Inligting

Hoe stop 'n timidienblok DNA-sintese?

Hoe stop 'n timidienblok DNA-sintese?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Die beste wat ek kon vind, is dat daar 'n terugvoermeganisme is, maar wat is hierdie terugvoer, en hoe werk die meganisme? As dit net is dat die konsentrasie timidien te hoog is, hoekom sal oortollige hoeveelhede ander nukleotiede nie dieselfde doen nie? (Of doen hulle, en ek weet nie daarvan nie?)


Oormaat timidien in 'n mitotiese sel genereer negatiewe terugvoer op die produksie van deoksisietientrifosfaat vanaf sitidien-5'-fosfaat. Oortollige hoeveelhede deoksiadenosien en deoksiguanosien ook blokkeer progressie deur S-fase. As 'n reagens vir die beheer van replikasie tydsberekening, is gevind dat timidien die beste werk aangesien die blokkerende aktiwiteit meer konsekwent toegepas en omgekeer kan word.

Xeros N. (1962) Deoksiribosiedbeheer en sinchronisasie van mitose. Nature 194: 682-683.


Gebrek aan effek van butyraat op S-fase DNA-sintese ten spyte van die teenwoordigheid van histoon-hipasetilering ☆

Die effekte van natriumbutiraat op [3H]timidine inkorporasie en selgroei eienskappe in ewekansig groeiende en gesinchroniseerde HeLa S3 selle is ondersoek in 'n poging om vas te stel watter effekte, indien enige, butyraat op S-fase selle het. Terwyl 5 mM natriumbutiraat vinnig inhibeer [ 5 H] timidien inkorporasie in 'n ewekansige groeiende sel populasies, het dit geen effek op inkorporasie tydens die S fase in selle gesinchroniseer deur dubbel timidien blok tegnieke. Hierdie gebrek aan effek is nie die gevolg van 'n verswakte vermoë van die S-faseselle om butiraat op te neem nie, aangesien butiraattoediening gedurende hierdie tydperk lei tot histoonhipasetilering wat identies is met dié wat gesien word met butiraatbehandeling van ewekansig groeiende selle. Verder dui die vermoë om sulke hiperasetilering met butiraat te veroorsaak tydens 'n oënskynlik normale progressie deur S-fase aan dat histoonhipasetilering waarskynlik geen effek op die algehele proses van DNA-replikasie het nie. Temporele patrone van [ 3 H] timidien inkorporasie en selgroei na vrystelling van 'n 24-uur blootstelling aan butyraat bevestig blokkasie van selgroei in die G1 fase van die selsiklus. Dus, die inhibisie deur butiraat van [ 3 H] timidien inkorporasie in ewekansig groeiende HeLa S3 selpopulasies kan uitsluitlik op grond van 'n G1-faseblok verreken word, met geen inhiberende effekte op selle wat reeds betrokke is by DNA-sintese of selle buite die G1-faseblok ten tyde van butyraattoediening nie.

Hierdie werk is ondersteun deur NIH Grant AM 20892 en 'n Training Grant, T32-CA 09286.

Huidige adres: Departement Selbiologie, Mayo Clinic, Rochester, MN 55905, VSA.


Die timidien-inkorporasie-toets, die mees algemene toets, gebruik 'n strategie waarin 'n radioaktiewe nukleosied, 3H-timidien, in nuwe stringe chromosomale DNA geïnkorporeer word tydens mitotiese seldeling. 'n Skintillasie-beta-teller word gebruik om die radioaktiwiteit in DNS wat uit die selle herwin word te meet om die omvang van seldeling te bepaal wat in reaksie op 'n toetsmiddel plaasgevind het.

Meer onlangs ontwikkelde toetse het die behoefte om radio-isotope te gebruik uitgeskakel. Ons bied baie van hierdie toetse wat aansienlike voordele aan die navorser bied.¹ Sommige van hierdie produkte sluit 5-broom-2'-deoksiuridien (BrdU), 'n nukleosiedanaloog wat tydens aktiewe DNA-sintese met behulp van immunohistochemie opgespoor word, in. Ons het ook die Click-iT® EdU-mikroplaattoets ontwikkel wat die nukleosiedanaloog EdU (5-etyniel-2'-deoksiuridien) gebruik en 'n opsporingsmetode wat nie teenliggaampies gebaseer is nie, dus vereis dit nie DNA-denaturering nie.


Resultate

NAIL-seq identifiseer vroeë DNA-replikasie-inisiasiesones

Om replikasie-inisiasiesones te identifiseer met die doel om vroeë DNA-replikasie op te spoor, het ons menslike GM12878 (primêr-agtige) en K562 (leukemie) selle afsonderlik in die G1-fase gesinchroniseer deur die CDK4/6 inhibeerder palbociclib [38] te gebruik. Meer as 94% van die behandelde selle is in die G1-fase na behandeling vir 36 uur in hegtenis geneem (Fig. 1a Addisionele lêer 1: Figuur S1a). Na 'n vrystelling van 2-3 uur vanaf die G1-fase, het die gesinchroniseerde K562- en GM12878-selle die G1/S-oorgang bereik (Bykomende lêer 1: Figuur S1a en b). Die K562 en GM12878 selle is gemerk na 'n vrystelling van 2,5 of 3 uur, onderskeidelik, met EdU en dan BrdU, elk vir 'n 15-min pols (Fig. 1a Addisionele lêer 1: Figuur S1a en b). Teoreties kan die twee timidien-analoog seine replikasie-inisiasieplekke en aangrensende vurkverlengingsstreke vir tiene kilobasisse merk. Die EdU- en BrdU-geïnkorporeerde fragmente kan onderskei word deur streptavidien C1-krale te gebruik na die Click-reaksie of 'n anti-BrdU-teenliggaam, onderskeidelik (Addisionele lêer 1: Figuur S1c). Let wel, EdU het met die anti-BrdU-teenliggaam gekruisreageer, maar hierdie kruisreaksie was onopspoorbaar na die Click-reaksie (Bykomende lêer 1: Figuur S1d). Inkorporering van EdU of BrdU van die opeenvolgende dubbele-etikettering het sterk vroeë DNA-replikasie-seine in die vroeë replikasiedomeine van gesinchroniseerde K562-selle aan die lig gebring (Fig. 1b Addisionele lêer 1: Figuur S2a). Boonop is die "E-B" sein verkry deur die BrdU sein van die EdU sein af te trek verder vernou tot die middel van die vroeë replikasie domeine (Fig. 1b Addisionele lêer 1: Figuur S2a). Die resolusie van die EB-pieke was meer as 2 keer hoër as dié van die individuele EdU- en BrdU-pieke, met 'n mediaan breedte van 90 kb teenoor 245 en 290 kb, onderskeidelik, in K562-selle (Fig. 1c Addisionele lêer 1: Figuur S2b).

NAIL-seq geïdentifiseerde DNA vroeë replikasie-inisiasiesones (ERIZ's). a Skematiese toon die ERIZ's geïdentifiseer deur NAIL-seq. Ontluikende DNA gemerk met EdU is rooi, terwyl dit gemerk met BrdU groen is. Die oorsprong wat deur die grys pyle aangedui word, is deur EdU/HU geïdentifiseer, maar nie deur EdU en BrdU nie. Die ligblou blokkies wys die prosedures vir die aangeduide NAIL-seq biblioteke. CDKi is die CDK4/6-remmer, palbociclib. Rel., vrystelling ERIZ, vroeë replikasie-inisiasiesone. b Vroeë replikasie seine van NAIL-volgens biblioteke in K562 selle. Staafdiagramme toon die verspreiding van EdU (rooi) of BrdU (groen) seine in die aangeduide streek. Die vroeë DNA-replikasiestreke wat deur Repli-seq geïdentifiseer is, word in grys getoon. Vir die dubbel-gemerkte monsters is die G1-gestopte K562-selle vir 2.5 uur vrygestel om die G1/S-oorgang te bereik en dan opeenvolgend gemerk met EdU en BrdU, elk vir 15 min. Die E-B-paneel wys die BrdU-afgetrekte EdU-seine rooi verteenwoordig die EdU-dominante sein en groen verteenwoordig die BrdU-dominante sein. E-B-pieke wat deur die RepFind-pyplyn genoem word, word hieronder getoon. Vir EdU/HU is G1-gestopte selle vrygelaat in medium wat voorsien is van 10 mM HU en 10 μM EdU vir 12 uur voor oes. EdU/HU-seine word in donkerrooi gewys met die geïdentifiseerde ERIZ's in blou onder. Die pienk skadublokkie beklemtoon 'n nie-ERIZ-streek, terwyl die siaan-blokkie 'n tipiese streek uitlig waar EdU/HU 'n hoër resolusie as E-B vertoon. c Die breedteverspreiding van NAIL-seq geïdentifiseerde replikasiepieke en Repli-seq het vroeë gerepliseerde streke in K562-selle geopenbaar. Die Wilcoxon Rank-som toets is toegepas vir statistiese analise. d Venn-diagram wat die oorvleuelende pieke van E-B en EdU/HU in K562-selle toon. Die siaan sirkel verteenwoordig die totale aantal E-B pieke en die oranje sirkel verteenwoordig die EdU/HU pieke. Die EdU/HU-pieke wat met E-B-pieke oorvleuel, word gedefinieer as ERIZ's. e Replikasie tydsberekening analise vir die twee kategorieë van EdU/HU pieke in K562 selle. EdU/HU-pieke word as ERIZ's gekategoriseer (n = 2 265, rooi, oorvleuel met E-B-pieke) en nie-ERIZ's (n = 891, swart, onafhanklik van E-B-pieke). Die replikasietydsberekening van elke piek word gedefinieer deur die gemiddeld van die wavelet-gladde seine van ses breuke van die ENCODE Repli-seq profiel. f Die piekwydteverspreiding van ERIZ's in K562- en GM12878-selle. Die totale aantal (N) en die mediaan breedte van ERIZ's word in die legendes getoon

Vervolgens het ons 'n tweede toets, EdU-seq-HU, gebruik deur EdU stadig onder HU-behandeling in te sluit om vroeë replikasie-inisiasie te karteer [13, 15]. G1-gestopte selle is vrygelaat in vars medium wat HU en EdU bevat vir 'n bykomende 12 uur voor oes (Fig. 1a Addisionele lêer 1: Figuur S1c). Ongeveer 71.8% van EdU/HU-brandpunte in K562-selle het met 78.9% van die E-B-pieke oorvleuel (Fig. 1d). Die EdU/HU-brandpunte het 'n mediaanwydte van 55 kb getoon, wat 'n effens hoër resolusie as dié van die E-B-pieke vertoon het (Fig. 1c Addisionele lêer 1: Figuur S2b). HU-behandeling lewer hoë-resolusie replikasie-geassosieerde pieke [13, 15], maar dit kan DNA-dubbelstring-breuke (DSB's) en vroeë benutting van dormante DNA-replikasie-oorspronge [39,40,41,42] veroorsaak. E-B-seine word verkry van selle wat die G1/S-oorgang sonder replikasiestres ondergaan, daarom kan E-B-seine gebruik word om vroeë afvuur van dormante oorsprong en potensiële DNA-skade in die EdU/HU-biblioteke uit te sluit. Die EdU/HU-pieke wat die E-B-pieke oorvleuel, het vroeëre replikasietydsberekening getoon in vergelyking met dié van die nie-oorvleuelende EdU/HU-pieke (Fig. 1e). Daarom het ons die EdU/HU-pieke wat die E-B-pieke oorvleuel, gedefinieer as ERIZ's en hulle aan verdere ontleding onderwerp (Fig. 1a, b, en d Addisionele lêer 1: Figuur S2a). Aangesien EdU-seq-HU ook 'n nukleosiedanaloog vir volgordebepaling gebruik het, is hierdie metode nukleosiedanaloog inkorporasie loki-volgordebepaling (NAIL-seq) genoem. NAIL-seq het 2265 en 2874 ERIZ's met 'n mediaangrootte van 71 kb en 76 kb in onderskeidelik K562 en GM12878 selle geïdentifiseer (Fig. 1f Addisionele lêer 2: Tabel S1 Addisionele lêer 3: Tabel S2). Soos verwag is, is meer as 95% van die geïdentifiseerde ERIZ's in vroeë replikasiestreke in K562- en GM12878-selle gevind (Bykomende lêer 1: Figuur S2c). Let wel, slegs 0.04% (1 van 2265) van ERIZ's in K562-selle en 1% (30 van 2874) van dié in GM12878-selle het in tipiese laat replikasiestreke voorgekom.

NAIL-seq het 'n hoër resolusie as Repli-seq

Om te bepaal of NAIL-seq beter is as tipiese enkelsein-inkorporasie-toetse, het ons gepubliseerde Repli-seq-data van asinchroniseerde K562-selle gebruik om 'n direkte vergelyking van die metodes uit te voer [19]. Die individuele EdU- en BrdU-pieke vanaf NAIL-seq het 'n merkbaar hoër resolusie gehad in vergelyking met dié van die vroeë replikasiepieke wat deur Repli-seq geïdentifiseer is, wat 'n mediaan piekwydte van 340 kb gehad het (Fig. 1b, c Addisionele lêer 1: Figuur S2a), wat daarop dui dat sel-sinchronisasie die resolusie van die replikasie-inisiasiesones wat deur die eksperimente geïdentifiseer is, verbeter het. Met betrekking tot ERIZs, die smalste ERIZs geïdentifiseer deur NAIL-seq was ongeveer 10 kb in grootte, terwyl die smalste vroeë replikasie domeine van die Repli-seq resultate was meer as 100 kb in grootte (Fig. 1c, f). OK-seq en SNS-seq is ook wyd gebruik om onderskeidelik inisiasiesones (IZ's) en replikasie-oorspronge te identifiseer wat met replikasiegebeure deur die hele S-fase in ongesinchroniseerde selle geassosieer word. In K562-selle het byna 50% van ERIZ's wat deur NAIL-seq geïdentifiseer is, oorvleuel met 43.4% van die IZ's geïdentifiseer deur OK-seq [24], en byna 70% van hierdie ERIZ's het oorvleuel met 16.3% van die replikasie-oorspronge wat deur SNS-seq geïdentifiseer is. [23] (Bykomende lêer 1: Figuur S2d). Ons het ook gevind dat twee of meer replikasie-oorspronge wat deur SNS-seq geïdentifiseer is, in 'n enkele ERIZ geval het (in siaan uitgelig in die Addisionele lêer 1: Figuur S2a). Verder het ons EdU-seq-HU uitgevoer in gestimuleerde muismilt B-selle en die geïdentifiseerde vroeë replikasiesones was hoogs gekorreleer met vorige resultate [15] (Bykomende lêer 1: Figuur S2e).

Vroeë DNA-replikasie is teenwoordig in nie-getranskribeerde streke

Vervolgens het ons probeer om die verband tussen transkripsie en vroeë replikasie-inisiasie te ondersoek. Ongeveer 94-97% van die gegroepeerde ERIZ's was teenwoordig in transkripsie-besette A-kompartemente [1] in K562- en GM12878-selle (Fig. 2a), in ooreenstemming met vorige verslae [43]. Om die chromatienlokalisering van ERIZ's verder te karakteriseer, het ons 'n logistiese regressiemodel gebou om die korrelasie tussen ERIZ's en histoonmodifikasiemerkers, sowel as chromatienstrukturele proteïene, te demonstreer, gebaseer op ChIP-seq data van ENCODE. Die mees betekenisvolle voorspellende merker vir ERIZ's was H2A.Z (Fig. 2b Addisionele lêer 1: Figuur S3a), in lyn met 'n onlangse verslag dat H2A.Z ORC1 werf om DNA-replikasie te begin [44]. Cohesin, CTCF, en ander histoon merkers vir transkripsie versterkers of promotors, insluitend H3K4me1, H3K4me3, en H3K27ac, het ook positiewe voorspelling tellings vir ERIZs (Fig. 2b Addisionele lêer 1: Figuur S3a). Transkripsie-verlengingsmerkers H3K79me2 en H3K36me3, sowel as transkripsie-dempermerker H3K9me3, het egter negatiewe voorspellingstellings vir ERIZ's gehad (Fig. 2b).

ERIZ's is geleë in nie-getranskribeerde streke binne aktiewe kompartemente. a Persentasie van die breedte van ERIZ's in die A-kompartemente. Genoom verteenwoordig die persentasie A-kompartemente in die hg19-genoom in die aangeduide selle. b Die verband tussen die pieke van voorspellers en ERIZ-voorkoms in GM12878- en K562-selle (sien "Metodes" vir besonderhede). c Verspreiding van ERIZ's in die konteks van aktiewe transkripsie in GM12878-selle. “+” dui die voorste string aan en “–” dui die omgekeerde string aan. Die posisies en getranskribeerde rigting van gene word onderaan die paneel met die geenname getoon. Vorentoe-getranskribeerde gene word in oranje gemerk en omgekeerde-getranskribeerde gene word in blou gemerk. d Hittekaarte van ERIZ-geassosieerde vroeë replikasie-inisiasie (van EdU/HU, rooi) en aktiewe transkripsie (blou) in GM12878- en K562-selle. Die ERIZ-besette nie-getranskribeerde streke (nie-TR's) word volgens breedte gerangskik en gesentreer op die middelpunt wat deur twee getranskribeerde gene in elke sellyn geflankeer word. Die nie-TR's in A-kompartemente, 20–100 kb in breedte, word vertoon. Elke lyn verteenwoordig 'n nie-TR

Om die verband tussen transkripsie en vroeë DNA-replikasie verder te ondersoek, het ons die ingezoomprofiel van globale aanloop (GRO)-volgende transkripsie-seine en ERIZ-geassosieerde vroeë replikasie-seine ondersoek. Merkwaardig genoeg het ons gevind dat ERIZ's hoofsaaklik in nie-getranskribeerde streke geleë is, wedersyds eksklusief met getranskribeerde geenliggame, ten spyte daarvan dat dit in dieselfde A-kompartemente is (Fig. 2c). Die genoomwye analise het bevestig dat ERIZ-seine opgehoop het in nie-getranskribeerde streke, geflankeer deur transkripsie seine van GRO-seq [45] in GM12878 en K562 selle (Fig. 2d). Ons het ook ERIZ's van twee primêre seltipes, muis-embrioniese stamselle (mESC's) en muis-milt-B-selle (mSBC's) geïdentifiseer en soortgelyke bevindings verkry (Bykomende lêer 1: Figuur S3b). Let wel, die mESC's is in hegtenis geneem deur timidien en dan nokodasool [46], waarna hulle vir 3 uur in medium wat HU bevat vrygelaat is om die selle toe te laat om die vroeë S-fase te betree voor oes (Bykomende lêer 1: Figuur S3c en d) . Die G0-fase mSBC's is geaktiveer deur sitokiene in medium wat HU bevat vir 28 uur om die selle toe te laat om die vroeë S-fase [15] te betree voor oes (Bykomende lêer 1: Figuur S3c). Hierdie resultate verduidelik die negatiewe korrelasie tussen ERIZ's en transkripsie-verlengingsmerkers en dui daarop dat vroeë DNA-replikasie-inisiasie by voorkeur plaasvind by nie-getranskribeerde streke binne aktiewe chromatienkompartemente.

