Inligting

Met watter g-krag begin bakterieë in 'n buis afporrel?

Met watter g-krag begin bakterieë in 'n buis afporrel?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek werk met C. elegans en bakterieë en ek wil ontslae raak van die bakterieë wat hulle eet deur die wurms te sentrifugeer sonder om die bakterieë te sentrifugering. Ek gebruik 'n g-krag van 600 en die bakterieë sentrifugeer soms steeds af. Watter g-krag sal ideaal wees om die wurms te korrel maar nie die bakterieë nie? Hang dit van die bakteriese spesie af?


Sentrifugering

Abstrak

Sentrifugering is 'n metode om molekules met verskillende digthede te skei deur hulle in oplossing om 'n as (in 'n sentrifuge-rotor) teen hoë spoed te draai. Dit is een van die mees bruikbare en mees gebruikte tegnieke in die molekulêre biologie laboratorium. Sentrifugering word gebruik om selle te versamel, DNA te presipiteer, virusdeeltjies te suiwer en om subtiele verskille in die konformasie van molekules te onderskei. Hierdie hoofstuk bespreek relatiewe sentrifugale krag ( g krag), hoe om te skakel g krag tot omwentelings per minuut (rpm), en hoe om die sedimentasietyd van 'n deeltjie tydens sentrifugering te bereken.


Berei die monsterbuise voor

Jy sal 1,5 ml buise gebruik om die DNA-monsters uit speeksel te onttrek.

Om te begin, berei elke buis voor deur hulle met 'n permanente merker te merk.

Selfs as jy net een monster het, is dit goeie praktyk om die buis duidelik te merk. Byvoorbeeld, as die monster van 'n persoon is, kan jy hul voorletters gebruik. Dit is ook 'n goeie idee om die datum van die monster te merk.

Berei soutoplossing voor

Jy sal soutwater nodig hê (soutoplossing) as 'n mondspoelmiddel om jou wangselle te versamel.

In 'n klein glasie of soortgelyk, meng 'n knippie tafelsout met water. ’n Skootglas is perfek hiervoor. Die afmetings hoef nie presies te wees nie. 'n Knippie sout vir 'n klein slukkie water is 'n goeie reël.

Jy hoef nie veel te maak nie – 'n klein slukkie is genoeg.

Hoekom die soutwater? In hierdie protokol is die doel om 'n monster van DNS uit wangselle te kry. Jou speeksel, nadat jy jou mond gespoel het, sal natuurlik wangselle bevat, wat tydens die protokol oopgebreek sal word om die DNA vry te stel. Die sout, dit wil sê natriumchloried, word gebruik om die DNA te stabiliseer sodra dit vrygestel is.

Spoel jou mond uit

Gooi die soutwater in jou mond. Moenie te veel gebruik nie, net 'n klein slukkie is genoeg. Spoel jou binnewange vir 30-60 sekondes kragtig uit. As jy klaar is, spoeg die soutoplossing in 'n nuwe glas. (of, as die skootglas wat jy gebruik het om die soutwater te meng leeg is, kan jy dit hergebruik).

Die doel van hierdie stap is om soveel as moontlik selle uit jou mond los te maak. Jy kan jou tande gebruik om liggies oor jou wange en tong te krap terwyl jy die soutwater in jou mond ronddraai. Jy kan ook met jou tong aan jou binneste wange raak. Wees versigtig om nie jouself seer te maak nie – daar is geen behoefte aan bloed nie, net speeksel met baie wangselle.

Plaas jou monster in die mikrosentrifugebuis

Vir hierdie stap sal jy jou speekselmonster gebruik (1), die mikrosentrifugebuis wat jy aan die begin gemerk het (2), en 'n oordragpipet (3).

Gebruik die oordragpipet om jou speekselmonster in die mikrosentrifugebuis oor te dra. Vul dit tot by die 1,5 ml-merk.

Sentrifugeer

Dit is tyd om die sentrifuge te gebruik. Dit sal gravitasiekrag gebruik om die monster te konsentreer.

Plaas die sentrifugebuis met jou speekselmonster in die sentrifuge. Maak seker dat jy die sentrifuge balanseer met 'n ander monster of met 'n ander teengewig.

As jy net een monster het, is die maklikste manier om die sentrifuge te balanseer om nog 'n buis met water te vul en dit as 'n balanseerbuis te gebruik.

Die gebruik van die sentrifuge op 'n ongebalanseerde manier is gevaarlik en sal die toestel breek. Volg ons wenke vir die balansering van 'n sentrifuge in die handleiding hier. In hierdie geval kan jy byvoorbeeld óf 'n tweede monster as 'n teenbalans gebruik óf 'n ander buis met water vul. Buise moet altyd gebalanseer word met 'n ander buis van gelyke gewig.

Sodra die monsterbuis in die sentrifuge-rotor gebalanseer is, maak die deksel toe en aktiveer die sentrifuge-module. Stel die spoed op 4 000 G en draai vir 90 sekondes.

Herwinning van die Pellet

Gaan die monsterbuis na nadat sentrifugering voltooi is. Al die wangselle moet nou in 'n klein wit balletjie aan die onderkant van die buis gekonsentreer word (1). Dit word 'n genoem korrel. Die oorblywende vloeistof (2), genoem die supernatant, moet duidelik wees.

In hierdie stap sal jy die supernatant verwyder, sodat net die wit korrel oorbly.
Maak seker dat jou korrel stewig aan die onderkant van die buis vasgemaak is. As dit is, kan jy die supernatant versigtig weggooi.

As die korrel nie stewig aan die onderkant van die buis geheg is nie, probeer om die monster weer in die sentrifuge te draai om dit aan die onderkant van die buis vas te maak. As dit los bly, kan jy die mikropipet met 'n vars punt gebruik om die supernatant stadig uit die buis oor te dra. Jy kan ook probeer om die oordragpipet te gebruik wat jy vroeër gebruik het, maar dit kan moeilik wees om te beheer en kan uiteindelik die korrel versteur.

Hersuspendeer die Pellet

Jy behoort nou 'n wit korrel in jou monsterbuis te hê. Dit moet omtrent die grootte van 'n vuurhoutjiekop wees.

As jou korrel kleiner as 'n vuurhoutjiekop is, sal jy dalk nie genoeg wangselle om 'n gekonsentreerde DNS-monster te kry nie. Gaan in daardie geval terug na stap 2 om bykomende wangselle uit speeksel te konsentreer. Jy kan dieselfde monsterbuis gebruik en eenvoudig meer monster by die bestaande korrel voeg.

