig nie. By mense maak pankreas selle eers pro-insulien, wat dan post-translasie-modifikasie ondergaan om die finale, funksionele insulien te maak. Bakteriese selle kan nie post-translasionele modifikasie doen nie. Uiteindelik is 'n sintetiese cDNA geen gemaak en in die bakterie geplaas E coli, wat pro-insulien gemaak het, en die post-translasie-omskakeling na insulien is chemies uitgevoer. Hierdie tegniek is in 1982 deur Eli Lilly and Company ontwikkel en die produk, humulin , het die eerste geneties-gemanipuleerde produk geword wat vir mediese gebruik goedgekeur is.

In die 1990's is die prosedure verbeter deur die gis te gebruik Saccharomyces cerevisiae in plaas van E coli. Gis, as 'n eukariote, is in staat tot post-translasie-modifikasie, so dit vergemaklik die produksie van menslike insulien. 'n Ander maatskappy het egter 'n metode ontwikkel om varkinsulien in menslike insulien om te skakel deur 'n paar aminosure chemies te verander, en dit blyk goedkoper te wees as die genetiese ingenieursmetodes. Dit wys alles dat genetiese ingenieurs nog baie het om te leer.

Menslike groeihormoon (HGH) [Terug na bo]

HGH is 'n proteïenhormoon wat deur die pituïtêre klier afgeskei word, wat weefselgroei stimuleer. Lae produksie van HGH in die kinderjare lei tot pituïtêre dwerggroei. Dit kan behandel word met HGH wat uit dooie mense onttrek is, maar aangesien die behandeling sommige newe-effekte veroorsaak het, soos Creutzfeldt-Jacod-siekte (CJD), is die behandeling teruggetrek. Die HGH-geen is gekloon en 'n kunsmatige cDNA-geen is ingevoeg E coli. ’n Seinvolgorde is bygevoeg wat nie net veroorsaak dat die geen vertaal word nie, maar ook veroorsaak dat die proteïen uit die sel afgeskei word, wat suiwering baie makliker maak. Hierdie geneties gemanipuleerde HGH word deur Genentech vervaardig en kan normale lengte suksesvol herstel vir kinders met HGH-tekort.

Bees Somatotrofien (BST) [Terug na bo]

Dit is 'n groeihormoon wat deur beeste geproduseer word. Die geen is in bakterieë gekloon deur die maatskappy Monsanto, wat groot hoeveelhede BST kan produseer. in die VSA word beeste dikwels elke 2 weke met BST ingespuit, wat 'n 10% toename in massa by vleisbeeste en 'n 25% toename in melkproduksie by melkkoeie tot gevolg het. BST is in 1985 in die Verenigde Koninkryk getoets, maar dit is nie goedgekeur nie en die gebruik daarvan is tans in die EU verbied. Dit is deels weens openbare kommer en deels omdat daar reeds oorproduksie van melk en beesvleis in die EU is, dus is groter produksie nie nodig nie.

Rennin [Terug na bo]

Rennien is 'n ensiem wat gebruik word in die produksie van kaas. Dit word in die maag van jong soogdiere (insluitend mense) geproduseer en dit help die vertering van die melkproteïen cesien deur dit te stol sodat dit langer in die maag bly. Tradisioneel het die kaasbedryf rennien gebruik wat uit die maag van jong kalwers verkry word wanneer hulle vir kalfsvleis geslag word, maar daar is morele en praktiese besware teen hierdie bron. Nou is 'n kunsmatige cDNA-geen vir rennien gemaak van mRNA wat uit kalfmaagselle onttrek is, en hierdie geen is in 'n verskeidenheid mikrobes soos die bakterie geplaas. E coli en die swam Aspergillus niger. Die rennien wat uit hierdie mikrobes onttrek is, was baie suksesvol en 90% van alle harde kase in die VK word gemaak met behulp van mikrobiese rennien. Soms (hoewel nie altyd nie) word hierdie produkte as vegetariese kaas gemerk.

AAT ('n -1-antitripsien) [Terug na bo]

AAT is 'n menslike proteïen wat in die lewer gemaak word en in die bloed voorkom. Soos die naam aandui, is dit 'n inhibeerder van protease-ensieme soos tripsien en elastase. Daar is 'n seldsame mutasie van die AAT-geen ('n enkelbasisvervanging) wat veroorsaak dat AAT onaktief is, en dus is die protease-ensieme ongeïnhibeer. Die mees opvallende effek hiervan in die longe, waar elastase verteer die elastiese weefsel van die alveoli, wat lei tot die longsiekte emfiseem. Hierdie toestand kan behandel word deur 'n aërosolsproei wat AAT bevat in te asem sodat dit die alveoli bereik en die elastase daar inhibeer.

AAT vir hierdie behandeling kan uit bloedskenkings onttrek word, maar slegs in baie klein hoeveelhede. Die geen vir AAT is gevind en gekloon, maar AAT kan nie in bakterieë geproduseer word nie, want AAT is glikoproteïen, wat beteken dat suikers bygevoeg moet word deur post-translasiewysiging. Hierdie soort modifikasie kan slegs deur diere uitgevoer word, en AAT word nou deur geneties gemodifiseerde skape geproduseer. Ten einde die AAT maklik te onttrek te maak, is die geen gekoppel aan 'n promotor vir die melkproteïen b-laktoglubulien. Aangesien hierdie promotor slegs in melkklierselle geaktiveer word, sal die AAT-geen slegs in melkklierselle uitgedruk word, en dus in die skaap se melk afgeskei word. Dit maak dit baie maklik om te oes en te suiwer sonder om die skape te benadeel. Die eerste transgeniese skaap wat AAT geproduseer het, is Tracy genoem, en sy is in 1993 deur PPL Pharmaceuticals in Edinburgh vervaardig. Dit is hoe Tracy wa s gemaak:

’n Skaapwyfie kry ’n vrugbaarheidsmiddel om haar eierproduksie te stimuleer, en verskeie volwasse eiers word uit haar eierstokke versamel.

Die eiers word bevrug in vitro.

'n Plasmied word voorberei ed wat die geen vir menslike AAT en die promotorvolgorde vir b-laktoglobulien bevat. Honderde kopieë van hierdie plasmied word in die kern van die bevrugte sigote ingespuit. Slegs 'n paar van die sigote sal getransformeer word, maar op hierdie stadium kan jy nie sê watter nie.

Die sigote verdeel in vitro totdat die embrio's in die 16-sel stadium is.

Die 16-sel embrio's word in die baarmoeder van surrogaatmoederooie ingeplant. Slegs 'n paar inplantings lei tot 'n suksesvolle swangerskap.

Toets al die nageslag van die surrogaatmoeders vir AAT-produksie in hul melk. Dit is die enigste manier om vas te stel of die sigoot die AAT-geen opgeneem het sodat dit uitgedruk kan word. Ongeveer 1 uit 20 eiers is suksesvol.

Versamel melk vir die res van hul lewe van die transgeniese skape. Hul melk bevat sowat 35 g AAT per liter melk. Teel ook daaruit om 'n trop transgeniese skape op te bou.

Suiwer die AAT, wat sowat 50 000 per mg werd is.

Nuwe fenotipes [Terug na bo]

Dit beteken die verandering van die eienskappe van organismes deur genetiese manipulasie. Die organismes is oor die algemeen kommersieel-belangrike gewasse of plaasdiere, en die doel is om hul kwaliteit op een of ander manier te verbeter. Dit kan gesien word as 'n hoë-tegnologie weergawe van selektiewe teling, wat al vir minstens 10 000 jaar deur mense gebruik word om hul gewasse en diere te verander en te verbeter. Nietemin het GMO's 'n hoogs omstrede ontwikkeling geblyk te wees. Ons hoef nie enige hiervan in detail te bestudeer nie, maar hierdie tabel gee 'n idee van wat gedoen word.

Geen vir virusmantelproteïen is gekloon en in tabak-, aartappel- en tamatieplante ingevoeg. Dit lyk asof die pelsproteïen die plante immuniseer , wat baie meer bestand is teen virale aanval.

Onkruiddoderbestande gewasse

Omgewing skoonmaak mikrobes

Geenterapie [Terug na bo]

Dit is miskien die belangrikste en mees omstrede soort genetiese ingenieurswese. Dit is ook die minste goed ontwikkel. Die idee van geenterapie is om mense geneties te verander om 'n siekte te behandel. Dit kan die eerste geleentheid wees om ongeneeslike siektes te genees. Let daarop dat dit heeltemal anders is as om geneties gemanipuleerde mikrobes te gebruik om 'n geneesmiddel, entstof of hormoon te vervaardig om 'n siekte op konvensionele maniere te behandel. Geenterapie beteken om die genotipe van 'n weefsel of selfs 'n hele mens te verander.