Transkripsie vorm vroeë DNA-replikasie-inisiasie

Om te ondersoek of transkripsie interaksie het met DNA-replikasie-inisiasie, het ons α-amanitien gebruik om transkripsie [47] in gesinchroniseerde K562-selle te inhibeer, waarna ons die impak van transkripsie-versteuring op die verspreiding van ERIZ's gemeet het. Ons het G1-gestopte K562-selle vrygelaat in vars medium wat 2 of 10 μg/mL α-amanitien bevat, benewens HU en EdU, vir 12 uur voor oes (Bykomende lêer 1: Figuur S4a). Transkripsieblokkade deur α-amanitien het EdU-inkorporasie effens verminder, maar robuuste EdU-seine is opgespoor sonder beduidende toename in DNA-skade gemerk deur γ-H2AX (Bykomende lêer 1: Figuur S4b en c). Verryking van vroeë replikasie seine in ERIZ-geassosieerde nie-getranskribeerde streke (soos gedefinieer in Fig. 2d) het afgeneem namate die α-amanitienkonsentrasie verhoog is (Fig. 3a Addisionele lêer 1: Figuur S4d). Vroeë replikasieseine het ook verhoogde verryking by transkripsiebeginplekke (TSS'e) getoon na α-amanitienbehandeling (Figuur 3a en 4f Addisionele lêer 1: Figuur S4d), moontlik omdat TSS-streke waar ORC geleë is DNS-replikasie-inisiasie ondersteun, soos voorheen gerapporteer [ 10, 12, 23, 48]. Die verhouding van vroeë replikasieseine in nie-getranskribeerde streke tot dié van vroeë replikasieseine in aangrensende getranskribeerde streke het aansienlik afgeneem namate die konsentrasie van α-amanitien verhoog is, wat daarop dui dat vroeë replikasie getranskribeerde streke binnegedring het (Fig. 3b Addisionele lêer 1: Figuur S4d ). Verder, sterker inhibisie van transkripsie het gelei tot meer dramatiese vroeë replikasie herverspreiding op die genoom (Fig. 3b en geïllustreer in Addisionele lêer 1: Figuur S4d). Net so het vroeë replikasie seine ook verskuif van nie-getranskribeerde streke na naburige getranskribeerde streke in lae-dosis α-amanitien-behandelde mSBC's (Bykomende lêer 1: Figuur S4e en S4f). Ons het ook 'n ander transkripsie-inhibeerder, 5,6-dichloro-1-β-d-ribofuranosyl benzimidazole (DRB), toegepas teen konsentrasies wat wissel van 5 tot 30 μM om transkripsie-verlenging in G1-gestopte K562-selle te onderbreek en soortgelyke, alhoewel ligter, verkry. bevindings (Fig. 3c, d Addisionele lêer 1: Figuur S4g).

Transkripsie hervestig vroeë replikasie in K562-selle en mESC's. a, c Hittekaarte van vroeë replikasie seine (van EdU/HU) rondom ERIZ-geassosieerde nie-TR's in K562-selle behandel met die aangeduide konsentrasies α-amanitien (a) of DRB (c). Selle is behandel soos getoon in Addisionele lêer 1: Figuur S4a. Nie-TR, nie-getranskribeerde streek. TR, getranskribeerde streek. Legendes word uitgebeeld soos beskryf in Fig. 2d. b, d Box-plotte wat die log2-verhouding van leesdigtheid tussen vroeë replikasie in die ERIZ-geassosieerde nie-TR's en dié in die geflankeerde getranskribeerde streke in die A-kompartemente van K562-selle wat behandel is met die aangeduide konsentrasies α-amanitien (b) of DRB (d). Die Wilcoxon-rangsomtoets is vir statistiese analise toegepas. e Hittekaarte van vroeë replikasie seine (van EdU/HU) rondom die ERIZ-geassosieerde nie-TR's in mESC's met of sonder RNA-polimerase II. Selle is behandel soos geïllustreer in Addisionele lêer 1: Figuur S4h. Endogene RNA polimerase II gemerk met mAID is gemerk as Pol II. Nie-getranskribeerde streke (nie-TR's) word volgens breedte gerangskik en gesentreer op die middelpunt wat deur twee getranskribeerde gene in mESC's geflankeer word. Die nie-TR's binne A-kompartemente, 20–100 kb in breedte, word vertoon.Elke lyn verteenwoordig 'n nie-TR. f Die log2-verhouding van leesdigtheid tussen vroeë replikasie in ERIZ-geassosieerde nie-TR's en dié in die geflankeerde getranskribeerde streke binne die A-kompartemente van mESC's. WT, wild-tipe. Die Wilcoxon-rangsom-toets is vir statistiese analise gebruik. g Verspreidingspatroon van vroeë replikasie-inisiasie met of sonder RNA-polimerase II in mESC's

Transkripsie herverdeel MCM in die G1-fase. a Western blotting toon opsporing van die aangeduide proteïene in G1-gestopte K562-selle in die afwesigheid of teenwoordigheid van 10 μg/mL α-amanitien. G1-gestopte K562-selle is behandel met of sonder 10 μg/mL α-amanitien vir 12 uur voor oes. WCE, heelselekstrak Cyto-E, sitoplasmiese ekstrak Chro-E, chromatienekstrak. b Die verspreiding van ORC2 binne die ERIZ-geassosieerde nie-getranskribeerde streke (nie-TR's) in G1-gestopte K562-selle in die afwesigheid of teenwoordigheid van 10 μg/ml α-amanitien. Die nie-TR'e is dieselfde as dié wat in Fig. 3a getoon word. c Box-plot wat die log2-verhouding van die leesdigtheid van ORC2 tussen nie-TR's en geflankeerde TR's in die A-kompartemente van K562-selle wat met 10 μg/ml α-amanitien behandel is, aantoon. Die Wilcoxon-rangsomtoets is vir statistiese analise toegepas (bl = 0.31). d Die verspreiding van MCM5 in G1-gestopte K562-selle in die afwesigheid of teenwoordigheid van 10 μg/mL α-amanitien. Die data van ChIP-ed monsters oor die inset monsters word gedefinieer as vou verandering data, soos in die ENKODEER projek en 'n vorige verslag [35]. Die vouveranderingsdata is genormaliseer na z-tellings vir hittekaarte. Die streke wat vertoon word, is dieselfde as in b. e Box-plot wat die log2-verhouding van MCM5-seinverryking in nie-TR's en TR's in die A-kompartemente van K562-selle wat met 10 μg/mL α-amanitien behandel is, toon. Die Wilcoxon-rangsomtoets is vir statistiese analise toegepas. f, g, en h Die verspreiding van vroeë replikasie-inisiasie vanaf EdU/HU (f), ORC2 (g), en MCM5 (h) in ERIZ-aangrensende aktiewe geenliggame met of sonder 10 μg/mL α-amanitien behandeling. TSS, transkripsie begin webwerf TTS, transkripsie beëindiging webwerf. ERIZ-flankerende getranskribeerde streke groter as 50 kb word volgens breedte gerangskik (met die kleinste gene bo-op). Vir vertoon is alle getranskribeerde streke tot dieselfde breedte geskaal en by beide TSS en TTS in lyn gebring. Elke lyn verteenwoordig 'n individuele getranskribeerde geen

Aangesien transkripsie-inhibeerders nie-spesifieke effekte op DNA-metabolisme kan hê, het ons die ouksien-induseerbare degron-stelsel gebruik om RNA-polimerase II direk vanaf mESC's uit te skakel op 'n akute manier soos voorheen gerapporteer [49]. Kortliks, die katalitiese subeenheid van RNA-polimerase II is gemerk met 'n mAID-merker, en indool-3-asynsuur (IAA) is bygevoeg om afbraak van die samesmeltingsproteïen te veroorsaak. mESC's is in die M-fase gearresteer en dan in die vroeë S-fase vrygelaat (Bykomende lêer 1: Figuur S4h). Ten einde RNA-polimerase II voor die G1/S-oorgang uit te skakel, is IAA 1 uur voor vrystelling van die M-fase bygevoeg. RNA-polimerase II is amper heeltemal afgebreek na 2 uur se induksie deur IAA, terwyl die aantal MCM-komplekse konstant gebly het (Bykomende lêer 1: Figuur S4h en i). Boonop het vinnige afbraak van RNA-polimerase II nie die toetrede van mESC's in die S-fase beïnvloed nie (Bykomende lêer 1: Figuer S4j). IAA-behandeling het ook nie die verspreiding van ERIZ-geassosieerde vroeë replikasieseine in wildtipe selle aansienlik verander nie (Fig. 3f Addisionele lêer 1: Figuur S4k Addisionele lêer 4: Tabel S3). Die afwesigheid van RNA-polimerase II het egter gelei tot 'n merkwaardige afname in die aantal vroeë replikasie-seine in nie-getranskribeerde streke (Fig. 3e), in ooreenstemming met die bevindinge wat verkry is met behulp van transkripsie-inhibeerders in K562-selle. Daarbenewens is die aantal vroeë replikasie seine afgeneem in nie-getranskribeerde streke en het toegeneem in geenliggame, soos geïllustreer in die Dnajc7 geen (Fig. 3f, g). Gesamentlik dui ons data daarop dat transkripsie aktief vroeë DNA-replikasie-inisiasie in beide menslike en muisselle orkestreer.

Transkripsie herverdeel die MCM, maar nie die ORC nie, na nie-getranskribeerde streke

Daar is gerapporteer dat die ORC wyd versprei word in beide getranskribeerde en nie-getranskribeerde streke, met verryking by TSS'e, en hierdie bevinding is bevestig deur her-analise van gepubliseerde data van 'n ORC2 ChIP-seq studie [31] in asinchroniseerde K562 selle (Bykomende lêer 1: Figuur S5a). In teenstelling hiermee versamel MCM-komplekse in nie-getranskribeerde streke, soos getoon deur die ChIP-seq-data vir MCM3, MCM5 en MCM7 van ENCODE in asinchroniseerde K562-selle, wat aandui dat MCM-komplekse van die ORC ontkoppel is (Bykomende lêer 1: Figuur S5a) ).

Om die meganisme waardeur transkripsie vroeë DNA-replikasie-inisiasie beïnvloed, te verken, het ons die verspreiding van die ORC en MCM via ChIP-seq na aanleiding van α-amanitien-geïnduseerde transkripsie-versteuring in die G1-fase ondersoek voor die aanvang van DNA-replikasie. Die proteïenvlakke van die ORC en MCM het konstant in die sitosol en op chromatien gebly ten spyte van die afbraak van RNA-polimerase II in G1-gestopte K562-selle na behandeling met 10 μg/mL α-amanitien (Fig. 4a Addisionele lêer 1: S5b). Let wel, ORC2 ChIP-seq is bereik deur Avi-gemerkte ORC2 uit te druk op 'n uitdrukkingsvlak wat baie laer is as dié van endogene ORC2, wat geen impak op chromatiengebonde MCM5 in die G1-fase gehad het nie (Bykomende lêer 1: Figuur S5c). ORC2 en MCM5 het duidelike verspreidingspatrone in die G1-fase getoon sonder α-amanitienbehandeling, wat soortgelyk was aan dié van asinchroniseerde K562-selle (Fig. 4b links en 4d links Addisionele lêer 1: Figuur S5a, d, en e). Na aanleiding van α-amanitien behandeling, het ORC2 hoofsaaklik op sy oorspronklike bindingsplekke gebly, wat soortgelyke verspreidingspatrone in beide nie-getranskribeerde en getranskribeerde streke toon, ongeag α-amanitien behandeling (Fig. 4b, c). Die MCM5-sein is egter in nie-getranskribeerde streke verminder, en die verhouding van die MCM5-sein in nie-getranskribeerde streke tot dié van die sein in getranskribeerde streke het aansienlik afgeneem (Fig. 4d, e).

Om veranderinge in vroeë replikasie-, ORC- en MCM-seine in getranskribeerde streke beter aan te bied, het ons ERIZ-aangrensende getranskribeerde gene by beide TSS en transkripsieterminasieplekke (TTS) in lyn gebring, wat aan die lig gebring het dat vroeë replikasie seine selde binne getranskribeerde gene opgespoor is voor behandeling ( Fig. 4f). Na aanleiding van α-amanitien behandeling, is vroeë replikasie seine opgespoor in getranskribeerde streke, met duidelike verryking by TSSs (Fig. 4f), terwyl die oorvloed van ORC2 onveranderd gebly het binne getranskribeerde gene en verryk is by TSSs (Fig. 4b, c, en g) ). Die MCM5-sein binne getranskribeerde gene is egter versterk, en ligte seinophopings is binne geenliggame waargeneem (Fig. 4e, h). In die besonder, α-amanitien behandeling het gelei tot soortgelyke verspreiding patrone vir ERIZs en ORC2 (Fig. 4f regs versus 4g regs). Hierdie bevindinge impliseer dat RNA-polimerase II MCM-komplekse buite getranskribeerde streke herverdeel, wat ontkoppeling van die ORC- en MCM-komplekse aandryf en sodoende vroeë DNA-replikasie-inisiasie by getranskribeerde streke voorkom.

MCM versamel by RNA polimerase II blokkade plekke om DNA replikasie te begin

Die aandryf van MCM-komplekse deur RNA-polimerase II vereis die koppeling van hierdie twee komplekse in getranskribeerde streke in die G1-fase. Om die koppeling van RNA-polimerase II en MCM-dubbelheksamere op te spoor, het ons 'n transkripsieversperring gebruik om RNA-polimerase II te stop en daardeur MCM vas te vang. In hierdie toets akkumuleer vasgevang MCM en kan DNA-replikasie-inisiasie in die aankomsrigting van transkripsie stroomop van die versperring veroorsaak. Ons het vier gids (g)RNA-teikenterreine ontwerp wat oor 'n 162-bp eksoniese gebied van die CMIP geen sonder ORC-bindingsvermoë om nuklease-dooie Cas9 (dCas9) as 'n transkripsie-padblokkade te werf (Fig. 5a). Die doeltreffendheid van transkripsieblokkade deur dCas9 het 60-70% bereik, en die stroomop na stroomaf transkripsievlakke is aansienlik verhoog (Bykomende lêer 1: Figuur S6a-c). Beide die stroomop en stroomaf ERIZ's aangrensend CMIP ondersteun steeds aansienlike vroeë DNA-replikasie na die dCas9-gemedieerde transkripsieblokkade as gevolg van die teenwoordigheid van die ORC in naburige nie-getranskribeerde streke en ondoeltreffende transkripsie-inhibisie (Bykomende lêer 1: Figuur S6b-d). Interessant genoeg het ons verryking van EdU-seine gevind binne die 2-kb-streek stroomop van die dCas9-bindingsplekke in die aankomsrigting van transkripsie, maar nie in die ander rigting nie (Fig. 5a-c Addisionele lêer 1: Figuur S6e). Om te evalueer of hierdie EdU-seine geproduseer is deur DNA-replikasie-inisiasie of DNA-skade as gevolg van transkripsie-stalling, het ons EdU-seq-HU in die G1-gearresteerde K562-selle uitgevoer. Ons het geen EdU-verryking binne dieselfde 2-kb-streek gevind na transkripsieblokkade nie (Fig. 5d, e Addisionele lêer 1: Figuur S6b en e). Aangesien beide transkripsie en DNA-replikasie in die S-fase plaasgevind het, maar slegs transkripsie in die G1-fase plaasgevind het, moes die verrykte EdU-seine in die vroeë S-fase van nuwe DNA-replikasie-inisiasie ontstaan ​​het. Daarbenewens is geen beduidende vroeë replikasie seine waargeneem binne die geenliggaam stroomaf van die dCas9-blokplek nie, moontlik omdat ORC nie teenwoordig was nie (Fig. 5b, c Addisionele lêer 1: Figuur S6d en e). Ons het ook dCas9-geïnduseerde transkripsieblokkade uitgevoer by GALNT10. Alhoewel die blokkade doeltreffendheid laer was as wat waargeneem is by CMIP (Bykomende lêer 1: Figuur S6b en c), ons het skielike DNA-replikasie-inisiasie waargeneem na dCas9-geïnduseerde transkripsieblokkade (Bykomende lêer 1: Figuur S6f-h).

Replikasie-inisiasie vind plaas by die transkripsieversperring. a Skematiese van dCas9-gRNA-gemedieerde transkripsieblokkade. Vier gRNA's is ontwerp om die nie-sjabloonstring by die vierde ekson van te bind CMIP. Die oranje pyl dui die getranskribeerde streek aan en die rooi stopteken illustreer die dCas9-geïnduseerde transkripsieblokkade. b, d Die gemiddelde van EdU/HU genormaliseerde leesdigtheid (lyn) met die standaardfout (skaduwee) van drie biologiese herhalings naby die dCas9/gRNA bindingsplekke op CMIP in vroeë S-fase (b) of G1-fase (d) K562 selle behandel met CMIP (rooi) of deurmekaar (sian) gRNA's. gRNA-CMIP en gRNA-scramble dui aan dat selle met dCas9/gRNA-teikening behandel is CMIP of 'n beheerstreek, onderskeidelik. Die streke tussen twee stippellyne rondom 0 beklemtoon die vier bindingsplekke van CMIP gRNA's. Die 10-kb-venster van dCas9-bindingsplekke is geteël deur 1-kb-bakke (gly met 200 bp). Die leestelling per kilobasis (RPK) is binne elke 1-kb bin bereken en genormaliseer deur die RPK van die B-kompartemente van elke biologiese replikaat, wat die RPK-verhouding definieer (sien "Metodes" vir besonderhede). c, e Die vlakke van EdU/HU lees digtheid stroomop (− 2 k) of stroomaf (2 k) van die gRNA-CMIP bindingsplekke in vroeë S-fase (c) of G1 fase (e) K562-selle. Die leesdigtheid is in 2-kb-bakke bereken. Studente t-toets, bl = 0.025 *, bl < 0,05 n.s., geen betekenis nie. f ChIP-qPCR wat die verspreiding van MCM5 omringende dCas9-bindingsplekke in CMIP. 'n Biologiese replikaat van MCM5 ChIP-qPCR en die ander twee biologiese replikate word in Addisionele lêer 1 getoon: Figuur S6i. t-toets, gemiddeld ± SD. "Op" of "af" dui die stroomop of stroomaf nie-getranskribeerde streke van CMIP, onderskeidelik. Die ander vyf posisies is dieselfde as dié wat in b en d. g Skematiese van die transkripsie-stootskrapermodel. Links: in die G1-fase word MCM-dubbelheksamere (MCM-DH's) wat deur ORC in getranskribeerde streke gelaai is, langs geenliggame aangedryf deur RNA-polimerase II na stroomaf nie-getranskribeerde streke. Opgehoopte MCM-DH's in nie-getranskribeerde streke inisieer DNA-replikasie in die vroeë S-fase. Regs: wanneer transkripsie geïnhibeer word, versamel MCM-DH's rondom die ORC-bindingsplek en begin DNA-replikasie by geenliggame

Om MCM-akkumulasie op te spoor, het ons anti-MCM5 ChIP-qPCR op uitgevoer CMIP in die G1-fase na dCas9-geïnduseerde transkripsieblokkade, omdat ChIP-seq nie geskik is om geringe veranderinge op individuele terreine op te spoor nie. dCas9-gemedieerde stalling van RNA-polimerase II het nie die hoeveelheid MCM5 in die stroomop of stroomaf nie-getranskribeerde streke van CMIP (Fig. 5f). Merkwaardig genoeg het MCM5 aansienlik opgehoop in die 2-kb-streek stroomop van die blokkadeterreine in drie biologiese herhalings, in ooreenstemming met die verspreidingspatroon van EdU-seine in die vroeë S-fase na dCas9-geïnduseerde transkripsieblokkade (Fig. 5b, c, en f Addisionele lêer 1: Figuur S6i). Hierdie bevindinge dui daarop dat RNA-polimerase II MCM langs aktiewe gene na transkripsie-arm streke of transkripsie-hindernisse kan dryf om vroeë DNA-replikasie te inisieer (Fig. 5g).

