Inligting

Verbetering van transformasie doeltreffendheid - veroorsaak supercoiling?

Verbetering van transformasie doeltreffendheid - veroorsaak supercoiling?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Uit my beperkte kennis van die wetenskap weet ek dat transformasie een van die moeilikste stappe in kloning kan wees, en dat 'n groot hoeveelheid navorsing/trial and error gedoen is om hierdie stap te verbeter. Ek het gehoor elektroporasie is die mees doeltreffende tegniek, alhoewel ek geen verwysing het nie, en natuurlik het die sel, media en duur almal belangrike dele om in die proses te speel.

Ek het egter nog nooit gehoor van supercoiling as 'n belangrike faktor nie. Die grootte van die plasmied speel 'n groot rol in transformasie, so intuïtief laat dit my dink om die plasmied voor transformasie te superrol, sal die doeltreffendheid verbeter. Ek het gedink transformasie was bloot DNA wat deur gate diffundeer, maar word dele van die plasmied nodig om te bind/interaksie met die gasheer?

Hoekom word ons nie voorgestel dat ons superspoel voor transformasie nie? Ek het verskeie gedagtes, maar ek raai net:

  • Is dit omdat gyrase die integriteit van DNA kan ontwrig?
  • Of is dit net 'n duur ensiem en die wins is nie die moeite werd nie?
  • Of dalk verminder supercoiling die doeltreffendheid van daaropvolgende plasmiedvoorbereidings/transkripsie (hoewel die gasheer se natuurlike ensieme in elk geval nie sou oprol nie?)

Hier is 'n verslag wat 'n aansienlike toename in transformasiedoeltreffendheid vir groot plasmiede toon (transformasie was deur elektroporasie. Die referaat is egter minder as tien keer aangehaal, so duidelik het die tegniek nie vasgevang nie.

Zhixing, Y en Nahon, J-L (1995) DNA-gyrase verbeter DNA-transformasie van E.coli-selle met groot rekombinante plasmiede. Nukleïensure Res. 23:3353-3354


DNA Supercoiling

Abstrak

DNA supercoiling beskryf 'n hoër-orde DNA struktuur. Die dubbelheliese struktuur van DNS behels die ineenwikkeling van twee komplementêre stringe om mekaar en om 'n gemeenskaplike heliese as. Die kronkeling van hierdie heliese as in die ruimte definieer die DNA superheliese struktuur (DNA tersiêre struktuur). Vir 'n sirkelvormige DNS of 'n liniêre DNS met sy ente geanker om 'n lus te skep, is daar 'n stywe topologiese koppeling tussen die DNS-superheliese struktuur en die dubbelheliese struktuur (DNS sekondêre struktuur). Gevolglik kan DNS-superhelisiteit die DNS-wikkeling/afwikkeling beïnvloed, en sodoende die biologiese funksies van DNS beïnvloed. In die natuur bestaan ​​daar 'n alomteenwoordige klas ensieme, DNS-topoisomerases, wat die topologiese transformasie in DNS-molekules kan bemiddel.


Abstrak

Grapevine (Vitis spp.) is een van die ekonomies belangrikste vrugtegewasse wêreldwyd, en daar is aansienlike belangstelling in die verbetering van sy belangrikste agronomiese en enologiese eienskappe in reaksie op voortdurend veranderende landbou-omgewings en verbruikersvereistes. Veral molekulêre genetiese tegnieke, geassosieer met vinnige tegnologiese vooruitgang, bied 'n aantreklike alternatief vir konvensionele teelbenaderings vir die ontwikkeling van nuwe wingerdvariëteite met verbeterde opbrengsprestasie, kwaliteit, stresverdraagsaamheid en siekteweerstand. Tot op hede is verskeie wingerdvariëteite getransformeer met gene wat met uiteenlopende funksies geassosieer word deur biolistiese bombardement en/of Agrobacterium-gemedieerde transformasie, en transgeniese druiflyne is verkry met behulp van gevestigde regenerasiestelsels. Nietemin is getoon dat 'n wye reeks faktore, insluitend genotipe, uitplantbron en kultuurmedium, die doeltreffendheid van plantherlewing beïnvloed. Boonop beïnvloed die seleksie en gebruik van akseptormateriale, bakteriële stam en seldigtheid, selekteerbare merkers en seleksiemetodes ook transformasiedoeltreffendheid. Hierdie referaat verskaf 'n oorsig van onlangse vooruitgang in wingerdherlewing en genetiese transformasie en in-diepte bespreking van die belangrikste beperkende faktore, en bespreek belowende toekomstige strategieë om robuuste plantherlewing en genetiese transformasie in wingerdstok te ontwikkel.