Sistiese fibrose [Terug na bo]

Sistiese fibrose (CF) is die mees algemene genetiese siekte in die Verenigde Koninkryk, wat ongeveer 1 uit 2500 affekteer. Dit word veroorsaak deur 'n mutasie in die geen vir proteïen genaamd CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Die geen is op chromosoom 7 geleë, en daar is eintlik meer as 300 verskillende mutasies bekend, hoewel die mees algemene mutasie 'n uitwissing van drie basisse is, wat een aminosuur uit 1480 aminosure in die proteïen verwyder. CFTR is 'n chloried-ioonkanaalproteïen wat in die selmembraan van epiteel (voering) weefselselle voorkom, en die mutasie stop die proteïen om te werk, sodat chloriedione nie die selmembraan kan oorsteek nie.

Chloriedione bou binne hierdie selle op, wat veroorsaak dat natriumione binnedring om die lading te balanseer, en die verhoogde konsentrasie van beide hierdie ione binne die epiteelselle verminder die osmotiese potensiaal. Water word dus binne die selle behou, wat beteken dat die slym wat deur hierdie selle afgeskei word, droër en taaier as normaalweg is. Hierdie taai slym blokkeer die buise waarin dit afgeskei word, soos die dunderm, pankreaskanaal, galbuis, spermkanaal, brongiole en alveoli.

Hierdie blokkasies lei tot die simptome van CF: asemloosheid, longinfeksies soos brongitis en longontsteking, swak spysvertering en absorpsie, en onvrugbaarheid. Van hierdie simptome is die longeffekte die ernstigste wat 95% van sterftes veroorsaak. CF is altyd dodelik, alhoewel lewensverwagting van 1 jaar tot ongeveer 20 jaar toegeneem het as gevolg van moderne behandelings. Hierdie behandelings sluit in fisioterapie baie keer elke dag om slym uit die longe te verwyder, antibiotika om infeksies te beveg, DNAse-middels om die slym los te maak, ensieme om voedselvertering te help en selfs 'n hart-longoorplanting.

Gegewe hierdie ingewikkelde (en uiteindelik onsuksesvolle) behandelings, is CF 'n goeie kandidaat vir geenterapie, en was een van die eerste siektes wat op hierdie manier aangepak is. Die geen vir CFTR is in 1989 geïdentifiseer en 'n cDNA-kloon is kort daarna gemaak. Die idee is om kopieë van hierdie goeie geen aan die epiteelselle van die long te lewer, waar hulle in die kern-DNS geïnkorporeer kan word en funksionele CFTR-chloriedkanale kan maak. As ongeveer 10% van die selle reggestel kon word, sou dit die siekte genees.

Twee metodes van aflewering word beproef: liposome en adenovirusse, albei toegedien met 'n aërosol-inhaleerder, soos dié wat deur asmalyers gebruik word. Kliniese proewe is tans aan die gang, maar daar is nog nie bewys dat terapie suksesvol is nie.

SCID [Terug na bo]

Ernstige Gekombineerde Immuniteitsgebreksiekte (SCID) is 'n seldsame genetiese siekte wat die immuunstelsel aantas. Dit word veroorsaak deur 'n mutasie in die geen vir die ensiem adenosien deaminase (ADA). Sonder hierdie ensiem kan witbloedselle nie gemaak word nie, so lyers het byna geen effektiewe immuunstelsel nie en sal vinnig 'n dodelike infeksie opdoen tensy hulle hul lewens in steriele isolasie deurbring (SCID staan ​​ook bekend as baba in 'n borrel-sindroom ). Geenterapie is met 'n paar kinders in die VSA en die VK aangewend deur chirurgies beenmurgselle (wat witbloedselle in die liggaam vervaardig) van die pasiënt te verwyder, hulle te transfekteer met 'n geneties gemanipuleerde virus wat die ADA-geen bevat, en dan terug te keer die getransformeerde selle na die pasiënt. Die hoop is dat hierdie getransformeerde selle in die beenmurg sal vermeerder en witbloedselle sal maak. Die proewe is nog aan die gang, so die sukses is onbekend.

Die toekoms van geenterapie [Terug na bo]

Geenterapie is in sy kinderskoene, en is nog baie 'n gebied van navorsing eerder as toepassing. Niemand is nog deur geenterapie genees nie, maar die potensiaal bly aanloklik. Geenterapie hoef nie eers beperk te word tot die behandeling van genetiese siektes nie, maar kan ook help met die behandeling van infeksies en omgewingsiektes:

Kiemlynterapie sal hoogs effektief wees, maar is ook potensieel gevaarlik (aangesien die langtermyn-effekte van genetiese veranderinge nie bekend is nie), oneties (aangesien dit maklik tot eugenetika kan lei) en immoreel (aangesien dit die verandering en vernietiging van mense kan behels embrio's). Dit is tans onwettig in die Verenigde Koninkryk en die meeste ander lande, en huidige navorsing fokus slegs op somatiese selterapie. Alle geenterapie-proewe in die Verenigde Koninkryk moet goedgekeur word deur die Gene Therapy Advisory Committee (GTAC), 'n regeringsliggaam wat die mediese en etiese gronde vir 'n proef hersien. Kiemlynmodifikasie word met diere toegelaat, en is inderdaad die basis vir die vervaardiging van GMO's.


OPKOMENDE GENETIESE-INGENIEURSWESE TEGNOLOGIEë

Benewens die tegnologieë wat hierbo bespreek is, is nuwe genetiese-ingenieursbenaderings ontwikkel en word verfyn en verbeter. Alhoewel dit nog nie op kommersiële produkte toegepas is nie, hou dit praktiese waarde vir toekomstige GE-gewasse in. Die tegnologieë sluit in genoomredigering, sintetiese DNA-komponente en kunsmatige chromosome, en geteikende epigenetiese modifikasies.

Genoom redigering

Genoomredigering gebruik plekgerigte nukleases (volgorde-spesifieke nukleases SSN'e) om geteikende DNA-volgordes in 'n organisme te muteer. Deur SSN-stelsels te gebruik, kan wetenskaplikes spesifieke basisse op 'n aangewese lokus uitvee, byvoeg of verander. SSN'e klief DNS op spesifieke plekke en laat 'n enkele breuk (bekend as 'n kerf) of 'n dubbelstring-breuk. Die DNA-breuk kan op twee maniere herstel word (Figuur 7-1):

  • Deur die sel&rsquos inheemse nie-homologous end joining (NHEJ) proses, wat lei tot 'n mutasie op die terrein.
  • As 'n skenker-DNA-molekule verskaf word op dieselfde tyd as wat die DNA deur die nukleases geredigeer word, deur die sel se eie inheemse DNA-herstelmasjinerie, bekend as homologie gerigte herstel (HDR) & mdash wat die skenkermolekule by die splitsingsplek inkorporeer.

Vier hoofklasse SSN'e word gebruik in plantgenoomredigering (hersien in Voytas en Gao, 2014): meganukleases, sinkvingernukleases (ZFN's), transkripsie-aktiveerder-agtige effektor-nukleases (TALENs), en die gegroepeerde gereelde interspasiëring palindromiese herhalings (CRISPR) /Cas9 nuklease sisteem (Figuur 7-2).Die veld van genoomredigeringstegnologieë en -toepassing het ontplooi, veral sedert die koms van die CRISPR/Cas9-stelsel, en die komitee verwag bykomende ontdekkings om genoomredigering in die komende dekade te vergemaklik.

Meganukleases kom natuurlik voor in bakterieë, archaea en eukariote en was die eerste SSN's wat vir genoomredigering ondersoek is. Meganukleases is enkele proteïene wat 'n volgorde in die DNA herken wat minstens 12 nukleotiede lank is en die teiken-DNS klief, wat 'n dubbelstring-breuk laat wat deur NHEJ of HDR herstel kan word deur 'n skenkermolekule te gebruik (hersien in Silva et al. , 2011). Meganuklease-gemedieerde genoomredigering is in mielies (Zea mays) en tabak (Nicotiana spp.) (hersien in Baltes en Voytas, 2014). Dit is moeilik om die teikenvolgorde-spesifisiteit van meganukleases te verander, daarom word hulle nie wyd gebruik vir genoomredigering nie.