Botsings tussen transkripsie en DNA-replikasie-inisiasie veroorsaak genoom-onstabiliteit

Dit is denkbaar dat die uitsluiting van vroeë DNA-replikasie-inisiasie van getranskribeerde streke 'n meganisme vir die behoud van genoomintegriteit kan verteenwoordig, veral in getranskribeerde streke. Daarom het ons die impak van botsings tussen gedisreguleerde vroeë DNA-replikasie en transkripsie op genoomstabiliteit ondersoek. Ons het 30 μM DRB gebruik om transkripsie in G1-gestopte K562-selle te onderbreek, wat toegelaat het dat DNA-replikasie-inisiasie binne aktief getranskribeerde gene plaasvind (Fig. 3c, d). Daarna is die DRB-behandeling vir 3,5 uur gestaak om transkripsie weer te begin en transkripsie-replikasie botsings te veroorsaak, en γ-H2AX is gebruik om DNA-skade te merk (Fig. 6a). Behandeling met 30 μM DRB het soortgelyke vlakke van skade in selle in die G1- en vroeë S-fases veroorsaak in vergelyking met onbehandelde selle (Fig. 6b, c). Nadat DRB-behandeling vir 3,5 uur gestaak is, het die intensiteit van die γ-H2AX-sein in G1-gestopte K562-selle effens toegeneem in vergelyking met dié van die onbehandelde selle (Fig. 6b, c). In die DRB-vrygestelde vroeë S-faseselle, waarin DNA-replikasie-inisiasie plaasgevind het in getranskribeerde streke (Fig. 3c, d), was die γ-H2AX seinintensiteit egter aansienlik hoër as dié van die G1-fase of onbehandelde selle (Fig. 3c, d). 6b, c).

Verplaasde vroeë replikasie-inisiasie veroorsaak DNA-skade. a Skema wat DRB-behandeling van G1- of vroeë-S-fase K562-selle toon, 'n gedetailleerde beskrywing word in die "Metodes"-afdeling gegee. Die blou pyle wys die monsters wat in aangebied word b en c. b Opsporing van kern-inwonende γ-H2AX foci in G1-gearresteer of vroeë S-fase K562-selle na transkripsie her-inisiasie deur onttrekking van DRB. c Intensiteit van kern-inwonende γ-H2AX foci na transkripsie her-inisiasie via onttrekking van DRB in G1-gearresteer of vroeë S fase K562 selle. Verteenwoordigende beelde word in b. t-toets ***, bl < 0,001. d Opsporing van γ-H2AX foci geïnduseer deur DRB onttrekking met of sonder RNase H1 (GFP-RNH1) ooruitdrukking. Die wit driehoek dui vroeë S-fase selle aan met GFP of GFP-RNH1 ooruitdrukking op 3.5 uur na DRB onttrekking. Let wel, die teenliggaam teen γ-H2AX verskil van die een in b. e Die aantal kern-inwonende γ-H2AX foci met of sonder RNase H1 ooruitdrukking in die G1 of vroeë S fase voor of na onttrekking van DRB. t-toets n.s., geen betekenis*, bl < 0,05 **, bl < 0,01***, bl < 0,001

R-lusse is belangrike skadelike strukture wat tydens die botsing van replikasie en transkripsie geproduseer word, wat sensitief is vir RNase H1 [8, 9]. In hierdie konteks het ons RNase H1 ooruitgedruk in die DRB-behandelde en vrygestelde K562-selle deur plasmiedtransfeksie (Fig. 6a, d Addisionele lêer 1: Figuur S7a). Ooruitdrukking van RNase H1 het DNA-skade in geasinchroniseerde selle veroorsaak [50] en effens, maar aansienlik, het die γ-H2AX-sein in die G1-in hegtenis geneem selle verhoog voor, maar nie na, DRB vrystelling nie (Fig. 6e Addisionele lêer 1: Figuur S7a) . Die γ-H2AX sein is verhoog na DRB vrystelling in die GFP-ooruitgedrukte K562 selle in die vroeë S fase, in ooreenstemming met die bevindings hierbo beskryf. Ooruitdrukking van RNase H1 het gelei tot 'n beduidende afname in die aantal γ-H2AX-fokuspunte in vergelyking met dié van die GFP-ooruitgedrukte DRB-vrygestelde S-faseselle (Fig. 6d, e), wat aandui dat RNase H1 DNA-skade in DRB- verlig het. vrygestelde selle wat replikasie-transkripsie botsings ondergaan. Gesamentlik dui hierdie resultate daarop dat genoom-onstabiliteit verhoog word wanneer transkripsie weer begin word binne getranskribeerde streke met disreguleerde DNA-replikasie-inisiasie.


Vrystelling van selsiklus-stilstand met Cdk4/6-inhibeerders genereer hoogs gesinchroniseerde selsiklus-vordering in menslike selkultuur

Elke benadering wat gebruik word om selsiklus-vordering van menslike sellyne te sinchroniseer, bied 'n unieke stel uitdagings. Induksiesinchronie met middels wat verbygaande vordering deur sleutelselsiklusstadia blokkeer, is gewild, maar verander stoigiometrieë van selsiklusreguleerders, roep kompenserende veranderinge in groeitempo op en, vir DNA-replikasie-inhibeerders, beskadig DNA. Die produksie, vervanging of manipulasie van 'n teikenmolekule moet buitengewoon vinnig wees as die interpretasie van fenotipes in die siklus wat bestudeer word, onafhanklik wil bly van impakte op vordering deur die voorafgaande siklus. Ons wys hoe hierdie uitdagings vermy word deur die vermoë van die Cdk4/6-inhibeerders, palbociclib, ribociclib en abemaciclib te ontgin om selsiklus-vordering by die natuurlike beheerpunt vir selsiklus-verbintenis te stop: die beperkingspunt. Nadat vorige werk geen verandering gevind het in die koppeling van groei en deling tydens herstel van CDK4/6 inhibisie nie, vind ons hoë grade van sinchronie in selsiklus progressie. Alhoewel ons CDK4/6-induksiesinchronisasie met hTERT-RPE-1, A549, THP1 en H1299 bekragtig, is dit effektief in ander lyne en vermy die DNA-skade wat met sinchronisasie deur timidienblok/vrystelling gepaardgaan. Bevoegdheid om terug te keer na siklus na 72 uur-stilstand, maak buite-siklus teikeninduksie/manipulasie moontlik, sonder om die voorafgaande siklusse te beïnvloed.

1. Agtergrond

Gesinchroniseerde progressie deur die seldelingsiklus deur 'n populasie ondersteun die vermoë om die biochemiese en funksionele eienskappe van die gesinchroniseerde grootmaatpopulasie terug te ekstrapoleer om gedrag in 'n individuele sel af te lei [1,2]. Baie benaderings is gewild. Grootmaat vlakke van DNA of selsiklus merkers ondersteun fraksionering van lewende, of vaste, sel populasies in poele verryk vir diskrete selsiklus stadiums [3,4]. Alhoewel opbrengste laag is, is seleksie-sinchronisasie gebaseer op grootte, of mitotiese afskud, hoogs effektiewe benaderings om selle in een siklusfase te isoleer van 'n groot populasie asinchroniese selle met 'n minimale impak op die proteoom [5-9]. Die gemak van induksie-sinchronie maak dit egter die mees toegepaste benadering.

Induksiesinchronie ontgin die vermoë van verbygaande blootstelling aan 'n spesifieke konteks om selle op 'n diskrete selsiklusstadium te akkumuleer, voordat die verwydering van die konteks gelyktydig alle selle in die populasie vrystel, om sinchroon te vorder deur daaropvolgende fases van die seldelingsiklus [1]. In giste oorheers verbygaande ablasie van selsiklusreguleerders deur omkeerbare voorwaardelike mutasies en die byvoeging van paringsferomone [10,11]. Alhoewel die koms van analoog-sensitiewe weergawes van selsikluskinases analoog chemiese genetiese benaderings in menslike weefselkultuurstudies [12-15], induksiesinchronie deur serumhonger [16], kontakinhibisie [17] of aktivering van óf die DNA-replikasie bekendgestel het. , of spilsamestelling, kontrolepunte [7,18] bly die mees gebruikte. Dit is egter belangrik om daarop te let dat elke vorm van arrestasie spesifieke veranderinge in die transkriptoom en proteoom op die kernsel siklus arrestasie handtekening plaas [19-21]. Hierdie spesifieke roetes na selsiklus-uitgang word weerspieël in verskillende roetes van terugkeer na die gesinchroniseerde siklusse [22]. Dus, die oënskynlike weerspieëling van normale selsiklus-progressie wat met seleksie-sinchronisasie bereik word, moet nog ooreenstem met huidige benaderings tot induksie-sinchronisasie [4,9,21].

Die ontdekking dat verbygaande behandeling met timidien gesinchroniseerde mitotiese progressie [18] gelei het tot protokolle wat die mate van sinchronie verskerp het deur 'n tweede timidienblok op te lê voordat selle in die studiesiklus vrygestel is [23-26]. Hierdie 'dubbele timidienblok' bly egter een van die gewildste keuses, maar die krag van hierdie benadering, sy afhanklikheid van die DNA-replikasie-kontrolepunt om S-fase-vordering te stop, met vasgeval DNA-replikasievurke, kom teen 'n prys. Alhoewel die selsiklus-stilstand in baie lyne robuust is, is die vasgestelde vurke geneig om ineen te stort oor die verlengde arrestasie en daaropvolgende pogings tot herstel stel skade en chromosomale herrangskikkings voor [27-31]. Daar is ook verslae van verstaanbare impak op RNA-biologie en proteoom tydens die verlengde S-fase arrestasie [21,32,33]. Hierdie gewilde benadering kan dus van beperkte nut wees in die studie van DNA-replikasie en sommige transkripsie- en chromatienverwante gebeurtenisse.

Wanneer vroeë selsiklusgebeure ontleed moet word, bied induksiesinchronie deur vrystelling van 'n mitotiese arrestasie in die vorige selsiklus 'n aantreklike alternatief. Maar, soos ander vorme van induksie sinchronie wat arresteer binne die siklus, verlengde selsiklus-arrestasie sal 'n wanbalans in die baie reguleerders genereer, wie se vlakke fluktueer met selsiklusprogressie, as gevolg van stadiumafhanklike transkripsie en/of vernietiging [21,34,35]. Gevolglik kan die volgende siklus heel moontlik verander word deur oormatige regulatoriese aktiwiteite, of substrate, geërf van die voorafgaande, in hegtenis geneem, siklus. Indringende studies deur Ginzberg et al. [36] het aan die lig gebring hoe teenmaatreëls om sommige wanbalanse te akkommodeer aanpassings in groeikoerse op twee punte in die siklus bevorder. Verder kan langdurige mitotiese arrestasie die atipiese mitotiese uitgang wat mitotiese glip genoem word [35,37] inisieer, apoptotiese paaie [38] aktiveer en / of 'n herinnering laat aan die mitotiese arrestasie wat selliklusprogressie in die volgende siklus en daarna verander [39- 42].

Dus, hoewel dit baie insiggewend is vir sommige vrae, data verkry deur tradisionele induksie-sinchroniese benaderings, wat staatmaak op arrestasie binne die siklus, moet met omsigtigheid geïnterpreteer word. Hulle moet gekonsolideer word met komplementêre data van alternatiewe benaderings om die gemeenskaplikhede te openbaar wat die artefakte uitsluit wat in elke afsonderlike benadering tot sinchronisasie aangegaan word.

'n Verdere uitdaging in die sinchronisering van selsiklusprogressie deur 'n populasie ontstaan ​​wanneer daar 'n behoefte is om die impak van proteïenuitputting, induksie of vervanging te bepaal. Dit is van kritieke belang om te verseker dat die vernietiging, induksie of aktivering van 'n mutante variant begin nadat die sinchroniseringsprosedure voltooi is. Indien nie, kan die fenotipe 'n nalatenskap wees wat voortspruit uit versteuring van vordering deur die vorige siklus, eerder as 'n direkte impak op die siklus wat bestudeer word. Vooruitgang in degron en PROTAC (PROteolysis TArgeting Chimera) tegnologie kan baie van hierdie uitdagings oorkom [43-45]. Selfs met baie induksie-sinchronisasiebenaderings moet die oorskakeling van een weergawe van 'n proteïen na 'n ander buitengewoon vinnig en volledig wees indien versteuring van die voorafgaande siklus vermy moet word.

Geïnspireer deur die krag van feromoon induksie sinchronisasie by G1 fase van gis selsiklusse [11,46], het ons die nut van induksie sinchronie met CDK4/6 inhibeerders palbociclib, ribociclib en abemaciclib ondersoek. Hierdie inhibeerders stop selsiklus-vordering van soogdierweefselkultuurselle by die beperkingspunt in G1-fase, voor verbintenis tot die selsiklus [47,48]. Sinchronisasie deur induksie vanaf die natuurlike pouse punt in die siklus het 'n aantal aantreklike eienskappe. Eerstens moet die selsiklusprogram nog aan die gang gesit word. Tweedens, verlengde arrestasie via Cdk4/6-inhibisie roep nie kompenserende veranderinge in selsiklus of groeikontroles op nie, maar pas dit bloot selgroottebeheer aan [36]. Laastens het palbociclib-opgelegde selsiklus-arrestasie minder impak op die transkriptoom as die seltipe-spesifieke veranderinge wat gesien word tydens sinchronisasie via kontakinhibisie en serumontneming [19,20].

Cdk4- en Cdk6-kinases bepaal verbintenis tot die selsiklus van baie selle [48]. Hulle werk saam met Cyclin D en die Kip-familielede p21 en p27 om aktiewe trimeriese kinase-komplekse te genereer wat die C-terminus van die retinoblastoom (Rb) familieproteïen [49-54] fosforileer. Hierdie mono-fosforilering ondersteun verdere fosforilering van Rb deur Cdk1/Cdk2–Cyclin E en Cdk1/Cdk2–Cyclin A komplekse [13]. Gehipo-gefosforileerde Rb bind styf aan die transkripsiefaktore van die E2F-familie, om die transkripsie van gene wat nodig is vir selsiklusverbintenis te blokkeer. Rb-verdunning en hiperfosforilering verlig hierdie inhibisie, om transkripsie van selsiklusgene te bevorder, insluitend Emi1, Cyclin E en Cyclin A [55]. Induksie van hierdie sikliene verhoog Rb-fosforilering vinnig deur Cyclin E en Cyclin A Cdk-komplekse [56]. Emi1-, Cyclin E- en Cyclin A-komplekse verseël dan toewyding aan die siklus deur die anafasebevorderende kompleks/siklosoom (APC/C)-aktiverende komponent Cdh1 te inhibeer, waardeur APC/C Cdh1-teikens, insluitend Cyclin A [57-61], stabiliseer.

Die sleutelrol wat Cdk4–Cyclin D en Cdk6–Cyclin D speel om sellulêre proliferasie voor te sit, en die kontras tussen die vermoë van muise om genetiese ablasie van Cdk4, Cdk6 en Cyclin D te oorleef en die verslawing van kankerlyne aan hierdie kinases, het daartoe gelei dat die ontwikkeling van klinies suksesvolle Cdk4/6-inhibeerders [62-66]. Hierdie inhibeerders bind aan die onaktiewe Cdk4-Cyclin D- en Cdk6-Cyclin D-dimere, eerder as die aktiewe trimeriese komplekse, maar tog stel hulle 'n baie doeltreffende selsiklus-stilstand [54]. Hierdie teen-intuïtiewe impak is voorgestel om te spruit uit die sekwestrasie van die onaktiewe dimere, of monomeriese kinases deur die middels. In hierdie model stel hierdie sekwestrasie p21 en p27 vry om konsentrasies van hierdie Cdk2-inhibeerders te verhoog, tot 'n vlak waar hulle die vermoë van die Cdk2–Cyclin A- en Cdk2–Cyclin E-komplekse blokkeer om die terugvoerlusse en S-fasegebeure wat toewyding aandryf, te bevorder na die siklus [48,54,67]. Elke geneesmiddel het 'n spesifieke 'off-teiken'-profiel. Ribociclib se indrukwekkende spesifisiteit word byna geëwenaar deur palbociclib, terwyl abemaciclib beduidende impakte buite die teiken toon, met noemenswaardige aktiwiteite teenoor Cdk1, Cdk2, Cdk7 en Cdk9 komplekse, wat 'n arrestasie in G2 langs G1 kan veroorsaak [68]. Paradoksaal genoeg kan hierdie buite-teiken impak verantwoordelik wees vir die groter doeltreffendheid van abemaciclib in sommige kliniese omgewings [68,69].

Ons beskryf hoe Cdk4/6-induksiesinchronie hoogs sinchrone progressie deur die selsiklusse van 'n aantal lyne genereer, sonder die merkbare voorkoms van 'n merker van DNA-skade, fokuspunte van kleuring met teenliggaampies wat serien 139 van die histoon γ-H2AX herken wanneer dit is gefosforileer (γ-H2AX), wat timidien-induksie-sinchronisasie vergesel. Die vermoë om terug te keer na die siklus na 72 uur arrestasie in G1 met palbociclib sal 'n wye reeks manipulasies in die gearresteerde, nie-fietsryende toestand ondersteun [70]. Dus, enige impak op vordering deur die siklus van studie sal nie 'n sekondêre gevolg wees van versteuring van die voorafgaande selsiklus nie.

2. Metodes

2.1. Sellyne en selkultuur

Die sellyne wat in hierdie studie gebruik word, word in elektroniese aanvullende materiaal, tabel S1, gelys. By ontvangs is lyne uitgebrei en gevries in aliquots van 1 × 10 6 selle wat uitgebrei is met ten minste twee siklusse van voortdurende deurgang voor elke eksperiment. Tensy anders vermeld, is hTERT-RPE-1, A549, GP2d, LoVo, U2OS, DLD-1, HCT 116, HeLa, A172, HMBC, HEK293, HEK293T en H157 onderhou in hoë glukose Dulbecco se gemodifiseerde arende medium (DM654EM,: D654EM) Sigma Aldrich) aangevul met 10% FBS (Hyclone, Suid-Amerikaanse oorsprong, SV30160.03, GE Healthcare) 2 mM GlutaMAX (Gibco, 35050061) en 1000 U ml -1 Penisillien/Streptomisien (Gibco, 15140122). THP1, H1299, H1975, H1437, H2052, H2452, H520, H1915, NB-19, BEAS2B en H1395 is in stand gehou in Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) aangevul met 2 mM Glutaamax (618% Fcomax (618% Fco) Hyclone, Suid-Amerikaanse oorsprong, SV30160.03, GE Healthcare) en 1000 U ml −1 Penisillien/Streptomisien (Gibco, 15140122). MCF 10A is onderhou in Dulbecco se gemodifiseerde arende medium/voedingstofmengsel F-12 Ham (D6421, Sigma Aldrich), aangevul met 10% Perdeserum (16050130, ThermoFisher), 10 µg ml −1 Insulien (I9278, Sigma Aldrich), µg. Aldrich. ml -1 Hidrokortisoon (H0888, Sigma Aldrich), 20 ng ml -1 menslike epidermale groeifaktor (hEGF: E9644, Sigma Aldrich) en 1000 U ml -1 Penisillien/Streptomisien (Gibco, 15140122). 'n Voorraadoplossing van 1 mg ml −1 hidrokortisoon is in etanol voorberei en 'n 100 µg ml −1 voorraadoplossing van hEGF is in water voorberei. Albei is in aliquots by -20°C gestoor. Selle is by 'n samevloeiing van minder as 70% gehandhaaf en populasies is nie meer as 10 keer voor enige eksperiment deurgegaan nie. In figuur 2e, waar hTERT-RPE-1-selle in RPMI gekweek word, is selle oorspronklik van die bevrore voorraad in DMEM gekweek, twee keer in RPMI deurgegee, dan in RPMI uitgeplaat aan die begin van die eksperiment.