Sodra jy 'n groot genoeg korrel het, kan jy die selle hersuspendeer in die oorblywende vloeistof wat nog in die buis is. Jy het nou 'n gekonsentreerde selmonster in 'n klein volume vloeistof.
Maak seker dat die buis toe is, en meng dan die selle van die korrel in die vloeistof deur die buis te tik. Die selle van die korrel word nou in die vloeistof hersuspendeer.

Oordrag

In hierdie volgende stap sal jy die mikropipet gebruik (1) om die hersuspendeerde monster oor te dra (2) in 'n 0,2 ml PCR-buis (3), sodat jy dit in die thermocycler kan verhit.

Stel eers die verstelbare pipet op die maksimum volume van 20μl.

Maak seker dat die pipet 'n nuwe pipetpunt het. Gebruik dan die pipet om die selmengsel van die monster na die 0.2mL PCR-buis oor te dra. Gaan voort totdat die PCR-buis amper vol is, of totdat jy geen monster oor het nie. Voeg soveel as moontlik van die selmengsel by die PCR-buis.

Etikettering van die PCR-buis

Laastens, klik die deksel van die PCR-buis toe en merk die buis om die monster te identifiseer, soortgelyk aan die sentrifugebuis.

Merk die kant van PCR-buise, nie die deksel nie. Die PCR-masjien het 'n verhitte deksel, so enige ink op die buisdeksel kan afkom.

Verhit die monster

In hierdie stap sal jy die termosikleerder as 'n hitteblok gebruik om die selle te kook en oop te bars, om die DNA in die oplossing vry te stel.

Plaas jou PCR buis met jou monster sel oplossing in die thermocycler blok.

Stel die thermocycler op om die monster vir 10 minute by 99°C te verhit.

Meng die monster

Nadat die monster vir 10 minute verhit is, sal ons dit weer voorberei vir sentrifugering.

Haal eers die PCR-buis uit die termocyclerblok.

Die blok en die verhitte deksel sal steeds warm wees, wees dus ekstra versigtig.

Flip die PCR-buis vir 5 sekondes om die monster te meng.

Sentrifugering van die monster

In hierdie stap sal jy die monster draai om die supernatant van die selrommel te skei. Nou het die selle gebars danksy die verhittingstap, die DNA sal uit die selle vrygestel word en in die supernatant dryf.

Die molekulêre gewig van DNA is ligter as die ander selmateriaal, soos proteïene en selwande. Deur die monster met sentrifuge te draai, skei ons die selmateriaal van die DNS, wat ons 'n skoner DNS-monster gee.

Om die PCR-buis met jou monster te draai (3) in die Bento Lab se mikrosentrifuge, sal jy die PCR-buisadapter moet gebruik (1) wat in 'n normale mikrosentrifugebuis sit (2) en skakel dit om om 'n PCR-buis te pas.

Onthou om jou sentrifuge te balanseer. Dus, as jy net met een monster werk, berei nog 'n PCR-buis voor met 'n hoeveelheid water gelykstaande aan jou monster.

Stel die sentrifuge om vir 90 sekondes teen 8kG te loop.

As jy hulp nodig het om die Bento Lab-sentrifuge te gebruik, gaan na die gebruikershandleiding. Sodra jy die deksel toe is, kies die tydmodus (1). Stel die krag (2) en tyd (3) in voordat dit bevestig word.

Maak die monster skoon vir berging

Na sentrifugering is al die selafval na die onderkant van die PCR-buis (1) gedwing, wat slegs die DNA in die vloeibare supernatant (2) laat. Die supernatant moet helder lyk, soos water.

Uiteindelik sal u die supernatant na 'n nuwe PCR oordra met behulp van die mikropipet.

Stel die mikropipet op 20μL en sit 'n nuwe punt op. Dra 40μL van die helder supernatant oor in die nuwe PCR-buis.

Wees versigtig om nie enige selafval in die nuwe buis te pipet nie. Jy moet net die helder vloeibare supernatant oordra. Deur enige van die selafval te vermy, sal die kans op inmenging met die DNS-monster verminder word.

Etikettering en berging

Die nuwe buis bevat nou net die DNA in die vloeistof. Dit word genoem die sjabloon voorbeeld, en kan nou verder gebruik word vir analise deur protokolle soos PCR te gebruik.

Benoem die buis weer, sodat jy kan identifiseer watter sjabloonmonster dit is.

Ten slotte, as jy nie die sjabloonmonster dadelik in 'n ander protokol gebruik nie, stoor dit in die vrieskas teen ongeveer -20°C. Dit sal die monster bewaar.

Alhoewel DNA self baie stabiel is, kan daar nog 'n paar ander proteïene in die monster wees wat dit mettertyd sal afbreek. Die doel van hierdie protokol is om die speekselmonster soveel as moontlik skoon te maak terwyl die DNA behoue ​​bly. Deur die monster in die vrieskas te stoor, sal enige reaksies van oorblywende proteïene vertraag en daarom sal die sjabloon DNS-monster langer bewaar word.


II. Verhoog die effek van swaartekrag: die sentrifuge.

Baie deeltjies of selle in 'n vloeibare suspensie sal, gegewe tyd, uiteindelik aan die onderkant van 'n houer gaan sit as gevolg van swaartekrag (1 x g). Die tydsduur wat vir sulke skeidings benodig word, is egter onprakties. Ander deeltjies, uiters klein in grootte, sal glad nie in oplossing skei nie, tensy dit aan hoë sentrifugale krag onderwerp word. Wanneer 'n suspensie teen 'n sekere spoed of omwentelinge per minuut (RPM) geroteer word, veroorsaak sentrifugale krag dat die deeltjies radiaal wegbeweeg van die rotasie-as. Die krag op die deeltjies (in vergelyking met swaartekrag) word Relatiewe Sentrifugale Krag (RCF) genoem. Byvoorbeeld, 'n RCF van 500 x g dui aan dat die sentrifugale krag wat toegepas word 500 keer groter is as die aarde se gravitasiekrag. Tabel 1 illustreer algemene sentrifugeklasse en hul toepassings.