Sinkvinger&ndashdomein-bevattende proteïene bind aan DNS en is wydverspreid in die natuur, en funksioneer dikwels as transkripsiefaktore (proteïene wat geenuitdrukking reguleer deur direk of indirek aan regulatoriese DNS-volgordes te bind wat gewoonlik in die promotorstreke van gene voorkom 3 ). Die sinkvingerdomeine kan gemanipuleer word om spesifieke volgordes van DNS te bind wanneer dit aan die DNS-snydende nuklease-domein van die FokI-proteïen saamgesmelt word, 'n ZFN is die resulterende bastermolekule. 'n Paar ZFN'e funksioneer in tandem

3 Voorbeelde van genetiese ingenieurswese wat transkripsiefaktore gebruik, word in Hoofstuk 8 gegee.

FIGUUR 7-1 Gevolge van DNA-splyting deur genoom-redigeringstegnologieë in die sel.
BRON: Sander en Joung (2014).
LET WEL: Na splitsing van dubbelstring-DNS deur volgorde-spesifieke nukleases soos meganukleases, sinkvinger, transkripsie-aktiveerder-agtige effektors, en gegroepeerde gereeld tussenspasiëerde palindromiese herhalings/Cas9 (verteenwoordig deur die weerligstraal), die dubbelstring-breuk in die DNA-molekule kan herstel word deur inheemse nie-homologe eindverbindingsmeganismes (NHEJ) van die sel, wat lei tot 'n veranderde DNA-volgorde met óf 'n delesie (rooi stippellyn) óf 'n invoeging (soliede groen lyn). As 'n skenker-DNA-sjabloon verskaf word (sien blou DNA-fragment), sal die homologie-gerigte herstel (HDR) meganismes binne die sel die skenkermolekule in die lokus plaas, en dit lei tot 'n geredigeerde geen of teikengebied (blou streek met 'n presiese invoeging of wysiging).

om DNA op die gewenste teikenplek te sny (hersien in Urnov et al., 2010). Soos met meganukleases, word ZFN'e gebruik vir die bekendstelling van mutasies deur NHEJ en HDR. ZFN's is gebruik in die ingenieurswese van talle plantspesies (hersien in Baltes en Voytas, 2014). ZFN'e was die eerste wyd gebruikte ontwerpergenoom-redigeringsinstrument in biologie.

Transkripsie-aktivator-agtige effektore (TALEs) is in die bakteriese plantpatogeen ontdek Xanthomonas en kon ontwerp word om aan feitlik enige DNS-volgorde te bind. Hul gemak van ontwerp vir spesifieke teiken-DNS-volgordes het genoomredigering 'n rewolusie gemaak. In die natuur, Xanthomonas spesies skei TALEs in plantselle af om patogenisiteit moontlik te maak. TALEs bind aan promotors in plantgene om die plant se weerstand teen die patogeen te onderdruk. Die bakterieë kodeer TALE's deur 'n eenvoudige kode of syfer wat was

FIGUUR 7-2 Genoom-redigeringstegnologieë: Meganukleases, Sinkvingernukleases (ZFN'e), Transkripsie-aktiveerder-agtige effektornukleases (TALENs), en Gegroepeerde gereelde interspasiëring palindromiese herhalings (CRISPR)/Cas.
BRON: Baltes en Voytas (2014).

ontgin om proteïene met pasgemaakte terreinspesifisiteit in enige teikengenoom te ontwerp (Boch et al., 2009 Moscou en Bogdanove, 2009). Soos ZFNs, kan TALEs met die nuklease-domein van FokI saamgesmelt word en word dan na verwys as TALENs. TALENs word in pare soos ZFNs gebruik om geteikende mutasies te beïnvloed. TALENs is gebruik om genome in verskeie plante te wysig, insluitend rys (Oryza spp.), mielies, koring (Triticum spp.), en sojabone (Glysien maks) (hersien in Baltes en Voytas, 2014).

CRISPR was die mees onlangs ontwikkelde genoom-redigeringsinstrument toe die komiteeverslag geskryf is. Bakterieë huisves CRISPR as 'n aangebore verdedigingsmeganisme teen virusse en plasmiede wat RNA-geleide nukleases gebruik om die splitsing van vreemde DNS-volgordes te teiken. Toe die komiteeverslag geskryf is, was die CRISPR/Cas-stelsel wat in genoomredigering gebruik is, hoofsaaklik die Tipe II CRISPR/Cas9, van Streptococcus pyogenes, waarin vreemde DNS-volgordes tussen herhalende volgordes by die CRISPR-lokus geïnkorporeer word en dan getranskribeer word in 'n RNA-molekule bekend as crRNA (hersien deur Sander en Joung, 2014). Die crRNA hibridiseer dan met 'n tweede RNA, die tracrRNA, en die kompleks bind aan die Cas9 nuklease. Die crRNA lei die kompleks na die teiken-DNS en, in die geval van aangebore immuniteit in bakterieë, bind dit aan die komplementêre volgorde in die teiken-DNS wat dan deur die Cas9-nuklease geklief word. Wetenskaplikes het die aangebore CRISPR/Cas9-stelsel gedissekteer en dit op so 'n manier herontwerp dat 'n enkele RNA, die gids-RNA, nodig is vir Cas9-gemedieerde splitsing van 'n teikenvolgorde in 'n genoom. Gids RNA ontwerp vereistes is beperk tot 'n unieke volgorde van ongeveer 20 nukleotiede in die genoom (om nie-teiken effekte te voorkom) en is beperk naby die protospacer aangrensende motief volgorde, wat spesifiek is vir die CRISPR/Cas stelsel. Nuwer toepassings van CRISPR sluit in die gebruik van twee unieke gids-RNA's met 'n gemodifiseerde nuklease wat een string van die DNS &ldquonicks&rdquo, wat groter spesifisiteit bied vir geteikende delesies. Die gemak van ontwerp, die spesifisiteit van die gids-RNA en die eenvoud van die CRISPR/Cas9-stelsel het gelei tot 'n vinnige demonstrasie van die nut van hierdie metode om genome in plante en ander organismes te redigeer (hersien in Baltes en Voytas, 2014). Genoomredigering, veral CRISPR, verander vinnig. Toe die komitee se verslag geskryf is, is nie-Cas9 endonukleases (byvoorbeeld Cpf1) onlangs beskryf vir CRISPR genoom redigering (Zetsche et al., 2015).

Toe die komitee sy verslag geskryf het, is toepassings van SSN'e in genoomredigering meestal gebruik om mutasies by die teikenlokus deur NHEJ in te voer om geen-uitslae te produseer. Soos getoon in Figuur 7-1, kan nukleases ook gebruik word vir volgordevervanging via HDR (of moontlik NHEJ) as 'n skenker-DNS saam in die sel ingebring word. Veelvuldige tipes skenkermolekules kan gebruik word. Eerstens kan 'n alternatiewe alleel van die teikenlokus ingevoer word op so 'n manier dat die gemodifiseerde geen 'n proteïen kodeer wat 'n nuwe of verbeterde eienskap verleen. Byvoorbeeld, modifikasie van 'n spesifieke enkele nukleotied in die asetolaktaat sintase (ALS) geen kan weerstand verleen teen onkruiddoders wat ALS inhibisie gebruik as hul werkswyse (Jander et al., 2003). Tweedens kan homoloë rekombinasie gebruik word om 'n nuwe volgorde by daardie lokus in te voer. Hierdie 'presisie-genoom-invoeging' deur die ingenieurswese van 'n landingsplek sal die semir-willekeurige invoeging van transgene in Agrobacterium-gemedieerde en geengeweerbemiddelde transformasiemetodes. Dit sal ook die kombinasie van gewysigde of

geredigeerde gene by 'n enkele lokus, genoem &ldquotrait landing pads,&rdquo in die genoom eerder as lukraak in die genoom, so dit sal makliker wees om nuwe eienskappe by 'n GE-gewas te voeg wat fisies in die genoom gekoppel is (Ainley et al., 2013) ). Hierdie strategie sal ook die verwydering van ingevoegde gene moontlik maak wanneer verlang.

Genoomredigering via CRISPR en ander tegnieke kan in plante uitgevoer word via verbygaande uitdrukking van transgene (Clasen et al., 2016) of hoegenaamd sonder eksogene DNA (Woo et al., 2015) wat lei tot GE-plante wat nie die transgeen het nie. Clasen et al. (2016) het 'n geneties gekodeerde TALEN-paar gebruik om spesifieke mutasies in aartappelprotoplaste te produseer. Aartappelplante wat van die protoplaste met gemuteerde geteikende allele herwin is, het 'n nuwe kwaliteiteienskap bevat, en sewe van die 18 GE-lyne het geen TALEN-transgeenkonstrukte in die aartappelgenoom bevat nie. Woo et al. (2015) gebruik in vitro&ndash-vertaalde Cas9-proteïen gekoppel om RNA te lei om gene te muteer in Arabidopsis, tabak, blaarslaai en rys protoplaste, waaruit gemuteerde plante herwin is. Dit blyk dus dat genoomredigering in gewasse uitgevoer kan word sonder om enige transgeniese DNS-voetspoor in die genoom te laat. In die afwesigheid van enige buite-teiken mutasies, wat duidelik blyk uit diep geteikende volgordebepaling in die aartappeleksperiment (Woo et al., 2015), blyk genoomredigeringsreagense 4 wat nie 'n transgeen in die genoom laat nie, 'n waardevolle gewasteeltbenadering.