2.2. Dwelmbehandeling

Palbociclib (PD-0332991), abemaciclib (LY2835219) en ribociclib (LEE011) is by Selleck (onderskeidelik katalogusnommers S1116, S5716 en S7440) gekoop, terwyl timidien (T1895) en nocodazole-ryk (M.) Palbociclib, abemaciclib, ribociclib en nocodazole is in DMSO opgelos om voorraadoplossings van 10 mM in elke geval te genereer. Timidien is in water opgelos om 'n voorraadoplossing van 100 mM te maak. Alle voorraad is in aliquots by -20°C gestoor.

Vir adherente sellyne is selle van die substraat vrygestel deur behandeling met tripsien (15400054, Gibco), gepelleteer deur sentrifugering by 300g vir 5 minute voor hersuspensie in groeimedia. Selle is getel deur gebruik te maak van 'n TC20 outomatiese selteller (BioRad) en 2.5 × 10 5 selle is in 'n 10 cm skottel (353003, Falcon) met 10 ml media (plateringsdigtheid = 4.4 × 10 3 per cm 2) uitgeplaat. Vir die THP1-suspensielyn is selle gepelleteer deur sentrifugering by 300g vir 5 minute, hersuspendeer in groeimedia en getel, voordat 1 × 10 6 selle in 10 ml media in 'n 10 cm skottel gesaai is. Selle is dan vir 6 of 12 uur geïnkubeer (sien figuur legendes) voordat geneesmiddel bygevoeg is.

2.3. Vloeisitometrie

Vir selsiklus-analise is selle een keer met fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS) gewas voordat dit uit die substraat met tripsien vrygestel is, en in PBS gewas voor fiksasie in yskoue 70% Etanol en vir ten minste 18 uur by -20°C gevries. tot 'n maksimum van twee weke. Vaste selle is gepellet, drie keer in PBS by kamertemperatuur gewas voordat 50 µl 100 µg ml −1 RNase (NB-03-0161, Generon) by die finale korrel gevoeg is, gevolg deur 500 µl 50 µg ml −1 propidiumjodied ( P4170, Sigma-Aldrich) opgelos in PBS. Monsters is ontleed binne 'n venster van tussen 30 min en 6 uur na byvoeging van propidiumjodied. Data is verkry op 'n BD LSR II vloeisitometer (BD Biosciences) met behulp van FACSDiva™ sagteware (BD Biosciences) en ontleed met FlowJo sagteware (BD Biosciences). 'n Totaal van 1 × 10 4 selle is vir elke monster getel.

S-fasestatus is gemonitor deur 5-etyniel-2'-deoksiuridien (EdU) inkorporering met die Click-iT™ Plus EdU Alexa Fluor 488 Flow Sitometry Assay Kit (ThermoFisher, C10632) volgens die vervaardiger se instruksies te meet. Om kumulatiewe DNA-inhoud tussen die tyd van vrystelling en die punt van fiksasie in figuur 9 te monitorc, 1 µM EdU is bygevoeg ten tyde van vrystelling van palbociclib. Selle is getripsiniseer en gewas met 3 ml 1% BSA in PBS, dan geïnkubeer met 100 µl Click-iT™ fikseermiddel vir 15 minute, gepelleteer, gewas met 3 ml 1% BSA in PBS en oornag by 4°C gelaat. Selle is hersuspendeer in 100 µl 1× Click-iT™ permeabilisering en wasreagens en geïnkubeer met 500 µl Click-iT™ Plus reaksieskemerkelkie vir 30 minute, voordat dit een keer gewas is met 3 ml 1× Click-iT™ permeabilisering en was reagens en hersuspendeer in 500 µl 1× Click-iT™ permeabilisering en wasreagens. FxCycle Violet vlek (F10347, Invitrogen) is bygevoeg tot 'n finale konsentrasie van 1 µg ml -1. Monsters is ontleed op 'n BD LSR II vloeisitometer (BD Biosciences) met behulp van FACSDiva sagteware (BD Biosciences) en ontleed met FlowJo sagteware (BD Biosciences). 'n Totaal van 10 4 selle is per monster getel. Vir kwantifisering is die piek van 2 N-selle gebruik om 'n assessering van 2 N DNA-inhoud te bepaal, aangesien die oorvleueling tussen S-fase en G2/M dit uitdagend gemaak het om selsiklusstatus kategories op grond van 4 N DNA-inhoud alleen toe te ken. Dus, deur die hele manuskrip, monitor ons selsiklus progressie as 'n vermindering in 2 N DNA inhoud.

2.4. Immunofluoressensie

Selle is op 13 mm dekstrokies (No. 1.5, VWR, 631-0150P) in 10 cm-skottels (353003, Falcon) gekweek deur die toepaslike groeitoestande te gebruik. Vir EdU-kleuring is die Click-iT™ EdU Selproliferasiestel vir beeldvorming, Alexa Fluor™ 594 kleurstof (Invitrogen, C10339) gebruik. Een uur voor die oes van selle is 10 µM EdU by die groeimedium gevoeg. Selle is in PBS gewas voordat dit vir 20 minute in 2% paraformaldehied in PBS vasgemaak is, voor drie wassings in PBS + 0.1% Tween en oornag in PBS + 0.1% Tween gestoor word by 4°C. Permeabilisering in PBS + 0.5% Triton-X-100 is gevolg deur drie wassings in PBS + 0.1% Tween. Die Click-iT™-reaksie vir EdU-opsporing is volgens die vervaardiger se instruksies uitgevoer. Selle is drie keer gewas in 5% Bees Serum Albumien (BSA ThermoFisher Scientific, 11423164) in PBS en dan geïnkubeer met primêre teenliggaampies teen H2AX (Ser139), kloon JBW301 (Millipore Kat no. 05-636, RRID:64_30) teen 'n dimensie van 809 1 in 500 vir 1 uur voor drie wassings in PBS + 5% BSA en inkubasie met 'n 1 in 500 verdunning van bok anti-muis IgG Alexafluor 488 teenliggaampie (Thermo Fisher Scientific Kat no. A32723, RRID:AB_2633275), en 2 mg ml −1 4',6-diamidino-2-fenilindool (DAPI, ThermoFisher Scientific, 11916621) vir 1 uur. Na 'n verdere drie wassings in PBS + 0.1% Tween, is dekstrokies gemonteer deur inversie op 2 µl Vectashield Antifade Mounting Medium (Vector Labs H1000). Skyfies is ontleed met 'n Axioskop2 (Zeiss, Inc.) mikroskoop.

2.5. Proteïen analise

Om hTERT-RPE1-proteïenmonsters te versamel, is kweekmedium verwyder, deur aspirasie, van 'n 10 cm-plaat, voor twee spoelings in PBS en byvoeging van 400 µl TruPAGE LDS-monsterbuffer (Sigma-Aldrich, PCG-3009) wat volledige protease-inhibeerderskemerkelkie bevat (Roche, 11697498001), PhoSTOP (Sigma-Aldrich, 4906837001) en DTT Sampler Reducer (Sigma-Aldrich, PGC-3005) na die bord. Selle is van plaat geskraap vir oordrag in 'n 1.5 ml mikrofugbuis en in vloeibare stikstof gevries vir berging by -80°C. Vir THP1 is selle by 300 sentrifugeerg vir 3 min en die korrel hersuspendeer in monsterbuffer soos hierbo, gevries in vloeibare stikstof en gestoor by -80°C. Monsters is vir 10 minute by 70°C verhit voordat dit op 'n 10 cm, 10% voorafvervaardigde TruPAGE-gel (Sigma-Aldrich PCG2009) met TruPAGE SDS-loopbuffer (Sigma Aldrich PCG3001) gelaai is en na PVDF-membraan (BioRad, 1 620 177) oorgeplaas is deur nat oordrag met TruPAGE-oordragbuffer (Sigma-Aldrich PCG3011). Membrane is geblokkeer in 5% melk en geïnkubeer in 2% BSA met primêre teenliggaampies teen GAPDH (Cell Signaling Technology Cat no. 13084, RRID:AB_2713924), Eg5 (Sigma Aldrich Cat no. SAB4501650, RRID:AB_10747045), Signaling Wee1 (Seining Wee1 (Cell). Tegnologie Katnr 13084, RRID:AB_2713924) of pHH3 ser10 (pasgemaakte teenliggaam teen peptied ARTKQTARKS*TGGKAPRKQLASK: Eurogentec) oornag by 4°C. Na was, is membrane vir 1 uur by kamertemperatuur geïnkubeer, met die toepaslike sekondêre teenliggaampie (Anti-muis IgG fosfatase-gekonjugeerde teenliggaampie (Sigma-Aldrich Cat no. A3688, RRID:AB_258106), of Anti-konyn IgG fosfatase-gekonjugeerde teenliggaam (Sigma-Aldrich Cat# A3687, RRID:AB_258103)), gewas en ontwikkel met chromogeniese 5-Broom-4-chloor-3-indolielfosfaat (BCIP, Sigma-Aldrich, B6149).

3. Resultate

3.1. Doeltreffende sinchronisasie van hTERT-RPE1 selsiklus progressie met verbygaande palbociclib behandeling

Die telomerase verewig hTERT-RPE1 sellyn word wyd gebruik vir selsiklus en mitotiese studies, maar is nogtans weerstandbiedend vir dubbel timidien blok induksie sinchronisasie. Ons het dus hierdie gewilde lyn gekies om die doeltreffendheid van G1 arrestasie en vrylating deur kortstondige blootstelling aan palbociclib te bepaal.

Selle is gegroei tot 1.5 × 10 4 selle cm −2 in serum aangevul (10%) Dulbecco se gemodifiseerde arende medium (DMEM), voor vrystelling van die substraat met tripsien en platering teen 'n digtheid van 4.4 × 10 3 selle per cm 2. Ses uur later is palbociclib bygevoeg in 'n reeks konsentrasies van 50 nM tot 1 µM tot twee identiese populasies. Vier-en-twintig uur later is een populasie vasgestel, terwyl die palbociclib-bevattende medium vir die ander vervang is met voorafverwarmde medium wat 330 nM nokodasool bevat, voordat hierdie monster 'n verdere 24 uur later vasgestel is. DNS-inhoudbepaling deur fluoressensie-geaktiveerde selsortering (FACS) analise van propidiumjodied (PI)-gekleurde monsters het 'n stywe arrestasie op die 24 uur tydpunt getoon met 2 N DNA inhoud by alle palbociclib konsentrasies van 100 nM en hoër (figuur 1)a,b). Selle wat geredelik vrygelaat word in 'n 4 N arrestasie nadat hulle vir 24 uur in G1 in hegtenis geneem is met 100 nM en 200 nM palbociclib, maar vrystelling was minder doeltreffend toe die arrestasie opgelê is deur 500 nM en 1 µM palbociclib (figuur 1)b) aangesien die 2 N DNA inhoud hoog gebly het 24 uur na nokodasool byvoeging.

Figuur 1. Palbociclib induksie sinchronie van hTERT-RPE1 selle. (a) hTERT-RPE1-selle is gegroei tot 1.5 × 10 4 selle cm 2 in DMEM (+10% serum), getripsiniseer en uitgeplaat in 10 cm-skottels by 4.4 × 10 3 cm -2. Ses uur later is 150 nM palbociclib by die kultuur gevoeg. Na 24 uur is selle twee keer met voorafverwarmde medium gewas voor die byvoeging van voorafverwarmde medium wat 330 nM nokodasool bevat het voor inkubasie vir 'n verdere 24 uur. Monsters (een 10 cm-skottel per datapunt) is gekleur vir propidiumjodied FACS-analise op die volgende tye: net voor palbociclib-byvoeging (U, onbehandeld), by die oorskakeling van palcociclib na nokodasoolmedium (P) en 24 uur na hierdie oorskakeling na nokodasool (P + N). Die sterkte van die nokodasool-geïnduseerde spilkontrolepunt arrestasie is geopenbaar deur die byvoeging van nokodasool tot 'n asynchrone populasie (U + N) vir 24 uur. Die bimodale piek in die boonste paneel (U) toon 2 N (G1, links) DNA en 4 N (G2/M, regs) DNA-inhoud van 'n asynchrone, onbehandelde populasie. Hierdie eksperiment is ses keer herhaal. (b) Selpopulasies is op dieselfde manier behandel as (a) met die palbociclib-konsentrasie verander na die aangeduide waarde en een monster wat onbehandeld gelaat word. Die gemiddelde frekwensie van 2 N selle van ten minste drie biologiese herhalings word vir die palbociclib (grys stawe) en nokodasool (blou stawe) arrestasiepunte geplot. Foutbalkies wys die limiete van 1 s.d.. (c,d) hTERT-RPE1-selle is gegroei tot ongeveer 1.5 × 10 4 selle cm -2 in DMEM (+10% serum), getripsiniseer en in 10 cm-skottels uitgeplaat teen 4.4 × 10 3 cm -2. Twaalf uur later is 150 nM palbociclib by die kultuur gevoeg, voor drie wassings in voorafverwarmde DMEM en monsterneming van een skottel elke uur om die propidiumjodied FACS-profiele te genereer in (c) waaruit die plotte van 2 N-inhoud getoon in (d) afgelei is. Die nommers langs die erwe in c dui tyd (ure) sedert vrystelling aan met U wat 'n onbehandelde kontrolepopulasie aandui. Die 13–25 uur plotte (rooi (c): oop blokkies (d)) is gelyktydig geneem langs die 0-12 uur populasie (grys (c): gevulde sirkels (d)). Die sinchronisasie wat in (c,d) is ses keer uitgevoer en toon altyd vergelykbare resultate, maar variasies in die presiese sinchronisasieprofiele in elke eksperiment (soos gesien kan word in die daaropvolgende figure in die manuskrip) beteken dat dit nie gepas is om hulle in 'n enkele datastel saam te voeg nie.

Monitering van DNS-inhoud met uurlikse intervalle na vrystelling van 150 nM palbociclib-arresering het 'n sinchrone progressie van G1-arres met 2 N DNA, deur S-fase na G2/M-fases met 4 N DNS-inhoud geopenbaar voor 'n terugkeer na 2 N DNA om 20 uur (figuur) 1c,d). Soos met alle eksperimente wat hierin aangebied word, is 24, of 48, h periodes gedek deur steekproefneming van parallelle populasies aangedui deur swart en rooi lyne/skakering in die FACS plotte en sirkels en vierkante in die grafieke. Byvoorbeeld, in die 0-13 uur monsters van 'n 24 uur eksperiment, is palbociclib verwyder aan die begin van monsterneming, terwyl die vrystelling 13 uur vroeër gedoen is vir monsters wat gelyktydig vir die 13-24 uur monsters versamel is. Gevolglik het baie grafieke wat ons aanbied 13 uur tydpunte van elke stel.

Aangesien die tweede siklus na vrystelling minder geneig is om deur die fisiologiese uitdagings van induksiesinchronie beïnvloed te word, is dit dikwels wenslik om hierdie tweede siklus te monitor, eerder as die eerste siklus na vrystelling [1]. Ons het dus ons assesserings uitgebrei om die totale DNA-inhoud oor 48 uur na vrystelling van 24 uur behandeling met 150 nM palbociclib te monitor. 'n Merkwaardige mate van sinchronie het voortgeduur in die tweede siklus met 2 N-selle wat 30 uur na vrylating afgeneem het om 46% van die bevolking uit te maak (figuur 2a elektroniese aanvullende materiaal, figuur S1). Dit sal dus moontlik wees om sommige neigings in biochemiese gedrag wat verband hou met selsiklus-vordering in die tweede siklus na vrystelling te monitor.

Figuur 2. Konteks en deursettingsvermoë vir palbociclib-induksie-sinchronisasie. Vir (a), is hTERT-RPE1-selle gegroei tot ongeveer 1.5 × 10 4 selle cm −2 in DMEM (+10% serum), getripsiniseer en in 10 cm-skottels uitgeplaat by 4.4 × 10 3 cm −2. Twaalf uur later is 150 nM palbociclib bygevoeg. Vier-en-twintig uur na palbociclib-byvoeging is selle twee keer gewas met medium wat geen palbociclib bevat het voor inkubasie in voorafverwarmde DMEM (+10% serum) met monsterneming van een skottel elke 2 uur vir propidiumjodied FACS-kleuring om die profiele in 12 uur groepe wat 'n 48 uur vrystellingsperiode van dieselfde populasie selle dek. Monsters vir die 0–12 (gevulde sirkels), 14–24 (oop vierkante), 26–36 (gevulde sirkels) en 36–48 (oop vierkante) is parallel geneem uit subpopulasies waarby die palbociclib gevoeg is met verspringende tussenposes . Hierdie eksperiment is twee keer uitgevoer, met soortgelyke resultate in elke iterasie. (be) Plotte afkomstig van dieselfde populasie selle. Vir (b), is hTERT-RPE1-selle gegroei tot 1.5 × 10 4 selle cm -2 in DMEM (+10% serum), getripsiniseer en in 10 cm-skottels op 4.4 × 10 3 cm -2 uitgeplaat. Twaalf uur later is 150 nM palbociclib bygevoeg. Vier-en-twintig uur na geneesmiddelbyvoeging is die selle twee keer met medium gewas voor inkubasie in voorafverwarmde DMEM (+10% serum) wat nie palbociclib het nie en twee groepe van dieselfde populasie hTERT-RPE1-selle is gevolg, met monsterneming van een 10 cm gereg vir elke datapunt. In een groep (oop simbole) is 150 nM palbociclib weer by die populasie gevoeg 12 uur na die aanvanklike vrystelling van palbociclib, terwyl die ander gelaat is om die beperkingspunt na die tweede siklus (rooi) te vervoer. Vir (c), die digtheid waarteen selle van dieselfde populasie gebruik is vir die aanvanklike platering in (b en d) is uitgeplaat teen 'n viervoudig hoër digtheid van 1,76 × 10 4 selle cm -2 in 10 cm-skottels. (d) Die uitbreiding van dieselfde beginpopulasie wat gebruik word in (b) en (c) het een siklus van splitsing ontbreek sodat die beginpopulasie wat gesinchroniseer was in (d) is gegroei tot samevloeiing (vroeë kontak inhibisie) voor platering 12 uur voor palbociclib byvoeging. (e) Selle van dieselfde flessies wat gebruik is om die populasies wat in gebruik word, te saad bd is vir twee gange in RPMI gekweek, saam met die selle wat in bd, voor die hele sinchronisasie soos uiteengesit in figuur 1c is in RPMI uitgevoer. Vir (be), is monsters gelyktydig geneem uit twee groepe van dieselfde populasie: palbociclib is aan die begin van 'n 12 uur monsternemingsperiode (sirkels) by een gevoeg, terwyl dit 12 uur vroeër by die ander gevoeg is (vierkante). Vir die FACS plotte waaruit hierdie 2 N DNA inhoud afgelei is, sien elektroniese aanvullende materiaal, figure S1 en S2.