Tabel 1. Klasse sentrifuges en hul toepassings

Tabel rol horisontaal

Sentrifuge klasse
Lae spoed Hoë spoed Ultra/mikro-ultra
Maksimum spoed (rpm x10 3 ) 10 28 100/150
Maksimum RCF (x10 3 ) 7 100 800/900
Pelletering toepassings
Bakterieë
Ja Ja (Ja)
Dier- en plantselle Ja Ja (Ja)
Kerne Ja Ja (Ja)
Neerslae Sommige Die meeste (Ja)
Membraanbreuke Sommige Sommige Ja
Ribosome/polisome - - Ja
Makromolekules - - Ja
Virusse - Die meeste Ja
Virusse - Die meeste Ja

() = kan gedoen word, maar nie gewoonlik vir hierdie doel gebruik nie.


Basiese beginsels in sentrifugering

Sentrifugering is 'n tegniek wat help om mengsels te skei deur middel van sentrifugale krag. 'n Sentrifuge is 'n toestel, gewoonlik aangedryf deur 'n elektriese motor, wat 'n voorwerp, bv. 'n rotor, in 'n rotasiebeweging om 'n vaste as plaas.

'n Sentrifuge werk deur die beginsel van sedimentasie te gebruik: Onder die invloed van gravitasiekrag (g-krag) skei stowwe volgens hul digtheid. Verskillende tipes skeiding is bekend, insluitend isopikniese, ultrafiltrasie, digtheidsgradiënt, faseskeiding en verpilling.

Pelletering is die mees algemene toepassing vir sentrifuges. Hier word deeltjies as 'n korrel aan die onderkant van die sentrifugebuis gekonsentreer en van die oorblywende oplossing, genoem supernatant, geskei. Tydens faseskeiding word chemikalieë van 'n matriks of 'n waterige medium na 'n oplosmiddel omgeskakel (vir addisionele chemiese of molekulêre biologiese ontleding). In ultrafiltrasie word makromolekules gesuiwer, geskei en gekonsentreer deur 'n membraan te gebruik. Isopikniese sentrifugering word uitgevoer deur gebruik te maak van 'n "selfgenererende" digtheidsgradiënt wat deur ewewigsedimentasie vasgestel is. Hierdie metode konsentreer die analise-passings met dié van die omliggende oplossing. Protokolle vir sentrifugering spesifiseer tipies die relatiewe sentrifugale krag (rcf) en die graad van versnelling in veelvoude van g (g-krag). Om met die rotasiespoed te werk, soos omwentelinge per minuut (rpm), is taamlik onakkuraat.

Belangrike definisies

Oor die algemeen spesifiseer toepassings vir sentrifugering die graad van versnelling wat op die monster toegepas moet word eerder as om 'n spesifieke rotasiespoed soos omwentelinge per minuut te spesifiseer. Die versnelling word tipies gegee in swaartekrag [× g] (of veelvoude van x g of g-krag), die standaard versnellingswaarde as gevolg van swaartekrag by die Aarde se oppervlak (9,81 m/s 2 ). Die onderskeid tussen rpm en rcf is belangrik, aangesien twee rotors met verskillende diameters wat teen dieselfde rotasiespoed (rpm) loop, verskillende versnellings (rcf) tot gevolg sal hê.

Aangesien die beweging van die rotor sirkelvormig is, word die versnellingskrag bereken as die produk van die radius en die kwadraat van die hoeksnelheid. Histories bekend as "relatiewe sentrifugale krag" (rcf), is dit die meting van die versnelling wat toegepas word op 'n monster binne 'n sirkelbeweging. Hierdie proses word gemeet in swaartekrag-eenhede
(× g).

Voorbeeld*

Rotor A Rotor B
Spoed 14 000 rpm 14 000 rpm
Radius 5,98 cm9,50 cm
Swaartekrag 13 100 × g20 817 × g

Soos genoem, wanneer dit gebruik word
rotors met verskillende radiusse vir sentrifugering, dieselfde rcf
(g-krag) moet gebruik word.

Albei sentrifuges kan 'n rotor met 1,5/2 ml buise teen dieselfde spoed (14 000 rpm) draai, maar die versnelling wat op die monsters toegepas word, is baie anders: 13 100 × g teenoor 20 817 × g, wat verskillende resultate tot gevolg het. Om die lewe makliker te maak en die data beter weer te gee, het sommige sentrifuges knoppies direk op die bedieningspaneel vir outomatiese omskakeling tussen rpm en rcf. As jou sentrifuge nie 'n rpm-rcf-omskakelaar het nie, kan jy die formule, die rpm-rcf-omskakelaar wat op die tuisbladsye van sentrifugeverskaffers gevind word, of 'n nomogram vir omskakeling gebruik. Die k-faktor is 'n parameter vir die sedimentasieafstand in 'n proefbuis. Hierdie faktor word ook opruimingsfaktor genoem en verteenwoordig die relatiewe verpillingsdoeltreffendheid van 'n sentrifugeringstelsel teen maksimum rotasiespoed. Oor die algemeen word die k-faktorwaarde gebruik om die tyd, t (in ure), te skat wat benodig word vir volledige sedimentasie van 'n monsterfraksie met 'n bekende sedimentasiekoëffisiënt gemeet in s (svedberg).

'n Klein k-faktor verteenwoordig 'n vinniger skeiding. Die waarde van die k-faktor word hoofsaaklik deur die rotordsnee bepaal. In vergelyking met rpm/rcf, het die gebruik van die k-faktor minder belangrik geword vir algemene sentrifugering prosesse. Veral vir ultrasentrifugering is die k-faktor steeds relevant.

Hoe om die regte sentrifuge vir jou toepassing te kies

As jy 'n gegewe protokol volg, maak seker dat jy dieselfde tipe rotor gebruik en die gegewe relatiewe sentrifugale krag (rcf) sowel as dieselfde temperatuur en looptyd toepas. Oor die algemeen moet die volgende groot parameters bepaal word vir 'n suksesvolle sentrifugering:

E: Bepaling van verlangde relatiewe sentrifugale krag

F: Gedefinieerde temperatuur tydens sentrifugering

Vaste-hoek of swaai-emmer rotors

Die mees algemene rotors in laboratorium sentrifugering is óf vaste-hoek óf swaai-emmer rotors. Slegs 'n paar toepassings vereis spesiale rotors soos deurlopende vloei rotors, drom rotors, en dies meer. Deurvloeirotors maak deurlopende vloeiversameling van neerslae moontlik. Hierdie stelsels word byvoorbeeld gebruik in die oes van fermenteerders of vir sapproduksie in die voedselindustrie. Spesiale pasgemaakte weergawes, geoptimaliseer vir die spesifieke toepassing, is nodig.