Die bogenoemde voorbeelde fokus op die gebruik van SSN'e om DNA te splits en permanente veranderinge in die volgorde van die dubbelstring DNA deur óf NHEJ óf HDR in te voer. Daar is egter ander toepassings waardeur proteïene wat op 'n volgorde-spesifieke wyse aan DNA bind, ontgin kan word om gene en geenaktiwiteit te verander. Dit sluit samesmelting van die DNA-bindende kenmerke van sinkvingerproteïene (ZFP's) of TALE's in om domeine te aktiveer om sintetiese transkripsionele aktiveerders te produseer. Sonder aktiveerdersamesmeltings kan die ZFP's of TALE's as transkripsionele onderdrukkers gebruik word. Die ontwerpkenmerke van ZFP's en TALE's maak die produksie van sintetiese transkripsiefaktore (TF's) moontlik om die uitdrukking van feitlik enige teikengeen te reguleer (Figuur 7-3). Inderdaad, TALE-TF's is in tandem gebruik om bykomende geenaktivering in transgeniese plante te produseer (Liu et al., 2014). Vir die CRISPR/Cas9-stelsel kan 'n reeks molekules met 'n katalities onaktiewe Cas9-nuklease (dCas9) saamgesmelt word om 'n wye verskeidenheid modifikasies van geenregulering moontlik te maak, gesamentlik bekend as CRISPR-interferensie (hersien in Doudna en Charpentier, 2014 Figuur 7- 3). Miskien is die eenvoudigste toepassing die samesmelting van die dCas9 tot 'n transkripsionele aktiveerder of 'n transkripsionele onderdrukker wanneer dit in 'n sel met 'n gids-RNA ingebring word, die transkripsie-aktiveerder of -onderdrukker kan die aantal transkripsies wysig

4 Nukleases wat aangepas is om 'n spesifieke volgorde te teiken, word na verwys as reagense.

van die teikengeen op 'n manier soortgelyk aan ZFP's en TALE's. Die dCas9-gene kan moontlik met chromatienmodifikasie-gene saamgesmelt word en deur die gids-RNA na 'n teikengebied gelei word om die epigenetiese toestand van 'n lokus te wysig en daardeur transkripsie te beïnvloed (Doudna en Charpentier, 2014).

BEVINDING: Ontginning van inherente biologiese prosesse&mdashDNA bindende sinkvingerproteïene (ZFNs), patogeengerigte transkripsie van gasheergene (TALEs), en geteikende degradasie van DNA-volgordes (CRISPR/Cas)&mdashnou laat presiese en veelsydige manipulasie van DNA in plante toe.

Kunsmatige en Sintetiese Chromosome

Verhoogde kennis van biologiese prosesse en gevorderde molekulêre-biologie-instrumente sal nie net die ingenieurswese van veelvuldige gene in plante vergemaklik nie, maar sal ook die invoeging van volledige en nuwe biochemiese weë of prosesse moontlik maak. DNS-konstrukte wat in plantgenetiese ingenieurswese gebruik word, was klein (minder as 20&ndash40 kilobasisse) en het tradisionele molekulêre kloningstegnieke gebruik wat stadig en moeisaam is. Nuwe en goedkoop metodes om DNS-molekules te sintetiseer en dit in groter DNS-molekules saam te stel, is egter ontwikkel. Die metodes laat vinnige, maklike konstruksie van multigeenbane op 'n enkele DNA-molekule toe (vir oorsig, sien Ellis et al., 2011). Die uitvoerbaarheid van die tegnieke is gedemonstreer deur die sintese van 'n hele bakteriese genoom (Gibson et al., 2010) en die skepping van 'n sintetiese gischromosoom (Annaluru et al., 2014). Navorsers wil graag tiene tot honderde gene in plante kan inbring. Een metode wat beoog word om sulke vooruitgang te bewerkstellig, is die gebruik van kunsmatige minichromosome of sintetiese chromosome. 'n Kunsmatige minichromosoom is 'n chromosoom wat by die plant se natuurlike samestelling van chromosome in die kern gevoeg word. 'n Sintetiese chromosoom (Annaluru et al., 2014) is 'n totale sintese van DNS om 'n natuurlike chromosoom of selfs 'n hele organelgenoom, soos die plastoomgenoom, te vervang.

Kunsmatige of sintetiese chromosome en genome sal die samestelling van 'n groot aantal gene in 'n self-repliserende molekule moontlik maak. In eukariote is chromosome lineêre DNA-molekules met die regte volgordes vir replikasie (oorsprong van replikasie), integriteit (telomere) en segregasie in delende selle (sentromere). Die gebruik van kunsmatige of sintetiese chromosome sal die inbring van gene in plante toelaat op 'n wyse wat nie die potensiaal het om gene op inheemse plantchromosome by die plekke van invoeging te ontwrig nie.

Geen sintetiese chromosome of genome is in plante geskep nie, maar die metodes wat gebruik word om 'n gis sintetiese chromosoom te maak (Annaluru et

FIGUUR 7-3 Alternatiewe gebruike van genoom-redigeringstegnologieë.
BRON: Illustrasie verskaf deur C. R. Buell.
LET WEL: A, 'n Sinkvinger of transkripsie-aktiveerder-agtige effektor (TALE) (blou) kan saamgesmelt word met 'n transkripsie-aktiveerder (groen) om transkripsie van 'n geen van belang te verhoog. B, 'n Sinkvinger of TALE (blou) kan saamgesmelt word met 'n transkripsieonderdrukker (rooi) om transkripsie van 'n geen van belang te onderdruk. C, 'n Katalities onaktiewe Cas9-nuklease (pers) kan saamgesmelt word met 'n transkripsionele aktiveerder (groen) en, in die teenwoordigheid van 'n gids-RNA (oranje en geel), die kompleks na die promotor van 'n geen van belang lei en transkripsie van die teikengeen. D, A katalities

FIGUUR 7-3 Vervolg

onaktiewe Cas9 nuklease (pers) kan saamgesmelt word met 'n transkripsionele onderdrukker (rooi) en, in die teenwoordigheid van 'n gids-RNA (oranje en geel), die kompleks lei na die promotor van 'n geen van belang en die transkripsie van die teikengeen verminder. E, 'n Katalities onaktiewe Cas9 nuklease (pers) kan saamgesmelt word met 'n DNA-metilerende ensiem en, in die teenwoordigheid van 'n gids-RNA (oranje en geel), die kompleks lei na die promotor van 'n geen van belang, wat daardie geen vir metilering en, as gevolg daarvan, die onderdrukking van transkripsie.

al., 2014) moet oordraagbaar wees na plante. Gis-chromosoom III, wat 316 617 basisse is, is vervang met 'n laboratorium-gesintetiseerde chromosoom van 272 871 basisse. Die chloroplastgenoom, wat die helfte tot een derde van die grootte van gis-chromosoom III is, kan voorsienbaar gesintetiseer word en in 'n plant, soos tabak, ingevoeg word wat reeds vir plastoomtransformasie vatbaar is. Die koste van DNA-sintese neem steeds af, so eksperimentele ontwikkeling in hierdie veld sal ekonomies haalbaar wees.

Navorsing oor kunsmatige minichromosome vir plante het oor die algemeen twee benaderings gevolg (hersien in Gaeta et al., 2012 Birchler, 2015). In die &ldquobottom-up&rdquo-benadering het die sleuteldele van 'n chromosoom&mdash soos die sentromeer, telomeer, oorsprong van replikasie en gene van belang&mdashare saamgevoeg, en dit lei tot 'n de novo minichromosoom. Alhoewel vordering met hierdie benadering gemaak is, kan bykomende kenmerke, soos epigenetiese modifikasie van DNA-nukleotiede, geenuitdrukking (sien hieronder) en die vermoë van die minichromosoom om in 'n sel repliseer te beïnvloed en het verhoed dat die benadering gereeld gebruik word. Die &ldquotop-down&rdquo-benadering gebruik in wese bestaande chromosome&mdash die sintetiese gis-chromosoombenadering benader&mdashom 'n kunsmatige chromosoom met 'n bestaande sjabloon te bou. Hierdie benadering het gelei tot die oordrag van die minichromosoom deur meiose, maar nie so doeltreffend soos dié van inheemse chromosome nie. Geen benadering het tot prakties ontplooibare minichromosome gelei nie. Dus kan die gebruik van 'n sintetiese benadering om DNS sistematies te vervang, analoog aan die benadering in die gisprojek, moontlik in die toekoms moontlik wees (Birchler, 2015). Dit kan ook moontlik wees dat huidige onder-na-bo- of bo-na-onder-benaderings kan werk in klonaal vermeerderde gewasse, soos aartappel, aangesien meiose nie nodig is nie (Birchler, 2015).