Wanneer gebeure aan die einde van die siklus bestudeer word, sal die selle in die populasie wat die vinnigste fietsry, na die volgende selsiklus vorder om 'n tweede ronde selsiklusgebeurtenisse te begin voordat die gebeure in die eerste siklus in sommige lede van die populasie heeltemal voltooi is. Hierdie natuurlike en subtiele variasie in die tydsberekening van selsiklus-vordering genereer 'n saamgevoegde datastel, waarin inligting van die tweede siklusse van sommige selle gesuperponeer word op dié van die selle wat nog die einde van hul eerste siklus nader. Op hierdie manier kan die fyner punte van die kinetika van verandering in die eerste siklus verduister word deur oorvleuelende gebeure in die daaropvolgende siklus. Een eenvoudige oplossing om hierdie verwarring te oorkom, sou wees om te verseker dat die uitgang van die eerste siklus geblokkeer is. Dit kan maklik bereik word deur herbyvoeging van palbociclib halfpad deur die eerste selsiklus. Ons het dus gevra of so 'n herbyvoeging van palbociclib, na vrylating vanaf die eerste arrestasie, die vordering deur die waargenome siklus sou benadeel. Dit is bemoedigend dat 'n tweede toediening van Cdk4/6 inhibeerder 12 uur na vrystelling geen impak gehad het op vordering deur die siklus wat bestudeer word nie (figuur 2)b), vergelyk die rooi (geen herbyvoeging) en oop swart simbole (palbociclib bygevoeg om 12 uur: elektroniese aanvullende materiaal, figuur S2a,b). Palbociclib-hertoevoeging kan dus gebruik word om waarnemings te isoleer teen die gevolge van toegang tot die volgende siklus, om sodoende groter insig te gee in die kinetika van selsiklusgebeure.

3.2. Groeitoestande is die sleutel vir optimale sinchronisasie

Die impak van metabolisme, groeibeheer en stilte op die beheer van verbintenis tot die selsiklus het ons aangespoor om die impak van konteks op die doeltreffendheid van palbociclib-induksie-sinchronisasie van hTERT-RPE1-selle te bepaal. Daar was 'n noemenswaardige vermindering in die doeltreffendheid van sinchronisasie van hTERT-RPE1-selle toe die digtheid van die populasie wat op plastiek gesaai is 6 uur voor palbociclib-byvoeging viervoudig verhoog is tot 1.76 × 10 4 selle cm-2. By hierdie digtheid het die proporsie van die populasie met 'n 2 N DNS-inhoud slegs afgeneem tot 38% eerder as die daling tot 16% in die identiese populasie wat op 4.4 × 10 3 cm −2 uitgeplaat is (figuur 2)c elektroniese aanvullende materiaal, figuur S2c). Die doeltreffendheid van beide arrestasie en vrylating is ook benadeel toe die identiese populasie wat in figuur 2 gebruik isb,c is tot samevloeiing gegroei om 'kontakinhibisie' te veroorsaak voor splitsing om die bevolkings te genereer wat vir die sinchronisasie in hegtenis geneem is (afgeneem tot slegs 23% 2N, figuur 2d elektroniese aanvullende materiaal, figuur S2d). Laastens, in gelyktydige studies van selle van dieselfde aanvanklike populasie wat twee keer in Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) deurgegaan is voor sinchronisasie in hierdie medium, minder selle het selsiklus-vordering na 24 uur in Palbociclib gestop (81% teenoor 95%) en die proporsie 2 N-selle het slegs tot 37% van die bevolking in RPMI gedoop, eerder as die afname tot 16% in DMEM (figuur 2)b,e elektroniese aanvullende materiaal, figuur S2a,e). Kweektoestande verander dus die doeltreffendheid van sinchronisasie en sodra aanvanklike studies aandui dat 'n lyn bevoeg is vir sinchronisasie, moet 'n verskeidenheid toestande geassesseer word en sorg moet gedra word om te verseker dat selle in aktiewe verspreiding in die uitbreiding in die aanloop bly. tot sinchronisasie.

3.3. Ossillasies in gevestigde selsiklusmerkers vergesel vordering deur gesinchroniseerde siklusse

Om die bruikbaarheid van die benadering vir biochemiese toetse te evalueer, is uittreksels van 'n palbociclib-gesinchroniseerde kultuur ondersoek met teenliggaampies om merkers te monitor waarvan die vlakke fluktueer namate selle se transito-siklusse op ander maniere gesinchroniseer word. Verwagte fluktuasies in die vlakke van die kinesien 5 Eg5 en fosforilering op serien 10 van histoon H3 beklemtoon die nut van hierdie benadering om biochemiese veranderinge regdeur die populasie te monitor (figuur 3).

Figuur 3. Cdk4/6-induksie-sinchronie kan verbygaande selsiklusgebeure openbaar. hTERT-RPE1-selle is gegroei tot ongeveer 1.5 × 10 4 selle cm -2 in DMEM (+10% serum), getripsiniseer en geplateer teen 4.4 × 10 3 cm -2 in 10 cm-skottels. Twaalf uur later is 150 nM palbociclib bygevoeg. Vier-en-twintig uur na byvoeging van palbociclib, is die selle twee keer in groeimedium gewas voordat die medium vervang is met voorafverwarmde DMEM (+10% serum) wat geen palbociclib bevat het nie. Een 10 cm-skottel is elke uur vir elke monster geneem om die propidiumjodied FACS-profiele in 13 uur-groepe te genereer (a) om die fluktuasies in 2 N DNA-inhoud in die populasie te meet (b), terwyl monsterneming geneem word om die aangeduide merkers elke 2 uur deur westelike klad te monitor (c). Die nommers langs die plotte in (a) dui ure sedert vrystelling aan met U wat 'n onbehandelde kontrolepopulasie aandui. Beide die mitotiese kinesien 5 motorproteïen Eg5 en fosforilering van die serien van histoon H3 by posisie 10 piek as selle terugkeer van die 4 N toestand na die 2 N toestand (mitose en seldeling). Hierdie plot toon een van die drie herhalende eksperimente, wat soortgelyke fluktuasies in dieselfde selsiklusmerkers aan die lig gebring het.

3.4. Sinchronisasie van veelvuldige lyne met palbociclib, ribociclib en abemaciclib

Ons het vervolgens gevra of palbociclib-induksie-sinchronisasie insgelyks effektief in ander lyne sal wees deur die doeltreffendheid van arrestasie en daaropvolgende vrystelling in nokodasool van 'n verdere 24 sellyne te bepaal na die byvoeging van 'n reeks palbociclib-konsentrasies vir 24 uur gevolg deur vervanging met 330 nM nokodasoolmedium en inkubasie vir 'n verdere 24 uur. Hierdie eksperimente was verkennend van aard en is dus nie in dieselfde mate van strengheid gedoen as die studies van hTERT-RPE1 of die gedetailleerde A549, H1299 en THP-1 ontledings wat elders in hierdie manuskrip beskryf word nie. Spesifiek, vir sommige lyne is minder as 10 000 selle getel en slegs twee biologiese herhalings (elk met twee tegniese herhalings) is uitgevoer. Hierdie verkennende ondersoeke het geen noemenswaardige impak van palbociblib op selsiklusprogressie in 7 van die 24 lyne (figuur 4) getoon nie, gedeeltelike response in 9, met ontginbare arrestasie- en vrylatingprofiele waargeneem in 8: MCF10A, LoVo, H1975, NB19, DLD1 (figuur) 5), THP-1, H1299 en A549. Robuuste arrestasievrystelling in die H1299, A549 en THP-1 is bevestig in strenger toetsing van ten minste drie biologiese herhalings, meer as 10 000 seltellings (figuur 6).

Figuur 4. Palbociclib induksie sinchronisasie sifting: vuurvaste sellyne. Die aangeduide sellyne is tot ongeveer 1.5 × 10 4 selle cm −2 in gegroei in die media gespesifiseer in die metodes, getripsiniseer en in 10 cm skottels uitgeplaat teen 4.4 × 10 3 cm −2. Ses uur later is die selle met die aangeduide konsentrasie palbociclib behandel of onbehandel gelaat. Vier-en-twintig uur hierna is monsters gekleur vir propidiumjodied FACS-analise om die proporsie van die populasie wat 'n 2 N DNA-inhoud gehad het, te bepaal. Een 10 cm-skottel is vir elke datastel gebruik. Elke plot verteenwoordig die gemiddelde van 'n minimum van vier datastelle (ten minste twee biologiese herhalings, wat elk ten minste twee tegniese herhalings gehad het). Die foutstawe verteenwoordig 1 × s.d.

Figuur 5. Palbociclib induksie sinchronisasie sifting: reageer sellyne. Elke lyn is gekweek in die media wat in die metodes gespesifiseer is tot ongeveer 1,5 × 10 4 selle cm −2 tripsiniseer, en geplateer teen 4,4 × 10 3 cm −2 in 10 cm skottels. Ses uur later is 0.2 of 1 µM palbociclib by een derde van die skottelgoed vir elke selpopulasie gevoeg. 'n Kontrolemonster is onbehandel gelaat. Vier-en-twintig uur hierna is selle óf gefixeer vir kleuring (grys stawe) óf twee keer met vars medium gewas voor inkubasie in 330 nM nokodasool vir 24 uur waarna hierdie monsters gefixeer en verwerk is vir propidiumjodied FACs analise saam met die monsters wat is 24 uur vroeër reggemaak (blou stawe). Die proporsie van die populasie wat 'n 2 N DNA-inhoud gehad het, is uit die FACs-profiele bereken en in die panele geplot. Die monsters van die eerste 24 uur inkubasie word in grys getoon, terwyl die daaropvolgende nokodasool-behandelde monsters in blou getoon word. Elke plot verteenwoordig die gemiddelde van ten minste vier datastelle (ten minste twee biologiese herhalings, wat elk ten minste twee tegniese herhalings gehad het). Die foutstawe verteenwoordig 1 × s.d. Hierdie eksperimentele toetse was suiwer verkennend van aard met die doel om lyne te vind vir meer gedetailleerde analise in die res van die studie. Hierdie data moet dus nie gebruik word om die aanpasbaarheid van Cdk4/6i-sinchronisasie in die sellyne wat 'n gedeeltelike reaksie toon, uit te sluit nie. Ons het nie verskillende inhibeerders, media, langer inkubasies getoets nie (in die geval dat die selsiklusse van sekere lyne dié van THP-1 van meer as 24 uur naboots), of of die byvoeging van 'n MAP-kinase-inhibeerder, of Cdk6 PROTAC die reaksies kan verskerp . Sien Bespreking vir meer besonderhede.

Figuur 6. Spektrum van response van vier verskillende lyne op drie Cdk4/6 inhibeerders. THP1 en H1299 is in RPMI (+10% serum) gekweek en hTERT-RPE1 en A549 is in DMEM (+10% serum) gekweek. Elke aanhangende lyn is gegroei tot ongeveer 1.5 × 10 4 selle cm −2 voordat hulle getripsiniseer is en teen 4.4 × 10 3 cm −2 in 10 cm skottels uitgeplaat is. Die suspensie THP1-selle is gegroei tot ongeveer 4 × 10 5 ml -1, gesentrifugeer by 300g vir 3 min voordat dit geplateer word by 1 × 10 5 ml −1 in 10 cm-skottels. Een 10 cm-skottel is vir elke toestand uitgeplaat. Ses uur later is die aangeduide konsentrasie van die aangeduide Cdk4/6-inhibeerder by elke populasie gevoeg. Vier-en-twintig uur hierna is monsters ('n hele 10 cm-skottel) óf gefixeer óf twee keer met vars medium gewas voor inkubasie in media wat 330 nM nokodasool vir 24 uur bevat, waarna hierdie monsters gefixeer en verwerk is vir propidiumjodied FACs-analise saam met die monsters wat 24 uur vroeër vasgestel is (blou stawe). Die proporsie van die populasie wat 'n 2 N DNA-inhoud gehad het, is uit die FACs-profiele bereken en in die panele geplot. Die monsters van die eerste 24 uur inkubasie word in grys getoon terwyl die daaropvolgende nokodasool arrestasie profiele in blou. Elke plot verteenwoordig die gemiddelde van ten minste drie biologiese herhalings. Die foutstawe verteenwoordig 1 × s.d.

Aangesien die verskillende Cdk4/6-remmers duidelike farmakologiese response toon [68], het ons induksie-sinchronisasieprofiele in vier verskillende lyne vergelyk om die spektrum van reaksies te bepaal en of 'n afhanklikheid van palbociclib alleen as 'n manier om bevoegdheid vir CDK4/6-inhibisie-induksie-sinchronie te beoordeel. 'n geldige benadering was, of of ander inhibeerders selfs groter doeltreffendheid kan toon. A549, H1299, THP1 en hTERT-RPE1 populasies is blootgestel aan 'n reeks palbociclib-, ribociclib- en abembacilib-konsentrasies, voordat die CDK4/6-middelbevattende medium 24 uur na die arrestasie vir medium wat nokodasool bevat omgeruil is. Hierdie nokodasool-bevattende kohorte is dan 24 uur na die omruiling na nokodasool geoes (figuur 6).

In ooreenstemming met die doeltreffendheid van palbociclib, het hierdie geselekteerde lyne sterk Cdk4/6 inhibeerder induksie sinchronie met die twee ander inhibeerders getoon (figuur 6). Palbociclib en ribociclib het uitstekende en vergelykbare arrestasie/vrystelling profiele oor 'n wye reeks konsentrasies gegee. Daarenteen was die venster van bevoegdheid baie nouer vir abemaciclib (figuur 6). Wanneer die doeltreffendheid van G1 arrestasie gebruik word om konsentrasies van geneesmiddel te identifiseer wat 'n vergelykbare impak op beperkingspunt deurgang het, was die vermoë om die G1 arrestasie in die G2 blok te verlaat merkbaar laer toe die inhibisie deur abemaciclib opgelê is. Byvoorbeeld, vir hTERT-RPE1-selle, is 200 nM abemaciclib nodig om dieselfde blok in G1 as 100 nM palbociclib te bereik, maar daar was groot variasie in die vermoë om vry te stel en 'n gemiddeld van 57% van die bevolking het in hegtenis geneem met 2N, eerder as die 15% wat in die palbociclib-behandelde bevolking voortduur (figure 1b en 6d). Hierdie ondoeltreffendheid is 'n herhalende tema in alle reëls (figuur 6a–c). Vergelykings tussen palbociclib en ribociclib openbaar subtiele onderskeidings wat daarop dui dat, wanneer uitgebreide werk met 'n spesifieke lyn uitgevoer moet word, daar verdienste sal wees om beide inhibeerders te toets wanneer die dosis-responsprofiel fyn afgestem word.

Die akute myeloïede leukemie-afgeleide lyn THP-1 is 'n aantreklike lyn vir selsiklusstudies omdat selherwinning via verpilling die uitdagings van oes van aanhegting tot 'n matriks vermy. Ons het dus beide die robuustheid van sinchronie in hierdie lyn beoordeel (figuur 7a,c, d elektroniese aanvullende materiaal, figuur S3) en die gedrag van kenmerkende selsiklusmerkers as 'n populasie 'n gesinchroniseerde kultuur oorgedra het (figuur 7a,c). Soos aangedui vir hTERT-RPE1-selle in figuur 3, het merkers geossilleer met hul kenmerkende periodisiteite, alles teen 'n stadiger tempo, in weerspieëling van die langer, 30 uur eerste selsiklus van THP1-selle (figuur 7)b vergelyk hierdie profiel met die 22 uur eerste siklus van hTERT-RPE1-selle, figuur 2a).

Figuur 7. Nut van THP1-suspensiesellyn vir selsiklusanalise. THP1-selle is gegroei tot ongeveer 4 × 10 5 selle ml -1 in RPMI (+10% serum), geïsoleer deur ligte sentrifugering by 300g vir 3 min, voor hersuspensie in RPMI by 'n konsentrasie van 1 × 10 5 selle ml -1 in 10 cm-skottels. Twaalf uur later is 150 nM palbociclib vir 24 uur bygevoeg voordat selle deur sentrifugering by 300 geïsoleer is.g vir 3 minute en weer in RPMI hersuspendeer. Monsters (een 10 cm skottel per monster) is elke 2 uur geneem om die propidiumjodied FACS profiele in 12 uur groepe te genereer (a) om die fluktuasies in 2 N DNA-inhoud in die populasie te meet (c), terwyl monsterneming geneem word om die aangeduide merkers elke 2 uur deur westelike klad te monitor (b). Die nommers langs die plotte in (a) dui ure sedert vrystelling aan met U wat 'n onbehandelde kontrolepopulasie aandui. Hierdie ontleding van selsiklusmonsters deur western klad getoon in ac is drie keer gedoen. (d) Selle gegroei soos in (a) met die uitsondering dat monsterneming van 12 uur groepe uitgebrei is oor 'n 48 uur vrystellingsperiode van dieselfde populasie selle. Vir hierdie bondel selle is monsters slegs verwerk vir PI FACs analise van DNA inhoud om die plot van die frekwensie van 2 N selle wat in die paneel vertoon word, te genereer. Monsters vir die 0–12 (gevulde sirkels), 14–24 (oop vierkante), 24–36 (gevulde sirkels) en 36–48 (oop vierkante) is parallel geneem uit subpopulasies waarby die palbociclib gevoeg is met verspringende tussenposes . Die propidiumjodied FAC's plot waaruit die data in (d) afgelei word, is in elektroniese aanvullende materiaal, figuur S3. Hierdie ontleding van 'n 48 uur progressie van THP1 is een keer gedoen. Let daarop dat die tyd wat dit neem vir THP1-selle om die eerste selsiklus te vervoer, onder hierdie toestande, 32 uur is.

3.5. Inhibeerder-skemerkelkies pas by die doeltreffendheid van enkelmiddel-sinchronisasie

Buite-teiken inhibisie is 'n bekommernis vir die interpretasie van fenotipes wat voortspruit uit chemiese versteurings. Met die doel om die buite-teiken-impakte van elke individuele inhibeerder [68] te verminder, het ons gevra of 'n skemerkelkie van al drie inhibeerders so effektief soos enkelmiddel sou wees? Ons het 'n mengsel van een derde van die mees effektiewe konsentrasie vir elke individuele geneesmiddel vir elke individuele geneesmiddel vir elke sellyn (soos aangedui in die figuurlegende) gebruik om die vlak van selsiklusarres en vrystelling te toets. Dit is bemoedigend dat alle lyne robuuste arrestasie en doeltreffende vrylating gegee het (figuur 8).