Die verbetering van die elektro-transformasie doeltreffendheid van Corynebacterium glutamicum deur sy selwand te verswak en die sitoplasmiese membraanvloeibaarheid te verhoog

Om die transformasie doeltreffendheid van te verbeter Corynebacterium glutamicum selle met heterogene plasmied DNA en enkelstring DNA (ssDNA) met behulp van 'n metodologie gebaseer op elektro-transformasie.

Resultate

'n Semikomplekse hipertoniese medium is gekies met byvoeging van glisien en dl-treonien om selwande te verswak en byvoeging van Tween 80 en isonikotiensuurhidrasied om sitoplasmiese membraanvloeibaarheid te verhoog. Hulle inhoud is geoptimaliseer deur responsoppervlakmetodologie. Selgroei, elektro-transformasiebuffer en transformasieprotokol is ook geoptimaliseer. Tydelike verhittingsinaktivering van die gasheerbeperkingsensiem het 'n beduidende effek getoon. Laastens, 'n hoë transformasie-doeltreffendheid van 3.57 ± 0.13 × 10 7 cfu/μg DNA van plasmied en 1.05 × 10 6 Str R cfu per 10 9 lewensvatbare selle met 'n ssDNA is bereik.

Afsluiting

Die resultate werp lig op die toepassing in funksionele genomika en genoomredigering van C. glutamicum.


Bespreking

Ons het 'n PNA-gebaseerde toets ontwikkel wat ons in staat gestel het om supercoiled plasmiede tussen dekskyfies en krale vas te bind. Ons het die interne dinamika van individuele DNA-binders, beide supergedraaide plasmiede, ontspanne plasmiede en lineêre bindinge, sowel as proteïen-gemedieerde DNA-lus in 'n supergedraaide sisteem ondersoek.

Die RMSD's van supergedraaide, ontspanne en lineêre DNS is vergelyk, en daar is gevind dat die RMSD van die verstrengelde supergedraaide plasmied aansienlik kleiner was as dié van die ontspanne plasmied en lineêre binding, wat vergelykbaar was. Verder het ons gevind dat die supergedraaide plasmied 'n baie vinniger ontspanningstyd vertoon het as die ontspanne plasmied en die lineêre binding, wat analoog is aan verbeterde plek-jukstaposisie in die supergedraaide toestand. Hierdie bevindinge ondersteun voorheen gepubliseerde molekulêre dinamika-simulasies (19) en in vitro transkripsietoetse (18).

Die termodinamiese parameters van DNA-lus is voorheen bestudeer in vivo (21, 22) en deur enkelmolekule eksperimente met behulp van lineêre DNA (14). In laasgenoemde studie wat lineêre DNA gebruik het, het die resultate getoon dat DNS-lusvorming wat ses operateurs en ses CI-dimere behels relatief stabiel was, terwyl lusvorming wat slegs vier dimere behels (sonder dat OR3 en OL3 beset is) minder stabiel was. Dit blyk dat supercoiling van DNA lusstabiliteit verhoog in vergelyking met lusvorming van 'n lineêre DNA-binder. Die eksperimentele resultaat word ondersteun deur die feit dat die termodinamiese model 'n uitstekende passing tot die in vitro supercoiled DNA eksperimentele data verskaf het, wat parameters kon lewer wat ooreenstem met in vivo waarnemings (21, 22). 'N Meer onlangse in vitro studie met behulp van supercoiled sjablone in 'n transkripsie-toets het die verbetering van pRM-aktivering deur die oktameer-gemedieerde lus en die samewerkende rol van OL3 en OR3 in pRM-onderdrukking bevestig (12). Hierdie bevindinge dui daarop dat supercoiling die lusstabiliteit verhoog soos direk hier waargeneem.