Met 'n robuuste kennisbasis van gene onderliggend aan plantbiochemie, kan presiese konstrukte in vitro gesintetiseer word en in 'n heteroloë spesie ingebring word d.m.v. Agrobacterium-gemedieerde of geengeweer-bemiddelde transformasie of nuklease-geteikende invoeging by 'n enkele geselekteerde plek. Byvoorbeeld, soet als (Artemisia annua) produseer artemisinien, 'n antimalariaverbinding. Met vyf gene van gis en van A. annua, is tabak ontwerp om artemisinien te sintetiseer (Farhi et al., 2011). Alhoewel die opbrengs van artemisinien in tabak laer was as dié in A. annua, het hierdie bewys-van-konsep-studie die uitvoerbaarheid gedemonstreer om heteroloë biosintetiese bane in plante te ontwerp. Met verdere verfyning van promotors, verbeterde begrip van metaboliet kompartementalisering en vervoer en vloed in selle en weefsels, en ontwikkeling van sulke vektore soos kunsmatige chromosome wat in staat is om groot segmente van DNA na plantselle oor te dra, genetiese manipulering van plante vir komplekse eienskappe, soos heteroloë of nuwe biochemiese weë, en vir gespesialiseerde fisiologiese

en ontwikkelingsprosesse, soos C4-fotosintese, kan moontlik wees (sien Hoofstuk 8 vir detail).

Geteikende epigenetiese wysigings

Soos vroeër in hierdie hoofstuk uiteengesit, kan relatief stabiele, oorerflike veranderinge in die uitdrukking van spesifieke gene voortspruit uit veranderinge in die epigenoom. Veranderinge in veral die metilering van DNA sal heel waarskynlik lei tot oorerflike veranderinge in geenuitdrukking in plante. Soos die begrip van die biochemie van die stelsels wat DNA-metileringspatrone verander, toeneem, neem die vermoë om spesifieke gene vir epigenetiese modifikasies te teiken ook toe. Sodanige teiken sal die uitdrukking van die proteïene en dalk ook spesifieke nukleïensure (byvoorbeeld 'n gids-RNA) behels wat DNS-metilering na 'n spesifieke lokus sal lei. Die teikenstelsel kan verwyder word nadat die epigenetiese modifikasie bewerkstellig is, deur byvoorbeeld konvensionele plantteling te gebruik om die teikenstelsel te skei.

Wat die sleutelkwessie van veiligheid betref, bied die verandering van die epigenetiese modifikasies van bepaalde plantgene geen fundamentele probleme nie, die genome van plante is vol epigenetiese modifikasies, en epigeneties gemodifiseerde DNA is al duisende jare in die omgewing en verbruik deur mense. Die veiligheidskwessie is dus dieselfde as dié wat betrokke is by enige tegniek, hetsy genetiese manipulasie of nie-genetiese ingenieurswese, wat lei tot 'n toename of afname in die uitdrukking van spesifieke gene in 'n plant en in spesifieke eienskapveranderinge.

Daar moet kennis geneem word dat, benewens geteikende benaderings, daar verskeie maniere is om die epigenoom van 'n plant breedweg en lukraak te verander, soos ooruitdrukking van 'n ensiem wat DNA-metilering verander. Natuurlik is breë en ewekansige benaderings om 'n plantgenoom te verander nie nuut nie: mutagenese is 'n breë en ewekansige benadering tot genoommodifikasie. Die nut van breë en ewekansige benaderings tot genoom- of epigenoommodifikasie is dat as die biochemie of genetika van 'n proses nie genoegsaam verstaan ​​word om 'n geteikende benadering toe te laat nie, hetsy 'n genetiese-ingenieurswese of 'n nie-genetiese-ingenieursbenadering (soos merker-gesteunde teling)&mdasha ewekansige benadering kan 'n gewenste resultaat lewer.Soos hierbo bespreek, sal breë en ewekansige benaderings lei tot meer onbekende veranderinge as geteikende benaderings.

Konsekwentheid is tipies 'n wenslike kenmerk van nuwe plantvariëteite. Aangesien epigenetiese veranderinge met verskillende frekwensies na die aanvanklike toestand kan terugkeer, is epigenetiese modifikasie dalk nie 'n ideale benadering om nuwe plantvariëteite te produseer nie. As 'n nuwe plantvariëteit afkomstig van 'n epigenetiese verandering egter beter is as stabiele alternatiewe, is die potensiaal vir 'n mate van terugkeer dalk nie 'n struikelblok vir kommersialisering nie.


Ouderdom-geaktiveerde en donker-geïnduseerde blaar veroudering vereis die bHLH transkripsie faktore PIF3, 4, en 5

Blaar veroudering kan veroorsaak en bevorder word deur 'n groot aantal ontwikkelings- en omgewingsfaktore. Talle bewyse het 'n betrokkenheid van fitochrome in die regulering van blaarveroudering voorgestel, maar die verwante seinpaaie en fisiologiese meganismes word swak verstaan. In hierdie studie het ons aanvanklik fitochroom-interaksie faktore (PIF's) 3, 4 en 5 geïdentifiseer as veronderstelde bemiddelaars van blaarveroudering. Mutasies van die PIF-gene het gelei tot 'n aansienlik verbeterde blaarlanglewendheid in ouderdom-geaktiveerde en donker-geïnduseerde veroudering, terwyl ooruitdrukkings van hierdie gene ouderdom-geaktiveerde en donker-geïnduseerde senesensie in Arabidopsis versnel het. Konsekwent het verlies aan funksie van PIF4 donker-geïnduseerde transkripsieveranderinge wat verband hou met chloroplast-agteruitgang en reaktiewe suurstofspesies (ROS) generasie verswak. ChIP-PCR en Dual-Luciferase toetse het gedemonstreer dat PIF4 chlorofil degradasie regulerende geen NYE1 kan aktiveer en chloroplast aktiwiteit handhawer geen GLK2 kan onderdruk deur aan hul promotor streke te bind. Laastens, donker-geïnduseerde etileenbiosintese en etileen-geïnduseerde veroudering is albei in pif4 gedemp, wat die betrokkenheid van PIF4 in beide etileenbiosintese en seinweg voorstel. Ons studie verskaf bewyse dat PIF3, 4 en 5 nuwe positiewe verouderingsbemiddelaars is en kry 'n insig in die meganisme van ligsein wat betrokke is by die regulering van blaarveroudering.

Sleutelwoorde: GLK2 NYE1/SGR1 chloroplast agteruitgang etileen. blaar veroudering fitochroom-interaksie faktor (PIF).

© The Author 2014. Gepubliseer deur Oxford University Press namens CSPB en IPPE, SIBS, CAS.

Syfers

PIF3, 4 en 5 Bevorder ouderdoms- en donker-geïnduseerde blaarveroudering. (A) Fenotipes van...

Transkriptoom Analise van pif4 Mutant...

Transkriptoom Analise van pif4 Mutant. (A) Box-plot-voorstellings van 791 veroudering wat opgereguleer is en ...

PIF4 reguleer chloroplastaktiwiteit negatief.…

PIF4 reguleer chloroplastaktiwiteit negatief. (A) Relatiewe uitdrukkings van NYE1 , GLK1 ,…

PIF4 reguleer beide etileenbiosintese ...

PIF4 reguleer beide etileenbiosintese en sein. (A) Relatiewe uitdrukkings van ACS2 ,…


Top 4 toepassings van genetiese ingenieurswese

Die volgende punte beklemtoon die top vier toepassings van genetiese ingenieurswese. Die toepassings is: 1. Toepassing in Landbou 2. Toepassing op Medisyne 3. Energieproduksie 4. Toepassing op Nywerhede.

Genetiese Ingenieurswese: Toepassing # 1. Toepassing in Landbou:

’n Belangrike toepassing van rekombinante DNA-tegnologie is om die genotipe van gewasplante te verander om hulle meer produktief, voedsaam, ryk aan proteïene, siektebestand te maak en minder kunsmisverbruik te maak. Rekombinante DNS-tegnologie en weefselkultuurtegnieke kan hoë-opbrengs graan, peulgewasse en groentegewasse produseer.

Sommige plante is geneties geprogrammeer om hoë proteïenkorrels te lewer wat weerstand teen hitte, vog en siektes kan toon.

Sommige plante kan selfs hul eie kunsmis ontwikkel, sommige is geneties getransformeer om hul eie insekdoders te maak. Deur genetiese ingenieurswese is sommige variëteite geproduseer wat atmosferiese stikstof direk kon bind en dus is daar geen afhanklikheid van kunsmis nie.

Wetenskaplikes het transgeniese aartappel-, tabak-, katoen-, mielie-, aarbei-, raapsaad ontwikkel wat bestand is teen insekplae en sekere onkruiddoders.