Vaste hoek rotor

Die ooglopende voordeel is die gebrek aan bewegende dele in die rotor. Dit lei tot laer metaalspanning (langer leeftyd), 'n hoër maksimum g-krag is moontlik en vir baie toepassings kan vinniger sentrifugeringstye gerealiseer word. Die beperkte kapasiteit (minder buigsaamheid) van die vastehoekrotor is die enigste nadeel. Die posisie van die korrel hang sterk af van die hoek van die buis, dit is van die kant na die onderkant van die buis geleë wanneer dit draai. Die meeste rotors het 'n hoek van 45° vir die buise. Hoe groter die hoek vir die buise, hoe stywer is die korrel. Kleiner rotorhoeke lei tot meer verspreide korrelareas.

Swaai-emmer rotor

Hierdie soort rotor is hoogs buigsaam vir die gebruik van verskillende buisformate, insluitend SBS-formaat plate, gebaseer op 'n wye reeks adapterstelsels en 'n hoë monsterkapasiteit. Die bewegende swaaibakonderdele lei tot verhoogde metaalspanning vir die rotor en die emmers aangesien die bakgewig 'n las op die twee spilpunte en groewe plaas. In vergelyking met 'n vastehoekrotor is 'n swaaiemmerrotor dus beperk tot 'n laer maksimum g-krag, wat tot langer sentrifugeringstye lei. Gebaseer op die swaai-emmer-beginsel, is die korrel in die onderkant van die buis geleë (horisontale posisie van die buis tydens die loop). Die herstel deur die gebruiker word vergemaklik in vergelyking met pellets wat aan die kant van die buis geleë is.


Metodes wat gebruik word vir die skeiding van deeltjies in sentrifugering: 3 metodes

Hierdie artikel werp lig op die drie metodes wat gebruik word vir die skeiding van deeltjies in sentrifugering.

Die drie metodes is: (1) Differensiële sentrifugering (2) sentrifugale elutriasie en (3) digtheidsgradiënt sentrifugering. Die Digtheid Gradiënt Sentrifugering metode bestaan ​​uit twee tegnieke. Die twee tegnieke is: (1) Tempo sonale tegniek en (2) Isopikniese sentrifugering tegniek.

Metode # 1. Differensiële sentrifugering:

Dit hang af van die sedimentasietempo van deeltjies van verskillende groottes en digtheid. Sentrifugasies sal aanvanklik die grootste deeltjies sedimenteer.

Vir deeltjies met dieselfde massa maar met verskillende digthede, sal die een met die hoogste digtheid eerste sedimenteer. Deeltjies met soortgelyke banddigthede kan gewoonlik doeltreffend van mekaar geskei word deur differensiële sentrifugering of temposonale metode, mits daar ten minste 10-voudige verskille in hul massas is.

In differensiële sentrifugering word die materiaal wat geskei moet word sentrifugaal in aantal breuke verdeel deur die toegepaste sentrifugale veld te vergroot. Die sentrifugale veld by elke stap word so gekies dat die spesifieke tipe materiaal sedimenteer. Enige tipe deeltjie wat oorspronklik in homogenaat teenwoordig was, kan gevind word in korrel of die supernatant of albei fraksies, afhangende van die tyd en spoed van sentrifugering en grootte en digtheid van deeltjies. Aan die einde van elke stadium word die korrel en supernatant geskei en korrel 'n paar keer gewas deur hersuspensie en hersentrifugering in homogeniseringsmedium.

Aanvanklik is alle deeltjies homogenaat homogeen deur die sentrifugebuis versprei. Tydens sentrifugeer partikels beweeg af in die sentrifugeerbuise teen hul onderskeie sedimentasietempo's en begin 'n korrel op die bodem van sentrifugeerbuis vorm. Ideaal gesproke word sentrifugering genoeg voortgesit om al die grootste klas deeltjies te korrel, die resulterende supernatant word dan teen 'n hoër spoed gesentrifugeer om mediumgrootte deeltjies te skei, ensovoorts.

Aangesien deeltjies van verskillende groottes en digthede egter homogeen versprei is met die aanvang van sentrifugering, is dit duidelik dat die korrel nie homogeen sal wees nie, maar 'n mengsel van al die gesedimenteerde komponente sal bevat, verryk met die vinnigste sedimenterende deeltjies. In die tyd wat nodig is vir volledige sedimentasie van swaarder deeltjies, sal van die ligter en mediumgrootte deeltjies, wat oorspronklik naby die onderkant van die buis gesuspendeer is, ook sedimenteer en dus die fraksie besoedel.

Suiwer voorbereiding van die korrel van die swaarste deeltjie kan dus nie in 'n enkele sentrifugeringstap verkry word nie. Dit is slegs die stadigste sedimenterende komponent van die mengsel wat in die supernatant oorbly nadat al die groter deeltjies gesedimenteer is, wat deur 'n enkele sentrifugeringstap gesuiwer kan word.

Die skeiding wat deur differensiële sentrifugering verkry word, kan verbeter word deur herhaalde hersuspensie en hersentrifugering onder soortgelyke toestand. Verdere sentrifugering van die supernatant met geleidelik toenemende sentrifugale velde lei tot sedimentasie van intermediêre en uiteindelik die kleinste en minste digte deeltjies. Ten spyte van sy inherente beperkings, is differensiële sentrifugering waarskynlik die mees algemeen gebruikte metode vir isolasie van selorganelle uit gehomogeniseerde weefsel.

Metode # 2. Sentrifugale elutriasie:

In hierdie tegniek kan die’ skeiding en suiwering van 'n groot verskeidenheid van selle van verskillende weefsels en spesies bereik word deur 'n sagte “was aksie” met behulp van 'n elutriator rotor. Die tegniek is gebaseer op die verskille in die opstelling in die skeidingskamer van die rotor, tussen die opponerende sentripetale vloeistofvloei en toegepaste sentrifugale veld wat gebruik word om deeltjies te skei hoofsaaklik op grond van verskille in hul grootte.

Die tegniek gebruik nie die digtheidsgradiënt nie en het voordeel dat enige medium wat heeltemal versoenbaar is met die deeltjies gebruik kan word. Deur hierdie skeiding kan baie vinnig bereik word, wat hoë selkonsentrasies en 'n baie goeie herstelopbrengs gee.

Metode # 3. Digtheid Gradiënt Sentrifugering:

Daar is twee metodes van digtheidsgradiëntsentrifugering, die tempo sonale tegniek en die isopikniese (iso-digtheid of gelyke digtheid) tegniek, en beide kan gebruik word wanneer kwantitatiewe skeiding van al die komponente van mengsel van deeltjies vereis word. Hulle word ook gebruik vir die bepaling van dryfdigthede en vir die skatting van sedimentasiekoëffisiënt.