Samevattend, ons het 'n enkele molekule-toets ontwikkel deur gebruik te maak van inheemse supercoiled DNA. Ons het die lus-waarskynlikhede as 'n funksie van CI-konsentrasie ondersoek en 'n skerper oorgang tussen lus- en ongelustoestande gevind as wat met lineêre DNA waargeneem is (14). Hierdie skerper oorgang word verwag vir die regulatoriese netwerk wat tussen litiese en lisogeniese toestande besluit. Deur 'n termodinamiese model by ons data te pas, het ons waardes vir die vrye energieë wat met lusvorming geassosieer word, verkry wat ooreenstem met waardes wat gerapporteer is vir in vivo inheemse supergedraaide DNA. Ons werk verskaf deurslaggewende insig in hoe supercoiling die dinamika van die lambda-skakelaar verander, die eerste epigenetiese skakelaar wat ontsyfer word en die skakelaar wat 'n paradigma vir transkripsieregulering geword het.


Draai-gebaseerde verkoeling deur NR-vesels te ply

Om skaalbaarheid te demonstreer, is verkoeling gemeet terwyl verskeie NR-vesels isometries losgemaak is. Deur sewe-laag 2.2 mm-deursnee NR-vesels (Fig. 2, D en E) te ontplooi, het hoër maksimum (−19.1°C) en gemiddelde (–14.4°C) oppervlakverkoeling gesorg as vir 600% rekvrystelling van 'n nie-gedraaide vesel ( −12.2°C) (Fig. 1B) of vir isometriese ontdraai van 'n 100% gestrekte enkelvesel (-15.5°C maksimum en -12.4°C gemiddeld) (Fig. 1C en fig. S15). Deur 100% van isometriese stamme los te maak, het dit die hoogste twistokaloriese verkoeling veroorsaak (fig. S23 en S24).

Gelei deur die ooreenstemming tussen twistokaloriese verkoeling vir enkelvesels wat dieselfde rek het, en 'n soortgelyke produk van draaidigtheid en gestrekte veseldeursnee (fig. S17), het ons gevind dat die twistokaloriese verkoeling wat met isometriese vesellaag geassosieer word, ongeveer afhang van die produk van die draai digtheid van plying en die effektiewe deursnee van die bondel (Deff = n 0.5 × Ds, waar n is die aantal vesels en Ds is die gestrekte vesel deursnee) (Fig. 2E).


Verbetering van transformasie doeltreffendheid - veroorsaak supercoiling? - Biologie