Figuur 8. Cocktails ondersteun doeltreffende arrestasie en vrylating in vier responsiewe lyne. THP1 en H1299 is in RPMI (+10% serum) gekweek. hTERT-RPE1 en A549 is in DMEM (+10% serum) ingegroei. Aaneenlopende sellyne is gegroei tot ongeveer 1.5 × 10 4 selle cm -2 voordat hulle getripsiniseer is en teen 4.4 × 10 3 cm -2 in 10 cm-skottels uitgeplaat is. Die suspensielyn THP1 is gegroei tot ongeveer 4 × 10 5 ml −1 en gesentrifugeer by 300g vir 3 min voordat dit geplateer word by 1 × 10 5 ml −1 in 10 cm-skottels. Vier 10 cm-skottels is vir elke sellyn gesaai. Ses uur later is twee skottelgoed vir elke lyn gelaat as die onbehandelde kontrole, terwyl die aangeduide skemerkelkie 33 nM abemaciclib + 33 nM palbociclib + 300 nM ribociclib vir THP1 en H1299, 33 nM abemaciclib + 33 nM abemaciclib + 33 nM palbociclib + 5bocicn vir Abemaciclib + 33 nM palbociclib vir THP1 en H1299 en 33 nM abemaciclib + 33 nM palbociclib + 167 nM ribociclib vir hTERT-RPE1 is by die ander gevoeg. Vier-en-twintig uur later is een skottel vir elke toestand vasgemaak vir kleuring, terwyl die medium in die oorblywende skottel vervang is met medium wat 330 nM nokodasool bevat. Media-uitruiling vir A549, H1299 en hTERT-RPE1 is bereik deur aspirasie, terwyl die mediaskakelaar vir die THP1 bereik is deur ligte sentrifugering by 300g vir 3 min gevolg deur hersuspensie in die nokodasool-bevattende medium. Vier-en-twintig uur later is hierdie drie nokodasoolmonsters vasgestel en verwerk vir propidiumjodied FACs-analise saam met die monsters wat 24 uur vroeër vasgestel is. Die proporsie van die populasie wat 'n 2 N DNA-inhoud gehad het, is uit die propidiumjodied FACs-profiele bereken en in die panele geplot. Die inhibeerderskemerkelkie-gestopte monsters van die eerste 24 uur-inkubasie word in grys getoon terwyl die daaropvolgende nokodasool-arrestasie-profiele in blou is. Monsters wat met die inhibeerder-skemerkelkie behandel is, word deur C aangedui, terwyl die onbehandelde populasie deur U. Elke plot verteenwoordig die gemiddeld van ten minste drie biologiese herhalings. Die foutstawe verteenwoordig 1 × s.d.

3.6. γ-H2AX-kleuring openbaar minimale DNA-skade in palbociclib-induksie-sinchronie

'n Groot beperking van die wyd gebruikte 'dubbeltimidienblok'-benadering is die ophoping van DNA-skade tydens die vroeë S-fase arrestasie [28]. Hierdie skade spruit waarskynlik voort uit die ineenstorting van, en pogings om te herstel, die DNA-replikasievurke wat tot stilstand gekom het omdat nukleotiedvoorsiening gekompromitteer is [27]. Die skade wat opgedoen is, sal waarskynlik verantwoordelik wees vir die abnormale anafase-profiele in die afdelings na vrystelling van timidienblok [29].

Ons het dus die ophoping van 'n merker van DNA-dubbelstring-breuke, foci van fosforilering van γ -H2AX by serine 139, om die vlak van skade tydens palbociclib arrestasie en die daaropvolgende siklus na vrylating te bepaal. Aangesien hierdie brandpunte natuurlik tydens S-fase vorm, wanneer replikasievurke dubbelstring-breuke genereer, het ons selle teengekleur om diegene te identifiseer wat DNA-replikasie ondergaan in die uur voor monsterneming deur 10 µM van die nukleotied 5-etyniel-2'-deoksiuridien (EdU) by te voeg. 1 uur voor verwerking van elke monster. Alle selle wat met hierdie 10 µM EdU-puls gekleur is, sal DNA aktief repliseer in die uur voor fiksasie. Dit het ons in staat gestel om EdU-positiewe selle met γ-H2AX-fokuspunte, waarin ons aanneem dat die brandpunte 'n gevolg van DNA-replikasie is, te onderskei van dié met geen EDU-kleuring nie, waarin ons aanvaar dat die brandpunte 'n aanduiding is van plekke van herstel van DNA-skade . Ons het 'n sel as positief vir γ-H2AX foci getel wanneer immunofluoressensiekleuring meer as twee brandpunte in 'n kern geopenbaar het. Om die insig in die tydsberekening van S-fase te konsolideer uit die assessering van totale DNS-inhoud regdeur die populasie (figuur 9a,b), het ons vordering deur die S-fase gemonitor deur die kumulatiewe inkorporering van EdU in die DNA te kwantifiseer na die byvoeging van die laer konsentrasie van 1 µM EdU ten tyde van vrystelling om te volhard deur die eksperiment en etiket van alle DNA wat na die vrystelling gesintetiseer is. S-fase was grootliks voltooi teen 16 uur na vrystelling van 150 nM palbocilib (figuur 9c).

Figuur 9. γ-H2AX foci geassosieer met DNA replikasie in hTERT-RPE1 selle. hTERT-RPE1-selle is gegroei tot ongeveer 1.5 × 10 4 selle cm -2 in DMEM (+10% serum), getripsiniseer en geplateer teen 4.4 × 10 3 cm -2 in 10 cm-skottels. Drie 10 cm-skottels is vir elke tydpunt uitgeplaat, een vir propidiumjodiedkleuring (a,b), een vir kumulatatiewe EdU-inkorporering en een met dekstrokies vir immunofluoressensie. Twaalf uur later is 150 nM palbociclib bygevoeg. Vier-en-twintig uur later is selle twee keer gewas voor inkubasie in voorafverwarmde medium wat geen palbociclib bevat het nie. Op hierdie stadium is een derde van die skottelgoed sonder EdU-byvoeging gelaat, 1 µM EdU is by een derde van die skottelgoed gevoeg ten tyde van vrystelling van palbociclib-arres, om die kumulatiewe ophoping van hierdie merker van DNA-replikasie (dws die mate) te monitor van S-fase progressie by enige gegewe punt). In die skottelgoed wat dekstrokies bevat, is 10 µM EdU by elke skottel gevoeg net 1 uur voordat hierdie monsters vasgemaak is, om selle te identifiseer wat hoogs waarskynlik aktief gerepliseer het ten tyde van fiksasie. Die selle met geen EDU-behandeling is met propidiumjodied gekleur om DNA-inhoud te monitor (a) wat gebruik is om die waarde vir die proporsie van die populasie met 2 N DNA-inhoud te bereken (b), naas die proporsie van die bevolking wat die EDU op enige tydstip geïnkorporeer het (c). Die monsters van die populasie wat aan die 1 uur 10 µM EdU-pulse onderwerp is, is teengekleur met γ-H2AX-teenliggaampies (d, e). Die nommers langs die plotte in (a) dui ure sedert vrystelling aan, met U wat 'n onbehandelde kontrolepopulasie aandui. (d) Plotte toon die frekwensie van selle met kleuring van meer as twee γ-H2AX brandpunte (ligte vulling), EdU (tussenvulling) of daardie selle positief vir beide merkers (swart). (e) Fokus op die γ-H2AX-positiewe selle. Die plotte toon die volgende op die aangeduide tye na palbociclib-verwydering: die proporsie van die hele populasie wat positief kleur vir γ-H2AX alleen (swart, dws beskadigde selle, wat onwaarskynlik in S-fase sal wees ten tyde van fiksasie), of vir beide γ-H2AX en EdU (grys, selle in S-fase ten tyde van fiksasie). Vir elke tydpunt is ten minste 200 selle getel om elke eienskap as 'n proporsie van die totaal getel te kry. Die twee populasies wat parallel gemonster is na verspringende palbociclib-byvoeging word onderskei deur grys en rooi in (a), geslote sirkels en oop blokkies in (b,c). Hierdie eksperiment is drie keer herhaal met die soortgelyke uitkomste elke keer, maar die fyner kinetika van die sinchronie plotte het verskil en dit was dus nie gepas om die datastelle te kombineer nie.

Figuur 9d toon plotte van 'n populasie van hTERT-RPE1-selle wat gesinchroniseer is deur palbociclib arrestasie/vrystelling. Die frekwensie van selle wat die EdU-puls (donkergrys skakering) inkorporeer, dié wat meer as 2 γ-H2AX-fokuspunte (liggrys skakering) toon en dié wat kleuring met albei (swart) toon, word aangedui. Vir die plotte in figuur 9e, het ons slegs selle wat γ-H2AX-fokuspunte bevat, aangeteken. Die gedeelte selle in die bevolking met brandpunte, maar geen EDU is swart geskakeer nie. Daarteenoor word selle S-fase selle wat positief gekleur het vir EdU-inkorporering verteenwoordig deur grys skakering (figuur 9)e).

Hierdie plotte in figuur 9e wys dat die oorgrote meerderheid γ-H2AX-positiewe selle dié is wat besig is om hul DNA te repliseer. Baie min selle in die populasie het die DNA-skademerker gehad, maar geen EdU-kleuring nie. Verder, selle wat net S-fase geïnisieer het, het moontlik nie waarneembare vlakke van die EdU-nukleotiedpuls ingesluit nie, alhoewel hulle γ-H2AX-fokuspunte sal hê wat met replikasievurke geassosieer word. Gevolglik sal die assessering deur 'n positiewe inkorporering van die EdU-pulsetiket 'n beskeie onderskatting van S-faseselle te gee. As dit in ag geneem word, en die feit dat baie selle wat die EdU-puls ingesluit het, nie enige γ -H2AX brandpunte (figuur 9d), wil dit voorkom asof minimale DNA-skade met palbociclib-induksie-sinchronisasie gepaard gaan (figuur 9d,e).

Aangesien ons ongepubliseerde eksperimente die wyd gedeelde siening bevestig het dat hTERT-RPE1-selle ongevoelig is vir sinchronisasie met timidien (data nie getoon nie), het ons H1299 gebruik om die vlakke van DNA-skade wat tydens palbociclib-induksiesinchronie ontstaan ​​​​het en dit wat ophoop by die selsiklus-stilstand direk te vergelyk en vrystelling na verbygaande byvoeging van 2 mM timidien tot dieselfde beginpopulasie (figuur 10 elektroniese aanvullende materiaal, figuur S4). Alhoewel die graad van sinchronie wat bereik word deur palbociclib arrestasie vrystelling nie so hoog is in H1299 soos in hTERT-RPE1 nie, was die resultate duidelik.

Figuur 10. DNA-skade tydens arrestasie en deurgaans vrystelling in timidien maar nie palbociclib gesinchroniseerde H1299 selle nie. H1299-selle is gegroei tot 1.5 × 10 4 selle cm -2 in RPMI (+10% serum), getripsiniseer en uitgeplaat teen 4.4 × 10 3 cm -2 in 10 cm-skottels. Twaalf uur later, óf 150 nM palbociclib (ac) of 2 mM timidien (df) is bygevoeg, soos aangedui. Twee 10 cm-skottels is vir elke toestand en elke tydpunt gebruik, een vir FACS-analise en een wat dekstrokies vir immunofluoressensie bevat. Vier-en-twintig uur na inhibeerderbyvoeging is selle twee keer met voorafverwarmde medium gewas voor die byvoeging van voorafverwarmde medium wat geen inhibeerder bevat het nie. Monsters (die inhoud van een hele 10 cm skottel per monster) is met twee uurlikse tussenposes vir fiksasie verwyder. Tien mikromolêre EdU is 1 uur voor fiksering by elke bak gevoeg wat dekstrokies bevat, saam met verwerking vir gekombineerde propidiumjodiedkleuring om DNA-inhoud te monitor deur FAC's (elektroniese aanvullende materiaal, figuur S4) waaruit ons die plotte van 2 N DNA-inhoud afgelei het wat in (a). Die verwerking van die EdU-kleuring het die selle aan die lig gebring wat waarskynlik in S-fase sou wees ten tyde van fiksasie, terwyl die γ-H2AX-kleuring selle met dubbelstring-breuke in hul kern-DNS aan die lig gebring het wat kan ontstaan ​​as 'n gevolg van DNA-skade of aktiewe replikasie . (b,e) Plotte van die frekwensie van selle met kleuring van meer as twee γ-H2AX brandpunte (ligte vulling), EdU (tussenvulling) of daardie selle positief vir beide merkers (swart). (c,f) fokus slegs op die populasie van γ-H2AX-positiewe selle. Twee kategorieë word aangeteken: dié wat slegs ’n γ-H2AX-sein en geen EdU-sein (swart) toon nie en dié wat positief is vir beide γ-H2AX en EdU en dus hoogs waarskynlik in S-fase sal wees ten tyde van fiksasie (lig). Vir elke tydpunt is ten minste 200 selle getel om elke eienskap as 'n proporsie van die totaal getel te kry. Die twee populasies wat in parallel gemonster is na verspringende palbociclib-byvoeging word onderskei deur geslote sirkels en oop vierkante in (a,d). Hierdie eksperiment is drie keer herhaal met die soortgelyke uitkomste elke keer, maar die fyner kinetika van die sinchronie plotte het verskil en dit was dus nie gepas om die datastelle te kombineer nie.

In ooreenstemming met vorige verslae [28], en in skrille kontras met die minimale vlakke van DNA-skade met palbociclib-induksie-sinchronisasie (figuur 10)ac), sinchronisasie deur blootstelling aan 'n enkele dosis timidien het gelei tot aanhoudende γ-H2AX-positiewe tellings vir baie selle na vrystelling van die timidien-stilstandpunt in vroeë S-fase (figuur 10df). Dit is belangrik dat daar brandpunte in baie selle was wat nie die 1 uur EdU-pulsetiket opgeneem het ten tyde van fiksasie (die kenmerk van aktief repliserende selle) in selle lank nadat die blok vrygestel is nie (figuur 10).e,f). Hierdie data dui daarop dat 'n mate van skade wat by die arrestasiepunt opgehoop het, voortgeduur het gedurende die daaropvolgende vrylating, na die tydperk van replikasie. Die volharding van skade stem ooreen met vorige verslae van chromosomale afwykings tydens verdelings gesinchroniseer deur timidien-induksie-sinchronie [29].

Alhoewel ons nie vorme van DNA-skade kan uitsluit wat nie γ-H2AX-fokuspunte genereer nie, blyk dit nie dat palbociclib-induksie-sinchronisasie van selsiklus-progressie genoomintegriteit in dieselfde mate as timidien-gebaseerde sinchronisasie in gevaar stel nie.

3.7. Bevoegdheid om vry te laat word oor 72 uur gehandhaaf

Verwydering, induksie of vervanging van 'n molekule van belang gee groot insig in die funksie daarvan. Wanneer die manipulasie in gesinchroniseerde kulture gedoen word, is dit noodsaaklik dat die manipulasie nie in die voorafgaande siklus plaasvind nie, anders kan sommige van die fenotipe wat waargeneem word 'n indirekte gevolg wees van irrelevante skade wat in die voorafgaande siklus opgeloop het soos selle die blokpunt nader. Alhoewel dit onmoontlik is om te vermy in seleksie-sinchronisasie, bly dit 'n groot uitdaging in baie vorme van induksie-sinchronisasie wat staatmaak op arrestasie binne die siklus. Een groot aantrekkingskrag om selsiklus-vordering te stop op 'n punt wanneer een siklus voltooi is en die volgende nog moet begin, is dat die impak van enige molekulêre manipulasie van die gearresteerde populasie 'n fenotipe sal genereer wat 'n direkte gevolg is van hierdie manipulasie by vordering deur die daaropvolgende siklus. Geen van die gevolge sal toegeskryf word aan probleme met die voltooiing van die siklus wat lei tot die blok waaruit die selle vrygestel word nie.

Ons het dus die bevoegdheid vergelyk om terug te keer na siklus na Cdk4/6-inhibisie vir 24, 48 en 72 uur. Loodseksperimente het vasgestel dat die vermoë om die arrestasie te hou, of vrylating na arrestasie, tussen sellyne gewissel het en daarom het ons verskillende palbociclib-konsentrasies gekies om die bevoegdheid om vry te laat na uitgerekte arrestasie streng te kwantifiseer (figuur 11). Die doeltreffendheid van sinchronisasie is geassesseer deur die byvoeging van die aangeduide konsentrasie palbociclib by selle 6 uur nadat hulle van 'n subkonfluente populasie verdeel is en inkubasie vir die aangeduide tye voor monsterneming van een helfte van die populasie vir FACs analise van DNA inhoud (grys). Die palbociclib-bevattende groeimedia vir die ander helfte van die populasie is vervang met medium wat 330 nM nokodasool bevat voordat hierdie populasie vir FACs-analise 'n verdere 24 uur later (blou) gemonster is. Die nokodasool-inkubasie het die selle wat uit die G1-blok vrygestel is, vasgevang in die volgende mitose as gevolg van aktivering van die spilsamestelling-kontrolepunt (SAC) [71]. Terwyl die vermoë om die G1-arrestasie te handhaaf in verskillende grade in die verskillende lyne afgeneem het, met hTERT-RPE1 wat die vaardigste was om arrestasie te handhaaf, het alle lyne die arrestasie verlaat om die aantal 2 N-selle na 24 uur in nokodasool te verminder (figuur 11) ).

Figuur 11. Aansienlike herstel van verlengde palbociclib-opgelegde selsiklus arrestasie. THP1 en H1299 is in RPMI (+10% serum) gekweek, en hTERT RPE1 en A549 is in DMEM (+10% serum) gekweek. Aaneenlopende lyne is gegroei tot ongeveer 1.5 × 10 4 selle cm -2, geïsoleer deur tripsienvertering en geplateer teen 4.4 × 10 3 selle cm -2 in 10 cm-skottels. Die suspensiesellyn THP1 is gegroei tot ongeveer 4 × 10 5 selle ml -1, geïsoleer deur sentrifugering by 300g vir 3 min en uitgeplaat teen 1 × 10 5 ml −1 in 10 cm-skottels. Agtien 10 cm-skottels is vir elke sellyn uitgeplaat. Ses uur later is skottelgoed óf met die aangeduide konsentrasie palbociclib behandel óf onbehandel gelaat. Met die aangeduide tydintervalle is een plaat vir elke toestand vir propidiumjodied FACs analise verwerk, terwyl 'n ander in palbociclib-vrye medium wat 330 nM nokodasool bevat, vir 'n verdere 24 uur geïnkubeer is voordat dit ook vir propidiumjodied FACs analise verwerk is. Die proporsie van die populasie wat 'n 2 N DNA-inhoud gehad het, is uit die FACs-profiele bereken en in die panele geplot.Die monsters na die inkubasie vir die tyd wat onder die plot getoon word, word in grys getoon, terwyl die gepaarde monster selle van hierdie populasie wat vrygestel is van die palbociclib arrestasie deur medium vervanging met nokodasool medium voor fiksasie 24 uur later in blou getoon word. Elke plot verteenwoordig die gemiddelde van ten minste drie biologiese herhalings. Die foutstawe verteenwoordig 1 × s.d.

4. Bespreking

Ons ondersoek na die potensiaal van Cdk4/6-inhibisie as 'n nuwe benadering tot induksie-sinchronie onthul 'n hoogs effektiewe benadering tot sinchronisasie van selsiklus-progressie deur 'n populasie van óf aanhangende, óf suspensie, menslike sellyne. Ons glo dat 'n aantal eienskappe dit 'n waardevolle toevoeging tot die breë portefeulje van selsiklussinchronisasietegnologie maak.