(a) Tariefsonale tegniek:

Deeltjieskeiding deur die tempo sonale tegniek is gebaseer op verskille in die grootte, vorm en digtheid van deeltjies, die digtheid en viskositeit van die medium en die toegepaste sentrifugale veld. Subsellulêre organelle, wat verskillende digthede het, maar soortgelyk in grootte is, skei nie doeltreffend deur hierdie metode te gebruik nie, maar skeiding van proteïene met soortgelyke digthede en wat slegs 3 voue in relatiewe molekulêre massa verskil, kan maklik bereik word.

Die tegniek behels die versigtige lae van 'n monsteroplossing bo-op voorafgevormde vloeistofdigtheidgradiënt, waarvan die hoogste digtheid nie dié van die digste deeltjie wat geskei moet word, oorskry nie. Die funksie van gradiënt is hoofsaaklik om die vloeistofkolom in die buis te stabiliseer teen die bewegings wat voortspruit uit konvensionele strome en sekondêr om 'n gradiënt te produseer wat help om die resolusie van gradiënt te verbeter.

Die monster word dan gesentrifugeer totdat die verlangde mate van skeiding bereik is. Aangesien die tegniek tydafhanklik is, moet sentrifugering beëindig word voor enige van die geskeide sone-korrels aan die onderkant van die buis. Die tegniek word aangewend vir die skeiding van ensieme, RNA-DNA basters, ribosomale subeenheid, subsellulêre organel, ens.

(b) Isopikniese sentrifugasietegniek:

Isopikniese sentrifugering hang uitsluitlik af van die uitkoopdigtheid en nie van die vorm, grootte en tyd daarvan nie, die grootte van die deeltjie beïnvloed slegs die tempo waarteen dit sy isopikniese posisie in die gradiënt bereik. Die tegniek word gebruik om deeltjies van soortgelyke grootte maar van verskillende digtheid te skei. Oplosbare proteïene wat baie soortgelyke digthede het, kan dus gewoonlik nie deur hierdie metode geskei word nie, terwyl subsellulêre organelle effektief geskei kan word.

Die metodes is 'n kombinasie van sedimentasie en flotasie en behels die lae van die monster bo-op 'n digtheidsgradiënt wat oor die hele reeks deeltjiedigthede strek wat geskei moet word. Die maksimum digtheid van die gradiënt moet dus altyd die digtheid van die digste deeltjie oorskry. Tydens sentrifugering vind sedimentasie van die deeltjie plaas totdat die dryfdigtheid van die deeltjie en digtheid van die gradiënt gelyk is.

Op hierdie punt van isodeniteit vind geen verdere sedimentasie plaas nie, ongeag hoe lank sentrifugering voortduur, want die deeltjies dryf op die kussing van materiaal wat digtheid groter as hul eie het. Isopikniese sentrifugering, in teenstelling met die tempo sonale tegniek, is 'n ewewigsmetode, die partikel wat bande vorm om sones te vorm wat elk teen hul eie kenmerkende dryfdigtheid vorm.

In die geval waar nie alle komponente in 'n mengsel van deeltjies benodig word nie, kan 'n gradiëntreeks gekies word waarin ongewenste materiale sediment aan die onderkant van die buis sal wees en die hele deeltjies van belang sal dryf op hul onderskeie isopiniese posisies. So 'n tegniek behels 'n kombinasie van beide die koerssonale en isopiniese benaderings.

Kenmerke van gradiëntmateriaal:

Daar is geen ideale alledaagse gradiëntmateriaal nie. Die keuse van opgeloste stof hang af van die aard van die deeltjies wat gefraksioneer moet word.

Die gradiëntmateriaal moet:

i. Laat die begeerte tipe skeiding toe

iii. Wees inert teenoor biologiese materiaal en reageer nie met die sentrifuge, rotor, buise of doppe nie:

iv. Absorbeer nie lig by golflengtes wat geskik is vir spektrofotometriese monitering (sigbare of ultraviolet reeks), of andersins inmeng met toetsprosedures nie

v. Wees steriliseerbaar, nie-giftig of vlambaar

vi. Het weglaatbare osmotiese druk en veroorsaak minimum veranderinge in ioniese sterkte, pH en viskositeit

vii. Wees goedkoop en geredelik beskikbaar in suiwer vorm en in staat om 'n oplossing te vorm wat die digtheidsreeks dek wat nodig is vir 'n spesifieke toepassing sonder om die rotor te oorbeklemtoon

viii. Laat maklike skeiding van die monstermateriaal van die gradiëntmedium toe met verlies van die monster of sy aktiwiteit.

Algemeen gebruikte gradiëntmateriale is soute van alkalimetale (bv. sesium en rubidiumchloried), klein neutrale hidrofiele organiese molekules (bv. sukrose), hidrofiele makromolekules (bv. proteïene en polisakkariede), en 'n aantal diverse verbindings soos kolloïdale silika ( bv. percoll en ludox) en nie-ioniese gejodeerde aromatiese verbindings (bv. metrizamied, nycodenz en renogaffien).

Daar is gevind dat sukrose-oplossing, terwyl dit aan die nadele ly om baie viskeus te wees by digthede groter as 1.1 tot 1.2 g cm-3 en baie hoë osmotiese effekte uit te oefen, selfs by baie lae konsentrasies, die mees gerieflike gradiëntmateriaal vir temposonale skeiding. Gliserol word ook as gradiëntmateriaal gebruik veral vir die skeiding van ensieme, of alternatiewe media soos ficoll, metrizamide of percoll gradiënte kan gebruik word.

Nie-ioniese media, soos sukrose, gliserol, metrizamied, ficoll en percoll, word oor die algemeen as geslag beskou as ioniese soute soos sesiumchloried en kaliumbromied en vereis 'n laer sentrifugale velde om voldoende skeiding van deeltjies te verkry. In die geval van isopikniese skeiding, het geen enkele medium bevredigend bewys vir die isolasie van alle tipe biologiese deeltjies nie.

Ficoll het suksesvol gebruik vir die skeiding van heelsel- en subsellulêre organelle deur spoed sonale en isopikniese sentrifugerings. Sesium- en rubidiumsoute word uitsluitlik vir isopikniese skeidings gebruik en is die meeste gebruik vir die skeiding van hoëdigtheid opgeloste stowwe soos nukleïensure.