Alhoewel dit bekend is dat supercoiling van die DNA-sjabloon deur transkripsie geïnduseer kan word, word die meganisme en die doeltreffendheid van hierdie proses in vivo nie ten volle verstaan ​​nie. Ons rapporteer hier dat transkripsie van gene wat kodeer vir 16 S rRNA, 'n stabiele RNA spesie, of sitoplasmiese polipeptiede lei tot baie min of geen waarneembare DNA supercoiling selfs onder die optimum toestande in Escherichia coli. Dit dui aan dat hidrodinamiese weerstand op die transkripsiekompleks (insluitend RNA-polimerase, ontluikende RNA, ribosome en ontluikende polipeptiede) nie voldoende is om RNA-polimerase tydens gekoppelde transkripsie-translasie te anker nie. Aan die ander kant lei transkripsie van membraan-geassosieerde gene wat kodeer vir integrale binnemembraan of uitgevoerde periplasmiese polipeptiede tot oënskynlike DNA-supercoiling. Transkripsie van gene wat kodeer vir integrale binnemembraanpolipeptiede lei tot aansienlik groter verankering van RNA-polimerase as wat transkripsie van gene wat periplasmiese polipeptiede kodeer, doen. Dit kan verskille in die koppeling van transkripsie-translasie met membraanassosiasie tydens uitdrukking van hierdie twee klasse polipeptiede weerspieël. Bewyse word verder aangebied wat daarop dui dat die verankering van RNA-polimerase waarskynlik bereik word deur die interaksie van ontluikende polipeptiede met die sitoplasmiese oppervlak van die binnemembraan tydens gekoppelde transkripsie-translasie. Boonop kan transkripsies van 'n membraan-geassosieerde geen, onder sekere omstandighede, topologiese verankering van 'n RNA-polimerase veroorsaak wat 'n naburige geen transkribeer wat gewoonlik nie membraan-geassosieer is nie. Ten slotte word die potensiële biologiese gevolge van ons bevindinge bespreek.


Verwysings

Jiang W, Marraffini LA. CRISPR-Cas: nuwe gereedskap vir genetiese manipulasies van bakteriese immuniteitstelsels. Annu Rev Microbiol. 201569:209–28.

Deltcheva E, Chylinski K, Sharma CM, Gonzales K, Chao Y, Pirzada ZA, Eckert MR, Vogel J, Charpentier E. CRISPR RNA rypwording deur trans-gekodeerde klein RNA en gasheer faktor RNase III. Natuur. 2011471:602–7.

Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. 'n Programmeerbare dubbel-RNA-geleide DNA-endonuklease in adaptiewe bakteriële immuniteit. Wetenskap. 2012337:816–21.

Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genoom-ingenieurswese met behulp van CRISPR/Cas-stelsels. Wetenskap. 2013339:819–23.

Ma X, Zhu Q, Chen Y, Liu YG. CRISPR/Cas9-platforms vir genoomredigering in plante: ontwikkelings en toepassings. Mol Plant. 20169:961–74.

Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-geleide menslike genoom-ingenieurswese via Cas9. Wetenskap. 2013339:823–6.

Bosher JM, Labouesse M. RNA-inmenging: genetiese staf en genetiese waghond. Nat Cell Biol. 20002:E31–6.

Brodersen P, Voinnet O. Die diversiteit van RNA stilmaak paaie in plante. Tendense Genet. 200622:268–80.

Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. Rol vir 'n bidentaat ribonuklease in die aanvangstap van RNA-interferensie. Natuur. 2001409:363–6.

Schauer SE, Jacobsen SE, Meinke DW, Ray A. DICER-LIKE1: blinde mans and oliphants in Arabidopsis development. Tendense Plant Sci. 20027:487–91.

Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, Bartel B, Bartel DP. MikroRNA's in plante. Gene Dev. 200216:1616–26.

Xie Z, Johansen LK, Gustafson AM, Kasschau KD, Lellis AD, Zilberman D, Jacobsen SE, Carrington JC. Genetiese en funksionele diversifikasie van klein RNA-bane in plante. PLoS Biol. 20042:E104.

Deleris A, Gallego-Bartolome J, Bao J, Kasschau KD, Carrington JC, Voinnet O. Hiërargiese aksie en inhibisie van plant Dicer-agtige proteïene in antivirale verdediging. Wetenskap. 2006313:68–71.

Hutvagner G, Simard MJ. Argonaute-proteïene: sleutelspelers in RNA-stilte. Nat Rev Mol Cell Biol. 20089:22–32.

Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. 'n RNA-gerigte nuklease bemiddel post-transkripsionele geenstilte in Drosophila-selle. Natuur. 2000404:293–6.

Mi S, Cai T, Hu Y, Chen Y, Hodges E, Ni F, Wu L, Li S, Zhou H, Long C, et al. Sortering van klein RNA's in Arabidopsis-argonautkomplekse word gerig deur die 5'-terminale nukleotied. Sel. 2008133:116–27.