Bakterium, Bacillus thurenginesis produseer 'n proteïen wat giftig is vir insekte. Deur die tegnieke van genetiese ingenieurswese te gebruik, is die geen wat vir hierdie toksiese proteïen genaamd Bt-geen kodeer, uit bakterieë geïsoleer en in tamatie- en tabakplante gemanipuleer. Sulke transgeniese plante het behoefte aan tabakhoringwurms en tamatievrugwurms getoon. Hierdie genotipes wag op vrylating in die VSA.

Daar is sekere geneties-ontwikkelde onkruiddoders wat nie spesifiek vir onkruid alleen is nie, maar ook nuttige gewasse doodmaak. Glifosaat is 'n algemeen gebruikte onkruiddoder wat bloot 'n bepaalde noodsaaklike ensiem in onkruide en ander gewasplante inhibeer. 'n Teikengeen van glifosaat is teenwoordig in die bakterie salmonella typhimurium. 'n Mutant van S. typhimurium is bestand teen glifosaat.

Die mutante geen is na E. coli gekloneer en dan herkloon na Agrobacterium tumifaciens deur sy Ti Plasmied. Infeksie van plante met Ti-plasmied wat glifosaatbestande geen bevat, het gewasse soos katoen, tabakmielies opgelewer, wat almal bestand is teen glifosaat.

Dit maak dit moontlik om die gewaslande met glifosaat te bespuit wat slegs die onkruid sal doodmaak en die geneties gemodifiseerde gewasse met weerstandbiedende gene bly onaangeraak.

Onlangs het Calogene, 'n biotegnologiemaatskappy, 'n bakteriese geen geïsoleer wat newe-effekte van onkruiddoders ontgift. Transgeniese tabakplante wat weerstand bied teen T MV mosaïekvirus en tamatie i weerstandbiedend teen Goue mosaïekvirus is ontwikkel deur virusjasproteïengene »gevoelige plante oor te dra. Hierdie moet nog vrygestel word.

Die geenoordragtegnologie kan ook 'n belangrike rol speel in die produksie van nuwe en verbeterde verskeidenheid houtbome.

Verskeie spesies mikroörganismes is geproduseer wat giftige chemikalieë kan afbreek en gebruik kan word om skadelike patogene en insekplae dood te maak.

Vir die gebruik van genetiese ingenieurstegnieke vir die oordrag van vreemde gene in gasheerplantselle, is 'n aantal gene reeds gekloon en volledige biblioteke van DNA en mt DNA van ertjie is nou bekend.

Sommige van die gekloonde gene sluit in:

(i) Gene vir faseolien van Franse boontjie,

(ii) Min faseolien been hemoglobien vir sojabone,

(iii) Gene vir klein sub-eenheid RUBP karboksilase van ertjie, en i gene vir bergingsproteïen in sommige graangewasse.

Pogings word aangewend om verskeie landbougewasse te verbeter deur verskeie tegnieke van genetiese ingenieurswese te gebruik wat insluit:

(i) Oordrag van stikstofbindende gene (nif-gene) vanaf peulplante na graangewasse.

(ii) Oordrag van weerstand teen patogene en plae vanaf wilde plante na gewasplante.

(iii) Verbetering in kwaliteit en kwantiteit van saadproteïene.

(iv) Oordrag van gene vir dierlike proteïene na gewasplante.

(v) Eliminasie van ongewenste gene vir vatbaarheid vir verskillende siektes vanaf sitoplasmiese manlike steriele lyne in gewas soos mielies, waar sitoplasmiese manlike steriliteit en vatbaarheid in mitochondriale plasmied geleë is.

(vi) Verbetering van fotosintetiese doeltreffendheid deur hersamestelling van kern- en chloroplastgene en deur die moontlike omskakeling van C3 plant in C4 plante.

(vii) Ontwikkeling van sellyne wat voedsame voedsel in bioreaktore kan produseer.

Genetiese Ingenieurswese: Aansoek # 2. Toepassing op Geneeskunde:

Genetiese ingenieurswese het die afgelope paar jaar belangriker geword en dit sal in die huidige eeu belangriker word namate genetiese siektes meer voorkom en landbou-area verminder. Genetiese ingenieurswese speel 'n belangrike rol in die vervaardiging van medisyne.

Mikro-organismes en plantgebaseerde stowwe word nou gemanipuleer om groot hoeveelhede nuttige middels, entstowwe, ensieme en hormone teen lae koste te produseer. Genetiese ingenieurswese is gemoeid met die studie (oorerwingspatroon van siektes by die mens en versameling van menslike gene wat 'n volledige kaart vir oorerwing van gesonde individue kan verskaf.

Geenterapie waardeur gesonde gene direk in 'n persoon met gene wat wanfunksioneer ingevoeg kan word, is miskien die mees revolusionêre en mees belowende aspek van genetiese ingenieurswese. Die gebruik van geenterapie is goedgekeur in meer as 400 kliniese proewe vir siektes soos sistiese vesel-emfiseem, spierdistrofie, adenosien-deaminase-tekort.

Geenterapie kan eendag uitgebuit word om oorerflike menslike siektes soos hemofilie en sistiese fibrose te genees wat veroorsaak word deur ontbrekende of gebrekkige gene. In een tipe geenterapie word nuwe funksionele gene deur geneties gemanipuleerde virusse in die selle van mense ingevoeg wat nie sekere hormone of proteïene vir normale liggaamsfunksies kan produseer nie.

Die bekendstelling van nuwe gene in 'n organisme deur rekombinante DNA-tegnologie verander in wese proteïensamestelling en uiteindelik i liggaamskenmerke.

Rekombinante DNA-tegnologie word ook gebruik in die vervaardiging van entstowwe teen siektes. 'n Entstof bevat 'n vorm van 'n aansteeklike organisme wat nie ernstige siektes veroorsaak nie, maar wel veroorsaak dat die immuunstelsel van die liggaam beskermende teenliggaampies teen aansteeklike organismes vorm. Entstowwe word voorberei deur antigeen of proteïen wat op die oppervlak van virale deeltjies teenwoordig is, te isoleer.

Wanneer 'n persoon teen virussiekte ingeënt word, produseer antigene teenliggaampies wat teen die virale proteïene inwerk en hulle inaktiveer. Met rekombinante DNA-tegnologie kon wetenskaplikes die gene vir sommige virale skedeproteïene oordra na vacciniavirus wat teen pokke gebruik is.

Entstowwe wat deur geenkloning geproduseer word, is kontaminasievry en veilig omdat dit slegs laagproteïene bevat waarteen teenliggaampies gemaak word. Enkele entstowwe word geproduseer deur geenkloning, bv. entstowwe teen virale hepatitis-griep, herpes simplex-virus, virus-geïnduseerde bek-en-klouseer by diere.

Tot onlangs is die hormoon insulien slegs in beperkte hoeveelhede uit die pankreas van koeie en varke onttrek. Die proses was nie net duur nie, maar die hormoon het soms allergiese reaksies by sommige pasiënte met diabetes veroorsaak.

Die kommersiële produksie van insulien is in 1982 deur biogenetiese of rekombinante DNA-tegnologie begin en die mediese gebruik van hormooninsulien is in 1982 deur voedsel- en dwelmadministrasie (FDA) van die VSA goedgekeur.

Die menslike insuliengeen is in groot hoeveelhede in bakterie E. coli gekloon wat gebruik kan word vir die sintese van insulien. Geneties gemanipuleerde insulien is kommersieel beskikbaar as humilien.

Limfokiene is proteïene wat die immuunstelsel in die menslike liggaam reguleer, α -Interferon is een van die voorbeelde. Interferon word gebruik om virale siektes soos hepatitis, herpes, gewone verkoue sowel as kanker te beveg. Sulke middels kan in groot hoeveelhede in bakteriële sel vervaardig word.

Limfokiene kan ook nuttig wees vir vigspasiënte. Geneties gemanipuleerde interleukien-II, 'n stof wat vermenigvuldiging van limfosiete stimuleer, is ook beskikbaar en word tans op VIGS-pasiënte getoets.

'n Veertien aminosuur polipeptiedhormoon wat deur hipotalamus gesintetiseer is, is slegs in 'n klein hoeveelheid van 'n menslike kadavers verkry. Somatostatien wat gebruik word as 'n geneesmiddel vir sekere groeiverwante abnormaliteite blyk spesiespesifiek te wees en die polipeptied wat van ander soogdiere verkry word, het geen effek op die mens nie, vandaar die onttrekking daarvan uit hipotalamus van kadawers.

Genetiese ingenieurstegniek het gehelp met chemiese sintese van geen wat aan die pBR 322 plasmied DNA verbind en in 'n bakterie gekloneer word. Die getransformeerde bakterie word omgeskakel na somatostatien sintetiseringsfabriek. ADA (adenosien deaminase) tekort is 'n siekte soos gekombineerde immuungebrek wat die borrel seuntjie David in 1984 doodgemaak het.