By hoë konsentrasies is hul hoë ioniese sterkte en osmolariteit egter geneig om intra- en inter-molekulêre bindings te ontwrig. Oor die algemeen is ioniese media gebruik vir die skeiding van nukleïensure, proteïene en virusse en nie-ioniese gejodeerde aromatiese verbindings, as gevolg van hul verhoogde veelsydigheid, is vir 'n veel groter verskeidenheid toepassings gebruik.


Hoe Sterf Werk

Nadat die hart ophou klop, begin die liggaam dadelik koud word. Hierdie fase staan ​​bekend as algor mortis, of die doodskilte. Elke uur val die liggaamstemperatuur ongeveer 1,5 grade Fahrenheit (0,83 grade Celsius) totdat dit kamertemperatuur bereik. Terselfdertyd, sonder sirkulasie om dit deur die liggaam te laat beweeg, begin bloed opdam en sak. Rigor mortis, of 'n verstywing van die liggaam, sit ongeveer twee tot ses uur na die dood in [bron: Marchant, Middleton].

Terwyl die liggaam as geheel dalk dood is, lewe klein dingetjies in die liggaam nog. Velselle, byvoorbeeld, kan lewensvatbaar geoes word vir tot 24 uur na die dood [bron: Mims]. Maar sommige dinge wat nog lewe lei tot die verrotting, of ontbinding, van die liggaam -- ons praat van klein organismes wat in die ingewande woon.

'n Paar dae na die dood begin hierdie bakterieë en ensieme die proses om hul gasheer af te breek. Die pankreas is vol soveel bakterieë dat dit in wese homself verteer [bron: Macnair]. Soos hierdie organismes hul weg na ander organe werk, word die liggaam verkleur, eers groen, dan pers, dan swart. As jy nie die verandering kan sien nie, sal jy dit gou genoeg ruik, want die bakterieë skep 'n aaklige ruikende gas. Behalwe om die kamer op te ruik, sal daardie gas die liggaam laat opblaas, die oë uit hul voetstukke bult en die tong laat swel en uitsteek. (In seldsame gevalle het hierdie gas na 'n paar weke genoeg druk geskep om ontbindende swanger vroue te veroorsaak om die fetus uit te dryf in 'n proses wat bekend staan ​​as doodskis geboorte.)

’n Week ná die dood het die vel blase en die geringste aanraking kan dit laat afval. 'n Maand na die dood sal die hare, naels en tande uitval. Die hare en naels, terloops, alhoewel daar lank gerugte is dat dit ná die dood aanhou groei, het geen magiese groei-eienskappe nie. Hulle lyk net groter soos die vel uitdroog. Interne organe en weefsels het vloeibaar geword, wat die liggaam sal swel totdat dit oopbars. Op daardie stadium bly 'n geraamte oor.

Nou, die meeste van ons sien nie daardie proses nie, want die wet vereis dat ons iets met die liggaam moet doen. Daar is eindelose moontlikhede: Ons kan 'n kis vir ons liggaam of 'n urn vir ons as kies. Ons kan gebalsem, gemummifiseer of gevries word. Daar is gerugte dat sommige kulture betrokke was by kannibalistiese rituele om die dooies te verteer, terwyl ander hul dooies blootgestel het aan die elemente vir diere om weg te karwei. Jy kan jou liggaam aan die wetenskap skenk of vra vir begrafnis op see. Maar tensy gemummifiseer of bewaar word, disintegreer liggame uiteindelik in die proses wat hierbo beskryf is. Begrafnis in 'n kis vertraag egter die proses geweldig, selfs die tipe grond waarin jy begrawe is, kan 'n verskil maak.

Die wegdoening van 'n dooie liggaam word grootliks deur kulturele en godsdienstige oortuigings gereguleer. Vroeë kulture het die dooies met hul gunsteling besittings (en soms hul gunsteling mense) vir die hiernamaals begrawe. Soms is krygers of dienaars staande begrawe, ewig gereed vir aksie. Ortodokse Jode omhul hul dooies en begrawe hulle op dieselfde dag as die dood, terwyl Boeddhiste glo dat bewussyn vir drie dae in die liggaam bly [bron: Mims]. Hindoes word veras, want daar word geglo dat verbranding die siel van die liggaam vrystel, terwyl Rooms-Katolieke oor verassing frons uit respek vir die liggaam as 'n simbool van menslike lewe [bronne: Mims Cassell et al].

Godsdiens en kultuur sal altyd met die dood verweef wees, en een groot invloedsgebied hou verband met die etiese vrae rondom die sterwensproses. Op die volgende bladsy sal ons sommige van die kwessies oorweeg.


Praktiese werk vir leer

Klas prakties

In vroeë studies van biologie fokus ons dikwels op verteringsensieme. Dit kan studente laat dink dat ensieme net werk om chemikalieë uitmekaar te breek. Hierdie ensiem-gekataliseerde sintese bied 'n alternatiewe ensiemreaksie wat lei tot die opbou van 'n nuwe molekule.

The aim of the investigation is to prepare an extract of potato tuber, remove starch from it, and then check for its ability to catalyse the synthesis of starch from different substrates.

Les organisasie

The enzyme extraction takes about half an hour. The extract can be stored overnight at 4 °C, but it will turn brown. To complete the investigation in one session, prepare the substrate solutions and set up the colorimeter while making the enzyme extract. Different groups could be responsible for different parts of the experiment.

Apparaat en chemikalieë

Vir elke groep studente:

Access to a water bath at 25 °C

Centrifuge, 3000 rpm/ RCF 1000 g (Nota 3)

2 medium-sized potatoes (Nota 4)

Vir die klas – opgestel deur tegnikus/onderwyser:

50 cm 3 of 1% glucose-1-phosphate, for up to 8 groups (Nota 1)

50 cm 3 of 1% glucose, for up to 8 groups

50 cm 3 of 1% maltose, for up to 8 groups

50 cm 3 of 1% sucrose, for up to 8 groups

Iodine solution (Nota 2)

Gesondheid en veiligheid en tegniese notas

1 Glucose-1-phosphate: Make up the solution by dissolving 0.5 g of glucose-1-phosphate in 50 cm 3 of distilled water (a 1% solution). The compound is unstable in solution, hydrolysing quite rapidly to glucose and phosphoric acid at room temperature. Prepare just before use, or store in a refrigerator (at 4 °C) for up to 24 hours. This, and the other sugar solutions, are described on the CLEAPSS Hazcard as LOW HAZARD.