Singh RK, Pandey SP. Evolusie van strukturele en funksionele diversifikasie onder plant Argonautes. Plant Sein Gedrag. 201510:e1069455.

Carbonell A, Carrington JC. Antivirale rolle van plant ARGONAUTE. Curr Opin Plant Biol. 201527:111–7.

Scholthof HB, Alvarado VY, Vega-Arreguin JC, Ciomperlik J, Odokonyero D, Brosseau C, Jaubert M, Zamora A, Moffett P. Identifikasie van 'n ARGONAUTE vir antivirale RNA-stilte in Nicotiana benthamiana. Plant Fisiol. 2011156:1548–55.

Wang XB, Jovel J, Udomporn P, Wang Y, Wu Q, Li WX, Gasciolli V, Vaucheret H, Ding SW. Die 21-nukleotied, maar nie 22-nukleotied nie, virale sekondêre klein interfererende RNA's rig kragtige antivirale verdediging deur twee samewerkende argonaute in Arabidopsis thaliana. Plantsel. 201123:1625–38.

Zilberman D, Cao X, Jacobsen SE. ARGONAUTE4 beheer van lokus-spesifieke siRNA akkumulasie en DNA en histoon metilering. Wetenskap. 2003299:716–9.

Raja P, Sanville BC, Buchmann RC, Bisaro DM. Virale genoommetilering as 'n epigenetiese verdediging teen geminivirusse. J Virol. 200882:8997–9007.

Pumplin N, Voinnet O. RNA stilmaak onderdrukking deur plantpatogene: verdediging, teen-verdediging en teen-teen-verdediging. Nat Rev Microbiol. 201311:745–60.

Csorba T, Kontra L, Burgyan J. Virale stilmaakonderdrukkers: gereedskap wat gesmee is om gasheer-patogeen-naasbestaan ​​te verfyn. Virologie. 2015479-480:85–103.

Silhavy D, Molnar A, Lucioli A, Szittya G, Hornyik C, Tavazza M, Burgyan J. 'n Virale proteïen onderdruk RNA-stilte en bind stilmaking-gegenereerde, 21- tot 25-nukleotied dubbelstring-RNA's. EMBO J. 200221:3070–80.

Roth BM, Pruss GJ, Vance VB. Plant virale onderdrukkers van RNA-stilte. Virus Res. 2004102:97–108.

Gao SJ, Damaj MB, Park JW, Beyene G, Buenrostro-Nava MT, Molina J, Wang X, Ciomperlik JJ, Manabayeva SA, Alvarado VY, et al. Verbeterde transgeen-uitdrukking in suikerriet deur mede-uitdrukking van virus-gekodeerde RNA-stilte onderdrukkers. PLoS Een. 20138:e66046.

Senthil-Kumar M, Mysore KS. Virus-geïnduseerde genestilstelling kan vir meer as 2 jaar voortduur en ook na nageslagsaailinge in Nicotiana benthamiana en tamatie oorgedra word. Plant Biotechnol J. 20119:797–806.

Saxena P, Hsieh YC, Alvarado VY, Sainsbury F, Saunders K, Lomonossoff GP, Scholthof HB. Verbeterde vreemde geen-uitdrukking in plante met behulp van 'n virus-gekodeerde onderdrukker van RNA-stilte wat aangepas is om onskadelik vir ontwikkeling te wees. Plant Biotechnol J. 20109:703–12.

Chapman EJ, Prokhnevsky AI, Gopinath K, Dolja VV, Carrington JC. Virale RNA stilmaak onderdrukkers inhibeer die mikroRNA pad by 'n tussenstap. Gene Dev. 200418:1179–86.

Chen J, Li WX, Xie D, Peng JR, Ding SW. Virale virulensieproteïen onderdruk RNA-stilte-gemedieerde verdediging maar verhoog die rol van mikrorna in gasheer geenuitdrukking. Plantsel. 200416:1302–13.