Die vrystelling van palbociclib-opgelegde selsiklus-arrestasie by die natuurlike besluitnemingspunt vir selle, die beperkingspunt, word nie geassosieer met veranderinge in groeitempo's of tempo's van progressie deur die siklus waarin hulle vrygestel word nie [36,72]. Eerder Cdk4/6-Cyclin D-aktiwiteit blyk groottebeheer te stel [36,72]. Konseptueel resoneer dit met die oorspronklike definisie van die beperkingspunt, as 'n koersbeperkende poort waarop verskeie regulatoriese stelsels konvergeer om deurgang deur die poort te reguleer na toewyding tot verdeling [47].

'n Tweede aantrekkingskrag van hierdie benadering lê in die oënskynlik beperkte impak op genoomintegriteit. Alhoewel die dubbeltimidienblokbenadering al meer as 50 jaar oorheers het, duur die DNS-skade wat met die arrestasie gepaardgaan voort deur die vrystelling (figuur 10) [28,29]. Hierdie kumulatiewe skade beperk die bruikbaarheid van hierdie benadering vir die studie in verskeie velde, insluitend DNS-replikasie, DNS-herstel en chromatien. Alhoewel die beoordeling van genoomintegriteit deur die verkryging van γ-H2AX-fokuspunte nie 'n volledige beoordeling van skade is nie, dui ons data daarop dat Cdk4/6i-induksiesinchronie nie gepaard gaan met die skade wat ontstaan ​​​​na vrystelling van timidien [29]. Uitgebreide ontledings van mitotiese progressie na palbociclib-induksie-sinchronisasie het geen teken getoon van enige van die chromosomale abnormaliteite wat timidien-induksie-sinchronisasie vergesel nie [73] (Jon Pines en Mark Jackman 2020, persoonlike kommunikasie). Cdk4/6i induksie-sinchronisasie het dus die potensiaal om 'n aantal voorheen onoplosbare vrae oop te maak om in sinchrone kulture te bestudeer.

Miskien is die belangrikste aantrekkingskrag van hierdie benadering dat selle buite die selsiklus in volle serum vir baie uitgerekte tydskale gestop kan bly, terwyl die bevoegdheid behou word om terug te keer na 'n gesinchroniseerde siklus. Hierdie stase beteken dat 'n molekule van belang heeltemal uitgeput kan word, terwyl selle uit die siklus is, sonder om enige impak op die vordering deur die vorige seldelingsiklus te hê. As 'n mutante weergawe van hierdie teiken gelyktydig geïnduseer word, sou dit hoogs gerigte vrae oor proteïenfunksie ondersteun wanneer die selle vrygestel word om die daaropvolgende siklus sinchronies te vervoer. Die studie van regulering van sentrioolbiogenese deur Viol et al. [70] verskaf 'n dwingende illustrasie van die krag van proteïen-induksie in 'n palbociclib arrestasie voor vrylating.

Alhoewel die voordele van hierdie benadering besonder aantreklik is, soos met alle benaderings tot siklussinchronisasie, sal nadele onvermydelik na vore kom namate hierdie protokolle meer algemeen aanvaar word. Alhoewel dit blyk dat selmassa-akkumulasie by die arrestasiepunt nie 'n impak het op selsikluskinetika na vrystelling nie [36], dui studies in modelorganismes daarop dat daar waarskynlik op 'n sekere punt na toewyding aanpassing by gemodifiseerde groottebeheer sal wees [74]. Onlangse studies dui daarop dat aanpassing onwaarskynlik sal plaasvind na die tweede siklus na vrylating [72]. Die benadering is ook nie doeltreffend in baie reëls wanneer die vlak van beheer wat deur Cdk4/6 teenoor Cdk2 uitgeoefen word, meer gekantel word ten gunste van Cdk2-beheer [13,20,22,48,54,61–63,72,75–79 ].

Wanneer 'n spesifieke lyn ongevoelig is vir Cdk4/6-induksie-sinchronisasie, kan verskeie benaderings die lyn oorskakel om sensitiwiteit vir Cdk4/6-inhibisie te verleen. Vir lyne waarin Cdk4/6-inhibisie alleen min impak het, kan die vermindering van vloed deur na Cdk4/6 Cyclin D deur die vermindering van serum, of die inhibeer van die stroomaf MAP-kinase-paaie translasie in gedrang bring om Cyclin D-vlakke te verminder en die weegskaal te laat verander om selsiklus-stilstand op te stel. deur palbociclib, of Cdk2-inhibisie [13,59,72,80]. Die selsiklus arrestasie in HCT116 wanneer Trametinib palbociclib komplementeer, is 'n goeie voorbeeld van hierdie sinergie [81]. Die onlangse onthulling dat die Cdk4/6-inhibeerders die onaktiewe, eerder as aktiewe Cdk4- en Cdk6-komplekse teiken, dui op 'n ander opsie vir vuurvaste lyne wanneer weerstand ontstaan ​​​​uit groter vertroue op Cdk6, eerder as Cdk4 [54]. Cdk4/6-remmers stel die arrestasie op omdat hulle Cdk4 en Cdk4-CyclinD weg van die Hsp90-chaperone-stelsel sekwestreer om die aantal molekules wat 'n aktiewe kompleks met p27 kan vorm te verminder [54,67,82]. Die laer affiniteit van Cdk6 vir die Hsp90-chaperoonkompleks stel dit in staat om makliker in aktiewe trimere saam te voeg wat geen affiniteit vir die inhibeerders het as wat Cdk4 het nie. Dit het die voorstel laat ontstaan ​​dat die oorheersing van Cdk6-Cyclin D-p27 trimere p27 uit die poele van Cdk2 uitput om Cdk2-aktiwiteite te verhoog en palbociclib-weerstand te verleen in kankers waarin Cdk6-uitdrukking verhoog is [67,83,84]. Dus sal sellyne wat op Cdk6 eerder as Cdk4 staatmaak om deurgang deur die poort na die siklus te dryf, verminderde sensitiwiteit vir Cdk4/6-inhibeerders hê. In sulke reëls kan 'n Cdk6-spesifieke PROTAC die afhanklikheid van Cdk6 verminder om sensitiwiteit vir Cdk4/6-inhibisie op te lê en so sinchronisasie met die inhibeerders te ondersteun [85]. Ten slotte, omdat baie sellyne die vereiste vir Cdk4/6 sal omseil deur Cdk2 te ontgin om selle in siklus te dryf, behoort gedeeltelike inhibisie van Cdk2 in hierdie lyne [13,86-88] selle te sensitiseer vir Cdk4-inhibisie. Een uitdaging met hierdie benadering is die gepaardgaande risiko dat sterk Cdk2-inhibisie nie net 'n impak op DNA-replikasie in die voorafgaande siklus sal hê nie, maar ook op die regulering van mitotiese verbintenis omdat Cdk2-Cyclin A direk gekoppel is aan regulering van Wee1 en die G2/M oorgang [13,89–91].

Gegewe die verskeidenheid maniere waarop weerstand teen Cdk4/6-inhibeerders ontstaan ​​[48], is dit miskien die maklikste om empiries te toets of 'n lyn vatbaar sal wees vir Cdk4/6i-induksie-sinchronie. Een van twee eenvoudige assesserings sal 'n lyn identifiseer as Cdk4/6i-induksie-sinchronie-aanpasbaar. Die arrestasie/vrystelling in nokodasool wat ons in figure 1 en 4–6 wys, sal die bevoegdheid van die meeste lyne aandui om deur Cdk4/6i-induksiesinchronie te sinchroniseer: 'n lyn sal sinchroniseer as 'n populasie 2 N DNA-inhoud ophoop een verdubbeling keer na inhibeerderbyvoeging, voor oorskakeling na 4 N DNA-inhoud 'n verdere verdubbelingstyd na vrystelling in nokodasool. Hierdie toets maak egter staat op die sterkte van die SAC [71] wat so swak kan wees in sommige lyne dat dit nie daarin slaag om 'n lang selsiklus-stilstand met 4 N DNA-inhoud op te lê nie [92]. Die tweede benadering is onafhanklik van SAC-integriteit. Selle word vrygestel van palbociclib in 1 µM EdU voordat toegang tot die volgende siklus geblokkeer word deur herbyvoeging van palbociclib 12 uur na vrystelling. As EdU in die meeste genome in 'n populasie geïnkorporeer word wat selsiklus-progressie met 'n 2 N DNA-inhoud in reaksie op die tweede dosis palbociclib gestop het, dan sal die lyn bevoeg wees vir sinchronisasie.

Ons manipulasies van seldigtheid en kultuurgeskiedenis beklemtoon die belangrikheid van groeitoestand en kultuurgeskiedenis wanneer die sinchronisasieprotokol aangepas word om maksimum sinchronie in die gekose lyn te verkry. Die plastisiteit van die G1-beheer van toewyding aan die siklus is goed gedokumenteer. Afsonderlike transkripsie- en proteomiese veranderinge gaan gepaard met die uitgang van die selliklus wanneer 'n oorskakeling van die siklus veroorsaak word deur kontakinhibisie, serumhonger of inhibisie van DNA-replikasie, sodat 'n sel se geskiedenis die konfigurasie van sein in selle wat aktief siklus en diegene wat terugkeer van rus verander, verander [19 –22,59,72,80]. Dus, 'n onlangse geskiedenis van kontakinhibisie verminder die doeltreffendheid van sinchronisasie by vrystelling van palbociclib (vergelyk die profiel in figuur 2b van selle wat in subkonfluente kultuur gehou is voor manipulasie, met dié as figuur 2d wat dieselfde beginpopulasie van selle toon wat 'n kort tydjie van kontakinhibisie ervaar het). Sulke geheue van kontakinhibisie sal waarskynlik wye impak hê, soos geïllustreer deur die manier waarop dit die laai van replikasiefaktore by oorsprong in hTERT-RPE1-selle verander [93]. Gevolglik moet sorg uitgeoefen word om te verseker dat 'n bevolking se pad na sinchronisasie vrylik verdeeld is en so 'gesond' as wat dit kan wees.

Terwyl ons die nut van palbociclib-induksie-sinchronie uiteensit in die studie van selsiklusbeheer en uitvoering, kan die onderbreking van die siklus by die beperkingspunt aansienlike voordeel in ander velde hê, soos die sinchronisering van die vorming van die primêre silium deur serumuitputting van Cdk4/6i arrestasie, of in die bestudering van differensiasie in sisteme, soos hematopoese, waar 'n pouse in G1 deurslaggewend kan wees vir differensiasie.

Ten slotte, die suksesvolle soeke om dwelms te genereer om proliferasie in die kliniek te beheer [65] het gereedskap gegenereer wat van groot nut sal wees in studies van die funksionele en biochemiese veranderinge wat gepaard gaan met en die vordering van selliklus dryf.

5. Gevolgtrekking

Cdk4/6 induksie sinchronie is 'n eenvoudige, reproduceerbare benadering wat biochemiese ondervraging, induksie, uitputting en vervanging van molekules in enige skaal van sellynkultuur sal ondersteun. Eenvoudige toetse kan die bevoegdheid van hierdie benadering bepaal om selliklus-vordering in 'n nuwe lyn te sinchroniseer. Ons verwag dat 'n aantal benaderings 'n weerbarstige lyn kan omskep in 'n Cdk4/6i-sinchronisasie-voldoenende lyn.


BESPREKING

Verhoging van intrasellulêre cAMP lei tot groei-inhibisie in 'n aantal seltipes insluitend limfosiete, en hierdie groei-inhibisie is gekoppel aan G1 arrestasie (Blomhoff et al.,1987, 1988 Christoffersen et al., 1994 Dugan et al., 1999). Ons het voorheen getoon dat cAMP lei tot 'n verbygaande akkumulasie van Reh-selle in G2, gevolg deur permanente arrestasie van selle in G1-fase van die selsiklus (Blomhoff et al., 1988). Hier verskaf ons bewyse vir 'n inhiberende effek van cAMP op S-fase progressie. Ons het getoon dat verhoging van cAMP DNA-sintese inhibeer en die selle kortstondig in S-fase stop. Hierdie cAMP-geïnduseerde S-fase arrestasie vereis Rb en ​​p21 Cip1 proteïene en korreleer nou met dissosiasie van PCNA vanaf chromatien.

Ons waarneming dat cAMP-geïnduseerde inhibisie van DNA-sintese geassosieer is met defosforilering van Rb in S-faseselle, het die vereiste van Rb vir inhibisie van DNA-sintese deur cAMP voorgestel. Inderdaad Rb -/- selle was gedeeltelik gebrekkig in die stop van DNA sintese na verhoging van cAMP vlakke, en ektopiese uitdrukking van wt Rb in hierdie selle het die vermoë van cAMP herstel om DNA sintese te inhibeer. In S-fase word fosforilering en inaktivering van Rb bereik deur die werking van Cdk2 in kompleks met siklien E of siklien A (Mittnacht, 1998). Dus, die waargenome cAMP-gemedieerde inhibisie van Cdk2-siklien aktiwiteit kan beskou word as die meganisme wat verantwoordelik is vir defosforilering van Rb in S fase selle. Die cAMP-geïnduseerde vermindering in Cdk2-siklien aktiwiteit het gekorreleer met induksie van p21 Cip1 uitdrukking en 'n toename in Cdk2-cyclin-p21 Cip1 komplekse, wat 'n model ondersteun waarin verhoging van intrasellulêre cAMP lei tot induksie van p21 Cip1 proteïen uitdrukking. p21 Cip1 bind dan aan Cdk2-siklienkomplekse en verswak die Cdk2-geassosieerde kinase-aktiwiteit. Vermindering in Cdk2 kinase aktiwiteit lei op sy beurt tot uitdrukking van gedefosforileerde Rb en ​​inhibisie van DNA replikasie. Die waarneming dat p21 Cip1 -/- selle het nie daarin geslaag om 1) Cdk2-siklienkinase-aktiwiteit te inhibeer, 2) Rb te defosforileer, en 3) DNA-sintese af te breek na blootstelling aan forskolien, tesame met die bevinding dat cAMP-induseerbare uitdrukking van eksogene p21 Cip1 in p21 Cip1 -/- 3T3-selle het hul vermoë herstel om Rb te defosforileer en DNA-replikasie te inhibeer, ondersteun hierdie model sterk.

Ons het voorheen waargeneem dat behandeling van Reh-selle met forskolin die uitdrukking van p21 Cip1 (binne 2 uur) en p27 Kip1 (binne 4-8 uur) proteïene induseer en lei tot defosforilering van Rb (Christoffersen) et al., 1994 Naderi en Blomhoff, 1999 Gutzkow et al., 2002). In hierdie studie het ons gevind dat blootstelling van Reh-selle aan forskolien gelei het tot 'n toename in uitdrukking van p21 Cip1 en gedefosforileerde Rb, maar geen effek op die vlakke van p27 Kip1-proteïen gehad het nie. Dit is belangrik om daarop te let dat ons hier Aph-gesinchroniseerde kulture van selle gebruik het om spesifiek die effek van forskolien op selle in die S-fase van die selsiklus te ontleed. Daarteenoor, in ons vorige studies (Naderi en Blomhoff, 1999 Gutzkow et al., 2002), het ons die effek van forskolien op asinchrone kulture van Reh-selle ondersoek, waarin selle in alle fases van die selsiklus teenwoordig is. Saamgevat dui ons resultate aan dat cAMP-gemedieerde induksie van p27 Kip1 geassosieer word met G1-arrestasie en nie met inhibisie van DNA-replikasie nie.

Beide Rb (Kou et al., 1998 Knudsen et al., 1998 Saudan et al., 2000) en p21 Cip1 (Ogryzko et al., 1997 Niculescu et al., 1998) was voorheen betrokke by regulering van DNA-replikasie. Die meganisme waardeur Rb DNA-sintese inhibeer is tans onbekend. Daar is onlangs getoon dat aktivering van Rb DNA-replikasie deur twee kineties en funksioneel verskillende meganismes inhibeer, 'n akute pad wat PCNA-lading op chromatien teiken en 'n meer stabiele arrestasieprogram wat 'n volgehoue ​​verswakking van die proteïenvlakke van verskeie E2F-teikengene behels wat by DNA betrokke is. replikasie (Angus et al., 2004). Ontwrigting van PCNA-aktiwiteit wat deur Rb ontlok word, hang af van E2F-gemedieerde transkripsionele onderdrukking en die vermoë van Rb om die uitdrukking van siklien A te inhibeer is voorgestel as so 'n gebeurtenis (Sever-Chroneos et al., 2001 Angus et al., 2004). Soos hier gedemonstreer, is die cAMP-gemedieerde inhibisie van DNA-sintese afhanklik van Rb-funksie en korreleer met dissosiasie van PCNA vanaf chromatien. Dit kan dus voorgestel word dat cAMP Rb gebruik in sy vermoë om die PCNA funksie akuut te ontwrig en lei tot staking van DNA replikasie. Hierdie aanname voorspel dat Rb-gemedieerde transkripsie-onderdrukking bydra tot cAMP-geïnduseerde dissosiasie van PCNA vanaf chromatien en inhibisie van DNA-replikasie. Ons kan egter nie die moontlikheid formeel uitsluit dat cAMP DNA-replikasie inhibeer onafhanklik van die transkripsionele onderdrukkingsfunksie van Rb nie. Hierdie idee is gebaseer op twee lyne van bewyse: Eerstens vind Rb-defosforilering en inhibisie van DNA-sintese byna gelyktydig in forskolien-behandelde selle plaas. Tweedens inhibeer cAMP nie die uitdrukkings van siklien E en A in S-faseselle nie. Omdat siklien E en A bekende teikens van Rb is, dui hierdie waarneming daarop dat die vermoë van Rb om geentranskripsie te reguleer, verskillend is van die cAMP-gemedieerde inhibisie van DNA-replikasie. Dit is denkbaar dat Rb direk met PCNA-funksie kan inmeng om DNA-replikasie by die verlengingsfase te inhibeer. Ons data dat cAMP-gemedieerde defosforilering van Rb en ​​inhibisie van DNA-sintese saamgeval het met dissosiasie van PCNA van chromatien, stem ooreen met hierdie idee. Verdere ondersteuning vir hierdie idee word verskaf deur die bevinding dat cAMP nie daarin geslaag het om dissosiasie van PCNA van chromatien te veroorsaak en DNA-replikasie in Rb -/- selle. Inderdaad, die verskynsel van ontwrigting van PCNA-funksie en inhibisie van DNA-replikasie by die verlengingsfase is reeds voorheen gerapporteer. Daar is getoon dat aktivering van die S-fase-kontrolepunt deur DNA-skade replikasie-verlenging inhibeer en die assosiasie van PCNA met DNA-replikasie-fokuspunte verminder, 'n gebeurtenis wat blykbaar afhang van Rb-sein (Watanabe, 1974 Knudsen et al., 2000 Sever-Chroneos et al., 2001 Wang et al., 2004). Die presiese meganisme waardeur Rb inmeng met PCNA-funksie is onduidelik. 'n Potensiële insig in hoe Rb sy effek op PCNA uitoefen, kan egter verskaf word deur die verslag wat interaksie van Rb met replikasiefaktor C (RFC Pennaneach toon) et al., 2001). Hierdie studie het aangedui dat Rb met RFC in wisselwerking tree om selsiklus-arrestasie te veroorsaak en seloorlewing na DNA-skade te bevorder. Met inagneming van die funksie van RFC as die laaier van PCNA op DNA, is dit aanloklik om te spekuleer dat Rb assosiasie van PCNA met chromatien kan inhibeer deur sy interaksie met RFC en dus lei tot inhibisie van DNA replikasie. Verdere studies sal nodig wees om hierdie model te toets.