2 Iodine solution: Iodine is only sparingly soluble in water (0.3 g per litre). It is usual to dissolve iodine in potassium iodide solution (KI) to make a 0.01 M solution (by tenfold dilution of a 0.1 M solution) to use as a starch test reagent. Refer to CLEAPSS Recipe card 33. For 100 cm 3 of 0.1 M solution, measure 3.0 g of potassium iodide (KI) into an appropriate beaker. Moisten the potassium iodide with a few drops of water. Measure out 2.54 g of iodine (see Hazcard 54: iodine is harmful) and add to the moistened potassium iodide. Add a small volume of water and stir. When no more iodine appears to dissolve, add some more water and stir. Repeat until all the iodine has dissolved. Pour the solution into a measuring cylinder and dilute to the final volume. If there are any bits of iodine remaining, return the solution to the beaker and leave it on a magnetic stirrer for several minutes. Add the solution to a labelled bottle and mix well.

3 Centrifuge: You need enough ‘centrifuge space’ to produce around 25 cm 3 of potato extract for each working group. A speed of just under 3000 revolutions per minute, corresponding to a relative centrifugal force (RCF, ‘g-force’) of just under 1000 g is enough to spin down starch grains.

SAFETY: The CLEAPSS Laboratory Handbook gives detailed information about the requirements of the British and International Standard (BS EN 61010-2-020) for centrifuges. Use this information to assess your school’s centrifuges if your documentation does not clearly state that they conform to this standard. The DfEE has stated that: ”Existing centrifuges not conforming to the safety requirements of this standard should not be used after 1 January 1997.” (From Safety in Science Education, HMSO, 1996, ISBN 011270915X). CLEAPSS advise that centrifuges which do not cut off the power to the rotor when the lid is raised, or have an exposed rotor, should be taken out of service. If using any centrifuge without a lock, users should not raise the lid until they can Hoor that the rotor has stopped.

4 Potatoes: Medium-sized potatoes are best. Large potatoes often have a poor yield of phosphorylase enzyme. Small new potatoes have such small grains of starch that they are difficult (or impossible) to spin down.

Prosedure

SAFETY: Ensure your centrifuge is safe to use and that students are briefed to use it correctly. Make eye protection available when iodine solution is dispensed.

Voorbereiding

a Make up a 1% solution of glucose-1-phosphate in distilled water (Nota 1).

b Make up iodine solution (Nota 2).

c Prepare the colorimeter by putting a known volume of water (say 3 cm 3 ) into your colorimeter cuvettes or bottle. Add 0.5 cm 3 or 1 cm 3 of iodine solution (Nota 2) and swirl to mix well. Make sure this liquid is deep enough in the vessel to provide an accurate reading in your colorimeter (by comparing with a full colorimeter vessel of the same solution). Use a yellow filter, as we will be following the formation of a blue starch-iodide complex (peak of absorption 580-600 nm). Record the reading from the iodine solution as the ‘zero’ reading for this procedure. Set up ‘clean’ cuvettes to follow the reaction with 2 cm 3 of water and 0.5 or 1.0 cm 3 of iodine solution. You will add 1.0 cm 3 of starchy solution to each of these.

Ondersoek

d Take two medium-sized potatoes, peel and cut into small pieces (Nota 4). Crush with a pestle and mortar or use a blender. Add water sparingly so that the resulting mash is just liquid enough to be poured from the container.

e Pour the crushed potato quickly through a single layer of muslin or nylon stocking.

f Transfer the extract to centrifuge tubes. Spin in a bench centrifuge for 5 minutes at the highest speed to separate the starch granules (Nota 3).

g After spinning, take one drop of clear liquid from the top of each tube. Test each drop on a white tile with iodine solution. If the blue colour characteristic of starch appears, centrifuge for a further 5 minutes.

h Repeat the iodine test and, if necessary, continue to centrifuge until no starch is detectable in the samples of clear liquid. Once the liquid is free of starch, carefully pour the clear liquid from each centrifuge tube into a single container. If this is to be kept overnight, stopper and refrigerate the container.

i Label 4 test tubes. Use a syringe to put 5 cm 3 of glucose-1-phosphate into a test tube. Place it in a water-bath at 25 °C. Use fresh syringes to measure 5 cm 3 of the other substrates into the other test tubes in the same water-bath. Record which substrate is in which tube.

j Use a syringe to measure four 5 cm 3 samples of the clear potato extract into each of four more test tubes, and place in the water bath at 25 °C.

k Add 5 cm 3 of potato extract from a tube in the water bath to each tube of substrate solution. Start the stopclock.

l After two minutes, take a single drop of the potato extract/ glucose-1-phosphate mixture. Mix it with a drop of iodine in one of the wells of a spotting tile. Look for a very slight colour change. If there is none, repeat at 2-minute intervals as recorded by the stopclock.

m As soon as the slightest trace of blue or grey colour appears on the tile, remove 1.0 cm 3 from the mixture into your colorimeter vessel containing 2 cm 3 of water and 0.5 cm 3 or 1.0 cm 3 of iodine solution. Meng goed. Record the colorimeter reading and the time.

n Using fresh iodine solution, carry out similar measurements with the other three extract/ substrate mixtures.

o Check the amount of enzyme extract/ substrate mixture left. Arrange to take more samples at regular intervals. Try to take at least 8 readings for each extract/ substrate mix. If colorimeter readings are changing rapidly from one sample to the next with a particular substrate, concentrate on that mixture and take samples as often as possible. Then return to the other extract/ substrate mixtures.

bl For each measurement, record the substrate, time, apparent colour (to your eye) and colorimeter reading.

q Convert the meter readings into starch concentrations using a calibration curve. (See associated practical on this site.)

Onderrignotas

After dealing with the digestion of starch, it is appropriate to ask how starch is formed in the first place. The tissue of potato tubes is a good source of the enzyme(s) responsible for the synthesis of starch.

Digestion of starch yields first maltose and then glucose, so synthesis could be a simple reversal of this process. Alternatively, the best substrate could be one of the compounds inside cells which is closely related to simple sugars an example is glucose-1-phosphate. This demonstration shows that an anabolic pathway need not be the simple reversal of the catabolic pathway. The hydrolysis of the glucose-1-phosphate provides the energy necessary to synthesise the starch.