Mao Y, Botella JR, Zhu JK. Oorerflikheid van geteikende geenmodifikasies geïnduseer deur plant-geoptimaliseerde CRISPR-stelsels. Cell Mol Life Sci. 201674:1075–93.

Mao Y, Zhang H, Xu N, Zhang B, Gou F, Zhu JK. Toepassing van die CRISPR-Cas-stelsel vir doeltreffende genoomingenieurswese in plante. Mol Plant. 20136:2008–11.

Miki D, Zhu P, Zhang W, Mao Y, Feng Z, Huang H, Zhang H, Li Y, Liu R, Qi Y, Zhu JK. Doeltreffende generering van diRNA's vereis komponente in die posttranskripsie-geen stilmaak-weg. Sci Rep. 20177:301.

Morel JB, Godon C, Mourrain P, Beclin C, Boutet S, Feuerbach F, Proux F, Vaucheret H. Vrugbare hipomorfiese ARGONAUTE (ago1) mutante wat benadeel is in post-transkripsionele geenstilte en virusweerstand. Plantsel. 200214:629–39.

Schott G, Mari-Ordonez A, Himber C, Alioua A, Voinnet O, Dunoyer P. Differensiële effekte van virale stilmaakonderdrukkers op siRNA en miRNA laai ondersteun die bestaan ​​van twee afsonderlike sellulêre poele van ARGONAUTE1. EMBO J. 201534:2593–4.

Vargason JM, Szittya G, Burgyan J, Hall TM. Grootte-selektiewe herkenning van siRNA deur 'n RNA-stilteonderdrukker. Sel. 2003115:799–811.

Danielson DC, Pezacki JP. Die bestudering van die RNA-stilte-weg met die p19-proteïen. FEBS Lett. 2013587:1198–205.

Varallyay E, Valoczi A, Agyi A, Burgyan J, Havelda Z. Plantvirus-gemedieerde induksie van miR168 word geassosieer met onderdrukking van ARGONAUTE1-akkumulasie. EMBO J. 201029:3507–19.

Liu W, Zhu X, Lei M, Xia Q, Botella JR, Zhu J-K, Mao Y. 'n Gedetailleerde prosedure vir CRISPR/Cas9-gemedieerde geenredigering in Arabidopsis thaliana. Wetenskapbulletin. 201560:1332–47.

Lobbes D, Rallapalli G, Schmidt DD, Martin C, Clarke J. SERRATE: 'n nuwe speler op die plant-mikroRNA-toneel. EMBO Rep. 20067:1052–8.

Duan CG, Zhang H, Tang K, Zhu X, Qian W, Hou YJ, Wang B, Lang Z, Zhao Y, Wang X, et al. Spesifieke maar interafhanklike funksies vir Arabidopsis AGO4 en AGO6 in RNA-gerigte DNA-metilering. EMBO J. 201434:581–92.

Henderson IR, Zhang X, Lu C, Johnson L, Meyers BC, Green PJ, Jacobsen SE. Dissekteer Arabidopsis thaliana DICER-funksie in klein RNA-verwerking, genestilte en DNA-metileringspatroonvorming. Nat Genet. 200638:721–5.

Mao Y, Zhang Z, Feng Z, Wei P, Zhang H, Botella JR, Zhu JK. Ontwikkeling van kiemlyn-spesifieke CRISPR-Cas9-stelsels om die produksie van oorerflike geenmodifikasies in Arabidopsis te verbeter. Plant Biotechnol J. 201514:519–32.

Zhang X, Henriques R, Lin SS, Niu QW, Chua NH. Agrobacterium-gemedieerde transformasie van Arabidopsis thaliana deur die blomdipmetode te gebruik. Nat Protoc. 20061:641–6.

Schmittgen TD, Livak KJ. Ontleed intydse PCR-data deur die vergelykende C(T)-metode. Nat Protoc. 20083:1101–8.