Die kinders met ADA-tekort sterf voor hulle twee jaar oud is. Beenmurgselle van die kind na verwydering uit die liggaam is binnegeval deur 'n onskadelike virus waarin ADA geplaas is.

Eritropoëtien, 'n geneties gemanipuleerde hormoon, word gebruik om die produksie van rooibloedselle by mense wat aan ernstige bloedarmoede ly, te stimuleer.

Produksie van bloedstollingsfaktore:

Gewoonlik word hartaanval veroorsaak wanneer kransslagare deur cholesterol of bloedklont geblokkeer word. plasminogeen is 'n stof wat in bloedklonte voorkom. Geneties gemanipuleerde weefselplasminogeenaktiveerder (tPA) ensiem los bloedklonte op in mense wat hartaanvalle gekry het. Die plasminogeen-aktiveerderproteïen word vervaardig deur 'n genetegniese maatskappy wat so kragtig en spesifiek is dat dit selfs 'n hartaanval aan die gang kan stop.

Kanker is 'n gevreesde siekte. Teenliggaampies wat uit 'n enkele bron gekloon is en vir 'n spesifieke antigeen (monoklonale teenliggaampies) geteiken is, het baie nuttig in kankerbehandeling bewys. Monoklonale teenliggaampies is teiken met radioaktiewe elemente of sitotoksiene soos Ricin van kastersaad om hulle meer dodelik te maak. Sulke teenliggaampies soek kankerselle en maak hulle spesifiek dood met hul radioaktiwiteit of gifstof.

Genetiese Ingenieurswese: Aansoek # 3. Energieproduksie:

Rekombinante DNA-tegnologie het geweldige omvang in energieproduksie. Deur hierdie tegnologie is Ii nou moontlik om energiegewasse of biobrandstof wat vinnig groei te bio-ingenieurswese te maak om groot biomassa te lewer wat as brandstof gebruik word of in olies, alkohole, diesel of ander energieprodukte verwerk kan word.

Die afval hiervan kan in metaan omgeskakel word. Genetiese ingenieurs probeer geen vir sellulase oordra na behoorlike organismes wat gebruik kan word om afval soos saagsels en mieliestronke eers na suiker en dan na alkohol om te skakel.

Genetiese Ingenieurswese: Aansoek # 4. Toepassing op Nywerhede:

Geneties ontwerpte bakterieë word in gebruik geneem vir die opwekking van industriële chemikalieë. 'n Verskeidenheid organiese chemikalieë kan op groot skaal gesintetiseer word met behulp van geneties gemanipuleerde mikroörganismes. Glukose kan uit sukrose gesintetiseer word met behulp van ensieme wat van geneties gemodifiseerde organismes verkry word.

Deesdae is met die hulp van genetiese ingenieurswese stamme van bakterieë en sianobakterieë ontwikkel wat ammoniak op groot skaal kan sintetiseer wat gebruik kan word in die vervaardiging van kunsmis teen baie goedkoper koste. Mikrobes word ontwikkel wat sal help met die omskakeling van sellulose na suiker en van suiker na etanol.

Rekombinante DNA-tegnologie kan ook gebruik word om die agteruitgang van vullis, petroleumprodukte, naftaleen en ander industriële afval te monitor.

Bakterie pseudomonas fluoressens byvoorbeeld geneties verander deur die oordrag van ligproduserende ensiem genaamd luciferase wat in bakterie vibrio fischeri voorkom, produseer lig eweredig aan die hoeveelheid van sy afbreekaktiwiteit van naftaleen wat manier bied om die doeltreffendheid van die proses te monitor.

Mielies en sojabone word grootliks deur swart snywurm beskadig. Pseudomonas fluorescens word in assosiasie met mielies en sojabone aangetref. Bacillus thuringiensis bevat 'n geen wat patogenies vir die plaag is. Die plaag het oor die jare nie net gevaarlik vir die gewasse geword nie, maar het weerstand teen 'n aantal plaagdoders ontwikkel.

Toe die geen van B. thuringiensis (Bt) in pseudomonas fluoressensie gekloneer en in die grond ingeënt is, is gevind dat geneties gemanipuleerde pseudomonas fluorescens die dood van snywurms kan veroorsaak.


'n CRISPR-dCas Toolbox vir Genetiese Ingenieurswese en Sintetiese Biologie

Programmeerbare beheer van geenuitdrukking is noodsaaklik om geenfunksie te verstaan, sellulêre gedrag te manipuleer en terapeutika te ontwikkel. Behalwe die geenredigeringstoepassings wat deur die nuklease CRISPR-Cas9 en CRISPR-Cas12a moontlik gemaak word, bied die uitvinding van die nuklease-dooie Cas-molekules (dCas9 en dCas12a) 'n platform vir die presiese beheer van genoomfunksie sonder geenredigering. Verskeie dCas-instrumente is ontwikkel, wat 'n omvattende gereedskapskis uitmaak wat voorsiening maak vir ondervraging van geenfunksie en modulasie van die sellulêre gedrag. Hierdie oorsig gee 'n opsomming van huidige toepassings van die dCas-instrumente vir transkripsieregulering, epigenetiese ingenieurswese, genoombeelding, genetiese skerms en chromatien-immunopresipitasie. Ons beklemtoon ook die voordele en bestaande uitdagings van die huidige dCas-instrumente in genetiese ingenieurswese en sintetiese biologie, en verskaf perspektiewe op toekomstige rigtings en toepassings.

Sleutelwoorde: CRISPRi/a dCas9 epigenoom-ingenieursgeenregulering genetiese sifting.


Nuwe toepassings van sintetiese biologie gereedskap vir sianobakteriese metaboliese ingenieurswese

Sianobakterieë is belowende mikroörganismes vir volhoubare biotegnologieë, maar die ontsluiting van hul potensiaal vereis radikale herontwerp en toepassing van die nuutste sintetiese biologie tegnieke. In onlangse jare het die beskikbare toestelle en strategieë vir die wysiging van sianobakterieë toegeneem, insluitend vooruitgang in die ontwerp van genetiese promotors, ribosoombindingsplekke, riboswitches, verslaggewerproteïene, modulêre vektorstelsels en merkerlose seleksiestelsels. As gevolg van hierdie nuwe gereedskapstelle is sianobakterieë suksesvol ontwerp om heteroloë weë uit te druk vir die produksie van 'n wye verskeidenheid waardevolle verbindings. Sianobakteriese stamme met die potensiaal om in werklike toepassings gebruik te word, sal die verfyning vereis van genetiese stroombane wat gebruik word om die heteroloë weë uit te druk en ontwikkeling van akkurate modelle wat voorspel hoe hierdie weë die beste geïntegreer kan word in die groter sellulêre metaboliese netwerk. Hierin hersien ons vordering wat gemaak is om sintetiese biologie-instrumente in sianobakteriese model-organismes te vertaal en som eksperimentele en in silico strategieë wat aangewend is om hul bioproduksiepotensiaal te verhoog. Ten spyte van die vooruitgang in sintetiese biologie en metaboliese ingenieurswese gedurende die laaste jare, is dit duidelik dat nog verdere verbeterings nodig is indien sianobakterieë mededingend met heterotrofiese mikroörganismes wil wees vir die bioproduksie van verbindings met toegevoegde waarde.

Sleutelwoorde: sianobakterieë genoom skaal modelle metaboliese ingenieurswese fotosintese sintetiese biologie.

Syfers

Regulerende meganismes van induseerbare promotors ...

Regulerende meganismes van induseerbare promotors wat onlangs in sianobakterieë ingebring is. (A) Arabinose-induseerbare geenuitdrukking ...

CRISPR- cas tegnologie wat gebruik word vir...

CRISPR- cas tegnologieë wat gebruik word vir genoomredigering van sianobakteriese genoom. (A) CRISPR- geval...

Skematiese voorstelling van ingenieurstrategieë...

Skematiese voorstelling van ingenieurstrategieë wat fotosintetiese aktiwiteit in sianobakterieë verhoog. Gebruik tans ATP...

Ontwikkeling van sianobakteriese GSM'e. Vroeë…

Ontwikkeling van sianobakteriese GSM'e. Vroeë sianobakteriese GSM's is ontwikkel gebaseer op biochemiese data ...