The starch in potato tubers is stored inside cells in large granules which sediment on centrifugation. If you examine a drop of the glucose-1-phosphate/ enzyme mixture under a microscope at the end of the investigation, you may see starch granules 4 to 10 ?m in diameter.

The ‘lag phase’ at the beginning of the process suggests that the reaction is autocatalytic. CS Hanes (1940) demonstrated this by including small amounts of soluble starch to the reaction mixture this reduced the length of the lag phase. Your students are unlikely to come up with the idea of autocatalysis on their own however it is worth discussing as an example of the way in which graphs can be used to suggest and develop hypotheses.

Health & Safety checked, May 2009

Aflaaie

Download the student sheet Enzyme-catalysed synthesis (73 KB) with questions and answers.


Part 3: How do you choose a centrifuge?

Centrifuge speed

Centrifuges may be classified based on maximum speeds, measured as revolutions per minute (RPM). Speeds range from 0-7,500 RPM for low-speed centrifuges, all the way to 20,000 RPM or higher.

Centrifuge rotor speed is often expressed as RCF in units of gravity (x g) for various procedures. However, many centrifuges display speed as revolutions per minute (RPM), necessitating conversion to ensure the correct experimental conditions. The following formula is used to convert RPM to RCF, where R is the rotor radius (cm) and S is the speed (RPM):

Centrifuge size

Centrifuges are available as various benchtop or floor-standing models.

Floor-standing models offer greater sample capacity and can achieve high speeds. Superspeed centrifuges can achieve a maximum g-force (relative centrifugal force, RCF) of over 70,000 x g, and ultracentrifuges often used for DNA or RNA fractionation, can achieve up to 1,000,000 x g. For large-capacity, low-speed applications, low-speed centrifuges reaching approximately 7000 x g are available.

Benchtop models have a smaller footprint, and general-purpose models are ideal for a wide range of applications. There are many benchtop models available, including high-speed, microcentrifuge, clinical, and cell washer models. Clinical benchtop models and cell washers typically operate at lower speeds, and are suited to diagnostic applications, and washing debris from red blood cells.

Centrifuges for different applications

It is essential to select a centrifuge that is suited to the specific application. When purchasing a centrifuge, it is important to consider the following questions:

  • What sample volumes are you working with? For processes involving large or varying volumes, a floor-standing model with higher capacity and different rotor configurations may be the best solution.
  • Are samples temperature sensitive? If so, a centrifuge with refrigeration and temperature control options is required.
  • Will the centrifuge be used for processing clinical or blood banking samples? Cell washers or clinical models are available for these specific applications.
  • How much laboratory space is available vs the centrifuge footprint?
  • What is the maximum g-force the centrifuge is capable of generating? Low-speed centrifuges are ideal for separating whole cells, while ultracentrifuges are necessary for separating DNA and RNA.

Centrifugation speeds for cells. - (Feb/05/2013 )

What speed do you guys use to spin down your cells? Is there a rule of thumb for the different types of cells in terms of centrifugation speed?

I am having a problem with my cell count and I am not sure if the spinning down process is shearing my cells. Last night I counted my cell suspension with a hemocytometer and it came out to 1.5*10^6 cells but the FACS analysis reported a much lower number (around 10^4 cells). I know I will lose cells during the staining process and during the analysis but going from 10^6 to 10^4 is huge loss. Any advice will be appreciated.

Hm, I spin my cells down with 1300rpm for 3 min. Later during the FACS staining process I spin them down with 2400 rpm for 3 min, but be careful as this can harm the cells. Interestingly I also observe huge cell loss during the staining process although I never quantified it like you did. Do some of your cell stick to the wall of the reaction tube perhaps ?

Tabaluga on Tue Feb 5 19:12:56 2013 said:

Working with epithelia cells I use 3000 rpm for 3mins and working with HSCs the protocol calls for 1500 rpm for 5mins. I don't think my cells are sticking to the wall of the reaction tube but I don't know for sure. I don't know if it is pipetting error, cell count error or the speed of spinning.

For spinning live cells do not exceed 300 RCF (relative centrifugal forces also known as "g"), it is best to do it as low as possible, I routinely use 100 RCF for 5-10 min and it works fine for all the cancer cell lines that I work with.

When working with centrifuges, rpm is a relative measure that has no reference unless you also provide the rotor radius so Wek's 3000 rpm may in fact be lower RCF than Tabaluga's 2400, but we will never know.

Spinning too fast can cause a "smear" of cells up the wall of the tube that you may be missing when resuspending the cells.

Just looked it up, my 2400 rpm correspond to 600 g, apparently.

I will try 100, 200, and 300 RCF for 5 mins and see if there is any significant loss of cells. My 3000 rpm equals to 800 RCF.
I have actually noticed the line smear on the wall of the tube when using compensation beads but haven't really noticed it when spinning down cells.

Dear Guys,
I know this is out of ur discussion, but regarding converting RPM into G or vice verse, I just measure the radius of my centrifugal ring, not the whole machine, just the rotor radius with a ruler or something, put the data on RPM-G converter like these website:
http://www.endmemo.com/bio/grpm.php
http://www.geneinfinity.org/sp/sp_rotor.html

then I got the required number in G or in RPM

great links, thanks. Some centrifuges have also got the advantage that you can switch between both values on the display, thereby detemining very quickly the relation between their rpm and g.

Just to throw in my 2 cents. In a neuro lab we spin at 90g for glia, and 160g for neurons in 15ml falcon tubes for 3 minutes.

Considering neurons are pretty small I doubt you'd need to go much faster.



Kommentaar:

  1. Arashirisar

    Baie dankie vir die hulp in hierdie saak.

  2. Artie

    Verskoning daarvoor inmeng ... Ek verstaan ​​hierdie vraag. Ek nooi na bespreking. Skryf hier of in PM.

  3. Eugen

    Ek is jammer, dit het inmeng ... hierdie situasie is vir my bekend. Ek nooi na bespreking.

  4. Coilleach

    Ek kan voorstel dat u 'n webwerf besoek waarop daar baie inligting oor hierdie vraag is.

  5. Shafiq

    Ek is jammer, ek kan jou nie help met iets nie. Ek dink jy sal die regte oplossing vind.

  6. Duran

    I think this is the brilliant idea

  7. Cleveland

    Dit is waar! I like your idea. Offer to consolidate the argument.

  8. Benkamin

    Ek wens geluk, dit is eenvoudig 'n uitstekende idee

  9. Caden

    Jy is absoluut reg. There is something in this and I think this is a good idea. Ek stem saam met jou.



Skryf 'n boodskap