PLANTTRANSFORMASIE: Probleme en strategieë vir praktiese toepassing

AbstrakPlanttransformasie is nou 'n kernnavorsingsinstrument in plantbiologie en 'n praktiese hulpmiddel vir kultivarverbetering. Daar is geverifieerde metodes vir die stabiele bekendstelling van nuwe gene in die kerngenome van meer as 120 diverse plantspesies. Hierdie oorsig ondersoek die kriteria om planttransformasie te verifieer die biologiese en praktiese vereistes vir transformasiestelsels die integrasie van weefselkultuur, geenoordrag, seleksie en transgeenuitdrukkingstrategieë om transformasie in weerbarstige spesies en ander beperkings tot planttransformasie te bewerkstellig, insluitend regulatoriese omgewing, publieke persepsies , intellektuele eiendom en ekonomie. Omdat die koste van sifting van bevolkings wat diverse genetiese veranderinge toon die koste van transformasie ver oorskry, is dit belangrik om absolute en bruikbare transformasiedoeltreffendheid te onderskei. Die groot tegniese uitdaging wat planttransformasiebiologie in die gesig staar, is die ontwikkeling van metodes en konstrukte om 'n hoë persentasie plante te produseer wat voorspelbare transgeenuitdrukking toon sonder kollaterale genetiese skade. Dit sal antwoorde op 'n reeks biologiese en tegniese vrae vereis, waarvan sommige gedefinieer is.


Wenke en Gereelde Vrae

As jy nie bekommerd is oor transformasiedoeltreffendheid nie (soos wanneer jy 'n buis plasmied DNA het en net bakterieë moet transformeer sodat jy meer van die plasmied kan grootword), kan jy baie tyd bespaar deur baie stappe te verkort of oor te slaan en sal steeds genoeg kolonies kry vir jou volgende stap. Onthou dat elkeen van hierdie kortpaaie die doeltreffendheid van die transformasie sal verminder, so wanneer hoër doeltreffendheid nodig is, volg die volledige protokol.

  • Ontdooi die bekwame selle in jou hand in plaas van op ys
  • Verminder stap 4 van 20 - 30 minute tot 2 minute op ys voor hitteskok

Verkort of slaan die uitgroei oor (vir Ampicillien weerstand is dit ok om die uitgroei heeltemal oor te slaan, vir die ander antibiotika is dit 'n goeie idee om vir ten minste 20-30 minute te ontgroei)

Chemies bekwame selle is vinnig en maklik om te gebruik, maar is minder doeltreffend om groter plasmiede op te neem. As jy groot plasmiede moet transformeer, is dit 'n goeie idee om elektro-bevoegde selle te gebruik. In plaas daarvan om op die hitteskok staat te maak om die selle die DNA op te neem, word 'n elektromagnetiese veld op die sel/DNA-mengsel toegepas om membraanpermeabiliteit te veroorsaak. Om dit te kan doen, sal jy toegang tot 'n elektroporator en die toepaslike kuvette moet hê. Volg die vervaardiger se instruksies vir elkeen.

Kontroleer dat jy op 'n LB-agar-plaat plaas wat die korrekte antibiotika bevat. Die weerstandsgeen op jou plasmied moet ooreenstem met die antibiotika op die bord. Jy moet ook 'n positiewe kontrole byvoeg (baie maatskappye sluit 'n positiewe beheerplasmied in met hul bekwame selle) om te verseker dat jou transformasieprosedure werk.

Alhoewel dit teen-intuïtief kan wees, sal jy dikwels hoër transformasiedoeltreffendheid met minder DNA kry, veral wanneer hoogs bekwame selle gebruik word. As jy 100-1000 ng totale DNA in 'n afbinding gebruik het, sal jy dikwels meer kolonies kry as jy 1 μl van 'n 1:5 of 1:10 verdunning eerder as 1 μl direk gebruik.


Kyk die video: The Best SLEEP Music. 432hz - Healing Frequency. Deeply Relaxing. Raise Positive Vibrations (September 2022).