Die evolusie van genetiese ingenieurswese

Tekenprentkristalstruktuur van die TALEN-geenredigeringstegnologie. (Krediet: Gersbach Lab). Krediet: Duke Universiteit

Charles Gersbach, die Rooney-familie-medeprofessor in biomediese ingenieurswese aan die Duke Universiteit, lei 'n laboratorium wat gesentreer is op die ontwikkeling en toepassing van genoomingenieursinstrumente - veral CRISPR-gebaseerde tegnologie. CRISPR-Cas is 'n bakteriële verdedigingstelsel wat bakterieë in staat stel om RNA-molekules en CRISPR-geassosieerde (Cas) proteïene te gebruik om die DNA van indringer virusse te teiken en te vernietig. Die ontdekking van hierdie tegniek het 'n genoomredigeringsrevolusie ontketen toe navorsers ondersoek het hoe die instrument gebruik kan word om spesifiek DNS in menslike selle te teiken en te redigeer.In die jare sedert die ontdekking daarvan het Gersbach en sy laboratorium hierdie tegnologie gebruik om genetiese siektes soos Duchenne-spierdistrofie te bestudeer, gene-uitdrukking presies te beheer en selfs gereedskap te ontwikkel wat CRISPR meer akkuraat kan maak.

Hoe het genetiese ingenieurswese jou navorsingsgebied geword?

Ek het geweet dat ek 'n akademiese loopbaan wil volg waar ek kan help om regeneratiewe medisyne en geen- en selterapieë te bevorder. Ek wou aan iets werk wat baie verskillende gebiede binne bio-ingenieurswese kan beïnvloed, en ek het besef dat geenuitdrukking 'n sentrale komponent van 'n verskeidenheid navorsing is.

Daar was verskillende vleuels in die gebou waar ek op nagraadse skool gewerk het, elkeen het gefokus op regeneratiewe medisyne aangesien dit verband hou met 'n spesifieke orgaanstelsel. In verskillende dele van die gebou kan jy na plakkate kyk vir kardiovaskulêre navorsing of muskuloskeletale navorsing, of dinge wat verband hou met diabetes of neurologiese werk. Al hierdie onderwerpe het in wese behels om selle te probeer kry om iets interessants te doen. As 'n baie vereenvoudigde voorbeeld, as ons wil hê dat selle soos kraakbeenselle moet optree, slaan ons in wese op hulle met meganiese krag en hoop dat hulle die kraakbeengene aanskakel, en as ons wil hê dat selle soos neurone moet optree, skok ons ​​hulle elektries en hoop dat dit skop die neuronale gene in rat. In al hierdie gevalle pas jy eksterne stimuli toe en hoop dat die regte gene intern uitgedruk word. As die doel oor al hierdie gebiede is om die regte gene aan en af ​​te kry, was ek nuuskierig of daar 'n beter of meer direkte tegnologie was om in te gaan en geenuitdrukking te programmeer.

CRISPR is 'n relatief nuwe tegnologie. Hoe was dit uiteindelik die fokus van jou laboratorium se werk by Duke?

Die eerste referaat wat die gebruik van CRISPR in menslike selle beskryf het, is in 2013 gepubliseer, so ons het gewerk met tegnologieë wat dit voorafgegaan het. Die eerste was gemanipuleerde sinkvingerproteïene, wat gebruik kon word om 'n spesifieke streek van die genoom te verander. Mense het destyds sinkvingers gebruik om transkripsiefaktore te maak wat gene aan en af ​​kon skakel en geenuitdrukking kon reguleer, maar die tegnologie was regtig moeilik om mee te werk, so dit het nie regtig posgevat nie, en daar was net 'n paar laboratoriums in die wêreld wat daarmee gewerk het. Ek het gedink dat as ek saam met een van hulle opgelei het, die wêreld my oester sou wees, so ek het vir drie jaar in San Diego opgelei en daardie kundigheid as my toonhoogte gebruik om 'n laboratorium by Duke in 2009 te begin.

Twee jaar nadat ek by Duke begin het, het 'n nuwe tegnologie uitgekom, genaamd TALENs, wat nog 'n instrument was wat proteïene kon maak om spesifieke volgordes in die genoom te teiken. Dit was baie makliker om te gebruik as sinkvingers, maar voordat dit 'n kans gehad het om op te styg, het CRISPR gekom.

CRISPR is baie maklik om te gebruik, so my ou droom dat ek een van die enigste mense in die wêreld sou wees wat geweet het hoe om hierdie goed te doen, het by die deur uitgegaan. Ek het destyds gedink: "Goed, ek is net vier jaar in my akademiese loopbaan heeltemal uitgedien." Behalwe dat ons baie kundigheid en modelstelsels opgebou het om hierdie gereedskap te gebruik, en ek was gelukkig om 'n paar baie briljante en hardwerkende studente en genote in die laboratorium te hê, sodat ons vinnig die CRISPR-reagense kon gryp en gebruik hulle vir ons eie werk. Op 3 Januarie 2013 is die eerste twee referate wat CRISPR in menslike selle gebruik, aanlyn in Science gepubliseer, en drie weke later het ons reeds die plasmiede verkry en CRISPR-gebaseerde eksperimente in ons eie laboratorium gedoen wat gewerk het. Ons eerste CRISPR-vraestel het ses maande later gekom.

Hoekom het jy gekies om te fokus op die gebruik van CRISPR om Duchenne-spierdistrofie te bestudeer?

Die eerste projek wat my laboratorium in 2009 begin het, was geenredigering vir Duchenne-spierdistrofie deur die sinkvingertegnologie te gebruik. DMD is die mees algemene oorgeërfde genetiese siekte, maar in 2009 was daar regtig geen terapieë of opsies beskikbaar om mense met die siekte te help nie, wat progressiewe degenerasie van hul spiere veroorsaak. Ek was ook 'n splinternuwe assistent-professor, so ek wou iets doen wat twee stappe voor was waarna almal gekyk het, maar dit moes 'n tasbare genoeg doelwit wees sodat ons duidelike vordering kon maak, en generedigering vir gespierde distrofie was in lyn met daardie kriteria.

Voorheen het mense na maniere gekyk om stamselle te verander en dit terug in spiere te plaas, maar om al die spierselle in die liggaam te vervang is nie regtig haalbaar nie. Hulle het ook gemodifiseerde virusse gehad om gene aan spiere te lewer, maar die geen wat in hierdie geval gemuteer is, is ook een van die grootste gene in die menslike genoom, so dit pas nie in tipiese geenterapie-vektore nie. In plaas daarvan het die idee om die kopie van die geen wat reeds in die genoom is reg te maak, eerder as om dit te probeer lewer, na 'n aantreklike geleentheid gelyk. Ons het dus aan daardie benadering gewerk, en eintlik sinkvingers en TALENs gebruik totdat CRISPR-gebaseerde geenredigering ontdek is en ons gesien het hoe maklik dit was om te gebruik.

Ons werk met Duchenne-spierdistrofie is aan die gang. Mees onlangs het ons 'n referaat in Natuurgeneeskunde wat getoon het dat 'n enkele sistemiese behandeling die DMD-mutasie vir meer as 'n jaar in muise kon regstel.

Wat is die dinge wat jy nie vandag met CRISPR kan doen nie, wat jy wil kan doen?

Ek dink dit sal nuttig wees om geen redigering te doen sonder om die genoom te sny. Die oplossing vir daardie probleem kan 'n nuwe weergawe van CRISPR behels, of dit kan iets heeltemal anders behels. Maar ons leer elke dag meer oor hierdie stelsels - tien jaar gelede het dit twee jaar geneem om 'n projek te doen wat geenredigering behels, en nou kan jy dit oor 'n week of twee doen. Daar is baie geure van CRISPR, waar Cas9 die proteïen wat die meeste gebruik word, maar navorsers het tientalle ander tipes Cas9s en selfs ander CRISPR-proteïene en komplekse ontdek, insluitend Cas12, Cas13, Cas14, Cas3 en selfs Cascade, en elk van hierdie stelsels leen hom tot 'n unieke gebruik.

As jy vorentoe kyk met CRISPR, waaroor is jy die meeste opgewonde?

Die heel eerste kliniese proewe vir CRISPR by mense het vanjaar begin. Ons sien die eerste proewe vir kanker, vir sekelselsiekte en vir seldsame, oorgeërfde vorme van blindheid. En ons sal die resultate van daardie proewe in die volgende jaar of twee hê, so dit is baie opwindend en beslis naby die bopunt van die lys.

Ek dink ook ons ​​is nou op 'n plek waar CRISPR ten volle by die geneesmiddelontwikkelingsproses geïntegreer is. Nie net CRISPR as 'n terapie nie, maar CRISPR om modelstelsels en sellyne te maak om beter medisyne te ontwerp. Ek dink CRISPR sal medisyne dramaties beïnvloed op 'n manier wat bo en behalwe om CRISPR direk as 'n terapie te gebruik. Trouens, ons het 'n maatskappy, Element Genomics, begin om dit te doen deur die ontwikkeling van geneesmiddels met hierdie instrumente te fasiliteer, om nie noodwendig CRISPR as die terapie te gebruik nie. Dit is subtiel, so mense besef nie noodwendig dat dinge soos CRISPR in die agtergrond werk om biologiese navorsing meer gevorderd te maak om te help om met nuwe middels vorendag te kom nie.


Kyk die video: Ingénieur bio-médical (September 2022).