Resultate van 'n aantal studies dui op 'n rol van Rb in inhibisie van replikasie op die vlak van aanvang. Daar is byvoorbeeld berig dat Rb MCM7, 'n komponent van die voorreplikasiekompleks bind, en in vitro DNA-replikasie op 'n MCM7-afhanklike wyse inhibeer (Sterner et al., 1998). In DrosophilaDaar is getoon dat dDP–dE2F1–Rbf in kompleks met DmORC by die chorionoorsprong van replikasie replikasie-inisiasie by die chorion lokus beperk, onafhanklik van transkripsie (Bosco) et al., 2001). Verder, na bestraling van S-fase-gesinchroniseerde selle, is gerapporteer dat hipofosforileerde Rb na sekere chromosomale replikasie-inisiasieplekke gerig word, op of na die tyd wat hulle begin brand het, as deel van die proses waardeur Rb abnormale herreplikasie-aktiwiteit onderdruk (Avni) et al., 2003). Alhoewel die interaksie van Rb met proteïene by die replikasie oorsprong of die teenwoordigheid daarvan by die replikasie fokuspunte betwis is (Dimitrova en Berezney, 2002 Angus et al., 2004), kan ons nie die moontlikheid uitsluit dat Rb na defosforilering na replikasie-inisiasieplekke gewerf kan word op of na die tyd wat hulle begin brand het nie. Dit kan op sy beurt enige reeks stappe in inisiasie beheer, soos oorsprongherkenning, DNA-afwikkeling, of dit kan die oorskakeling van pol α-afhanklike primervorming na prosessiewe replikasie deur pol δ en PCNA te gebruik, en dus lei tot inhibisie van DNA replikasie.

Wanneer dit aan forskolien blootgestel word, Rb -/- selle het 'n onvolledige vermindering in S-fase arrestasie getoon in vergelyking met gew selle. In kontras, p21 Cip1 -/- selle was onreageer op die S-fase inhiberende effek van forskolien. Hierdie waarnemings dui daarop dat inhibisie van DNA replikasie deur cAMP gedeeltelik afhanklik is van Rb en ​​dui op 'n Rb-onafhanklike rol van p21 Cip1 in cAMP-gemedieerde inhibisie van DNA replikasie. Benewens binding aan Cdk-siklienkomplekse, assosieer p21 Cip1 ook met PCNA (Flores-Rozas et al., 1994).In vitro is getoon dat interaksie van p21 Cip1 met PCNA die RFC-gemedieerde laai van PCNA op DNA inhibeer en ook om binding van pol δ aan die PCNA-klem wat op DNA saamgestel is te voorkom (Waga) et al., 1994 Podust et al., 1995). Net so het 'n onlangse studie getoon dat, in vivo, direkte binding van p21 Cip1 aan chromatien-gebonde PCNA lei tot die verlies van interaksie met die katalitiese subeenheid van pol δ (Cazzalini) et al., 2003). Gebaseer op hierdie resultate, kan dit gepostuleer word dat p21 Cip1 bydra tot die cAMP-gemedieerde inhibisie van DNA-replikasie deur sy vermoë om direk met PCNA te reageer en sodoende die replikasiekompleksvorming wat PCNA, pol δ en RFC behels, af te skaf. Die moontlike rol van p21 Cip1, as 'n inhibeerder van Cdk-siklien komplekse, in verswakking van S-fase progressie moet ook aangespreek word. Verskeie verslae het voorgestel dat die negatiewe effek van p21 Cip1 op DNA-sintese hoofsaaklik staatmaak op sy vermoë om Cdk-siklien-afhanklike weë te inhibeer (Luo et al., 1995 Nakanishi et al.,1995a, 1995b Ogryzko et al., 1997). Boonop het 'n aantal studies getoon dat, benewens fosforilering van Rb, Cdk2-siklienkomplekse ook DNS-replikasie reguleer op 'n wyse wat blykbaar nie Rb-funksie vereis nie (Mimura en Takisawa, 1998 Zou en Stillman, 1998 Furstenthal et al., 2001). Een so 'n verslag het getoon dat inhibisie van Cdk2-cyclin A kinase die potensiaal het om DNA-replikasie negatief te reguleer deur verplasing van PCNA vanaf chromatien (Sever-Chroneos et al., 2001). Op grond van hierdie waarnemings en ons bevinding dat p21 Cip1-tekorte selle nie in staat was om PCNA-assosiasie met chromatien te ontwrig in reaksie op cAMP nie, stel ons voor dat die Rb-onafhanklike funksie van p21 Cip1 in cAMP-gemedieerde inhibisie van DNA-sintese kan spruit uit die vermoë daarvan om Cdk2-siklienaktiwiteit te verswak en sodoende tot ontwrigting van PCNA-binding aan chromatien te lei.

Samevattend stel ons voor dat cAMP DNA-replikasie inhibeer deur sy vermoë om die uitdrukking van p21 Cip1-proteïen te induseer en die aktiwiteit van Cdk2-siklienkinases te inhibeer (Figuur 8). Opheffing van Cdk2-siklienkinase aktiwiteit lei op sy beurt tot uitdrukking van hipofosforileerde, aktiewe vorm van Rb, wat lei tot ontwrigting van PCNA assosiasie met chromatien en dus inhibisie van DNA replikasie. Verder is die onvermoë van Rb -/- selle, in teenstelling met p21 Cip1 -/- selle, om die inhiberende effek van cAMP op assosiasie van PCNA met chromatien en DNA replikasie heeltemal te verlig, pleit vir 'n addisionele, Rb-onafhanklike pad waardeur p21 Cip1 PCNA aktiwiteit en DNA replikasie kan reguleer.

Figuur 8. Voorgestelde model vir die cAMP-gemedieerde inhibisie van DNA-replikasie. In S-fase selle veroorsaak verhoging van intrasellulêre vlakke van cAMP die uitdrukking van p21 Cip1 proteïen. Dit lei tot inhibisie van Cdk2-siklienkinase-aktiwiteit. Opheffing van Cdk2-siklienkinase aktiwiteit lei weer tot uitdrukking van hipofosforileerde, aktiewe vorm van Rb (pRb), wat lei tot ontwrigting van PCNA assosiasie met chromatien, en dus inhibisie van DNA sintese. Verder argumenteer data wat hier aangebied word vir 'n addisionele, Rb-onafhanklike pad waardeur p21 Cip1, moontlik via inhibisie van Cdk2-siklienkinase, PCNA-aktiwiteit en DNA-replikasie kan reguleer. Pre-Rc, voorreplikasie kompleks.

'n Aantal huidige kankerterapie-regimes maak staat op die gebruik van middels waarvan die sitotoksiese aktiwiteit afhang van DNA-replikasie. Ons waarneming dat verhoging van intrasellulêre cAMP DNA-replikasie inhibeer en apoptose blokkeer wat deur sulke S-fase-spesifieke antikankermiddels veroorsaak word, kan moontlike praktiese implikasies vir kankerterapie hê. Hierdie waarnemings voorspel dat toestande wat lei tot toename in intrasellulêre cAMP die doeltreffendheid van sulke middels teen tumorselle sal verminder. Dit is byvoorbeeld bekend dat limfosiete en makrofage na plekke van neoplasie aangetrek word (Witz, 2001). Op hierdie terreine stimuleer gewasse makrofage om 'n aantal regulatoriese molekules af te skei, insluitend PGE2 (Alleva et al., 1993 Brum-Fernandes et al., 1996 Elgert et al., 1998). Die meeste effekte van PGE2 word deur die PGE bemiddel2 reseptore wie se aktivering lei tot verhoging van intrasellulêre cAMP (Brum-Fernandes et al., 1996 Kiriyama et al., 1997). Dit kan dus gepostuleer word dat tumor-geïnduseerde afskeiding van PGE2 deur makrofage kan cAMP-vlakke binne tumorselle verhoog en hulle weerstandbiedend maak teen S-fase-spesifieke antitumormiddels. Gevolglik kan 'n kombinatoriese benadering, bestaande uit 'n S-fase-spesifieke antitumormiddel en cAMP-antagoniste, beskou word as 'n effektiewe regime om die sensitiwiteit van tumorselle vir sulke middels te verhoog.


Inhoud

In sy samestelling is deoksitimidien 'n nukleosied wat bestaan ​​uit deoksiribose ('n pentosesuiker) wat aan die pirimidienbasis timien gekoppel is.

Deoksitimidien kan gefosforileer word met een, twee of drie fosforsuurgroepe, wat dTMP (deoksiethymidien monoblhosfaat), dTDP of dTTP (vir die dek- en tri-fosfate, onderskeidelik).

Dit bestaan ​​in vaste vorm as klein wit kristalle of wit kristallyne poeier. Dit het 'n molekulêre gewig van 242.229 u en 'n smeltpunt van 185 °C. Die stabiliteit van deoksitimidien onder standaard temperatuur en druk (STP) is baie hoog.

Deoksitimidien is nie-giftig en as deel van een van die vier nukleosiede in DNS is dit 'n natuurlike verbinding wat in alle lewende organismes en DNS-virusse voorkom. In plaas van timidien, bevat RNA uridien (urasil verbind met ribose). Urasiel is chemies baie soortgelyk aan timien, wat ook bekend staan ​​as 5-metielurasil. Aangesien timiennukleotiede voorlopers van DNA is (maar nie RNA nie), word die voorvoegsel "deoksie" dikwels uitgelaat, dit wil sê, deoksitimidien word dikwels net timidien genoem.

Timidien word as 'n chemiese teratogeen gelys. [2]

Jododeoksuuridien is 'n radiosensibiliseerder en verhoog die hoeveelheid DNA-skade wat deur ioniserende bestraling ontvang word.

Radio-gemerkte timidien (TdR), soos getritieerde timidien (3 H-TdR), word algemeen in selproliferasietoetse gebruik. Die timidien word in verdeelde selle geïnkorporeer en die vlak van hierdie inkorporering, gemeet met 'n vloeistofscintillasieteller, is eweredig aan die hoeveelheid selproliferasie. Byvoorbeeld, limfosietproliferasie kan op hierdie manier gemeet word in limfoproliferatiewe versteurings.

Bromodeoxyuridine (BrdU) is nog 'n timidienanaloog wat dikwels gebruik word vir die opsporing van prolifererende selle in lewende weefsels.

5-Ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU) is 'n timidienanaloog wat in die DNA van verdeelde selle opgeneem word en gebruik word om DNA-sintese in selkultuur of lewende weefsels te toets. Dit kan gevisualiseer word deur 'n fluoresserende asied kovalent te bind deur gebruik te maak van klikchemie, wat minder hard is as die toestande wat gebruik word om die epitoop vir BrdU-teenliggaampies bloot te stel.

Tydens groei van bakteriofaag T4 verhoog 'n oormaat timidien beskikbaarheid mutasie. [3] [4] 'n Tekort aan timidien tydens groei verhoog ook mutasie. [3] 'n Timidilaat-uksotroof van die diploïede gis Saccharomyces cerevisiae is gekweek onder toestande waarin timidiaatvlakke gewissel het van oormaat tot uitputting. [5] Hoë vlakke van timidilaat is waargeneem as mutageen en rekombinogeen, terwyl hongersnood vir timidilaat rekombinogeen maar net effens mutageen was.


1,4-Antrakinoon: 'n teenkankermiddel wat nukleosiedvervoer blokkeer, makromolekulesintese inhibeer, DNA-fragmentasie veroorsaak en die groei en lewensvatbaarheid van L1210-leukemiese selle in dieselfde nanomolêre reeks as daunorubisien in vitro verminder

1,4-Antrakinoon (AQ) is gesintetiseer en getoon om te verhoed dat L1210-leukemiese selle makromolekules sintetiseer en in vitro groei. Daarteenoor was sy dihidroksi-9,10antrakinoonvoorloper, kinizarien, onaktief. Die antitumor-aktiwiteit van AQ is vergelyk met dié van daunorubisien (DAU), wat struktureel verskil van AQ, maar ook 'n kinoon-deel bevat. AQ is ekwipotent aan DAU teen L1210 tumorselproliferasie (IC50: 25 nM op dag 2 en 9 nM op dag 4) en lewensvatbaarheid (IC50: 100 nM op dag 2 en 25 nM op dag 4), wat daarop dui dat sy sitostatiese en sitotoksiese aktiwiteite is 'n kombinasie van geneesmiddelkonsentrasie en duur van geneesmiddelblootstelling. Aangesien AQ nie toeneem nie, maar eerder die mitotiese indeks van L1210-selle op 24 uur verlaag, is dit nie 'n antitubulien-middel nie, maar kan vroeë stadiums van selsiklus-progressie stop. Soos DAU, is 'n 1.5-3 uur voorbehandeling met AQ voldoende om die tempo van DNA, RNA en proteïensintese (IC50: 2 mikroM) wat oor 30-60 minute periodes van pols-etikettering in L1210 selle in vitro bepaal is, te inhibeer. In teenstelling met DAU, wat onaktief is, het 'n 15 min voorbehandeling met AQ die voordeel om ook die sellulêre vervoer van beide purien en pirimidien nukleosiede (IC50: 2.5 mikroM) oor 'n 30 s periode in vitro te inhibeer. Gevolglik kan AQ die inkorporering van [3H]timidien in DNA voorkom omdat dit vinnig die opname van hierdie nukleosiede deur die tumorselle blokkeer. Na 24 uur veroorsaak AQ soveel DNS-splyting as kamptotesien en DAU, twee teenkankermiddels wat DNS-stringbreuke produseer en waarvan bekend is dat dit onderskeidelik topoisomerase I- en II-aktiwiteite inhibeer. Die konsentrasie-afhanklike induksie van DNA-splyting deur AQ, wat 'n hoogtepunt bereik by 1.6-4 mikroM en verdwyn by 10-25 mikroM, lyk egter soos dié van DAU. Die meganisme waardeur AQ DNA-splyting induseer, word geïnhibeer deur aktinomisien D, sikloheksimied en aurintrikarboksielsuur, wat daarop dui dat AQ endonukleases aktiveer en apoptose veroorsaak. Die vermoë van AQ om nukleosiedvervoer te blokkeer, DNA-sintese te inhibeer en DNA-fragmentasie te veroorsaak, is onomkeerbaar na dwelmverwydering, wat daarop dui dat hierdie verbinding vinnig met verskeie molekulêre teikens in selmembrane en kerne kan in wisselwerking tree om die funksies van nukleosiedvervoerders en nukleïensure te ontwrig, en veroorsaak langdurige antitumor-effekte wat voortduur na die staking van geneesmiddelbehandeling. As gevolg van sy sterkte en dubbele effekte op nukleosiedvervoer en DNA-splyting, kan die gebruik van bifunksionele AQ met antileukemiese aktiwiteit in die nM-reeks in vitro 'n aansienlike voordeel in polichemoterapie bied om die werking van antimetaboliete te versterk en multi-middel-weerstandige tumorselle te sensitiseer.


Navorsers ontbloot nuwe insigte in meganismes van timienlose dood

'n Omgekeerde beeld van DAPI-gekleurde thyA-mutant E. coli met bykomende defekte in die enterobakteriese algemene antigeenbiosintese onder timienhonger begin deur die verwydering van timidien uit hul groeimedium. Linkerkolom: selle wat steeds in die teenwoordigheid van timidien gegroei het. Sentrale kolom: een uur sonder timidien. Regterkolom: drie uur sonder timidien. Selle in die onderste ry ondergaan massiewe lise.

Andrei Kuzminov, professor in mikrobiologie aan die Universiteit van Illinois, lei navorsing oor die raaisel van timienlose dood, waar mutante selle wat nie die noodsaaklike molekule timien kan sintetiseer nie, sal sterf tensy die groei-omgewing timien geredelik beskikbaar het. Kuzminov het onlangs saam met die nagraadse student Pritha Rao die "weerstand"-tydperk van timienlose dood in E. coli-bakterieë ondersoek en 'n timienbergingsmeganisme in hierdie selle ontdek, wat hulle in staat stel om tydelik sonder 'n omgewingsbron te oorleef. Hul resultate, gepubliseer in PNAS, het implikasies vir die verbetering van die doeltreffendheid van antibiotiese behandelings.

Timynlose dood is 'n gebied wat, ondanks die feit dat dit vir meer as 65 jaar bestudeer is, wetenskaplikes steeds kopkrap vanweë sy komplekse meganismes en kenmerke wat verskil van ander sel-auksotrofies (metaboliese vereistes). Normaalweg, wanneer ouksotrofiese selle ontneem word van 'n vereiste aanvulling, kan hulle nie groei nie, maar hulle sterf ook nie af nie.

Met timien-auxotrofe, soos die thyA E. coli-mutant wat deur Rao en Kuzminov gebruik word, gaan die selle egter deur 'n weerstandsperiode, gevolg deur 'n tydperk van vinnige eksponensiële dood. Selfs meer vreemd is dat gedurende die weerstandsperiode, alhoewel selle ontneem word van een van die nodige boustene vir DNA (dTTP, gebou rondom timien), sellulêre DNA-replikasie voortduur, wat ongeveer die helfte van die bakteriese chromosoom repliseer voordat die weerstandsperiode eindig. Dit het navorsers gevra om te vra: "Waar kom die timien vir hierdie DNA-replikasie vandaan?"

"Ons probeer om die meganisme van timien-hongersnood-geïnduseerde dood, AKA timienlose dood, te verstaan," het Rao gesê. “Terwyl ons hierdie verskynsel van hoekom selle sterf in die afwesigheid van timien ondersoek het, het ons navorsing in 'n rigting beweeg waar ons gedruk is om na 'n intrasellulêre bron van timien te soek. Daar was 'n paar fenotipes wat slegs verklaar kon word as daar oorblywende timien in die sel was, terwyl die selle uitgehonger is.”

Die span het vermoed dat DNS-skade plaasgevind het nadat hulle DNS-replikasie waargeneem het ondanks geen omgewingsbronne van timien nie. Hulle het ook in die mikroskoop waargeneem dat thyA-mutante selle in lang filamente uitbrei wanneer hulle van timien ontneem word.

“Ons weet hierdie filamentasie word gesien wanneer daar DNA-skade in die sel is. Ons weet dat timien ’n bousteen vir DNA is, so in die afwesigheid van timien is dit baie natuurlik om die gevolgtrekking te maak dat DNA beskadig moet word,” het Rao gesê. Die span se vroeëre navorsing het dit bevestig deur 'n brandpunt vir DNA-skade in hierdie uitgehongerde selle by die oorsprong van replikasie te wys.

Rao en Kuzminov het voorheen probeer om die intrasellulêre timienpoel onder hoë molekulêre gewig (HMW) bronne te identifiseer, soos chromosomale DNA of stabiele RNA, maar hul eksperimente het getoon dat die hoeveelheid timien wat in die weerstandsfase DNA-sintese gebruik word, nie van hierdie bronne kon kom nie. . Hulle het eerder gedraai om lae molekulêre gewig (LMW) bronne te ondersoek. Om hierdie LMW-bronne te identifiseer, het Rao en Kuzminov bakterieë radio-gemerkte timien gevoer.

"Sodra jy E. coli radioaktiewe timien voed, word die meeste daarvan in die DNA opgeneem, maar sommige timien kan ook deel word van die intrasellulêre LMW-poel waarna ons gesoek het," het Rao gesê.

Nadat die sellulêre inhoud in LMW- en HMW-fraksies geskei is, het die navorsers gesien dat 'n verrassende 60% van die radioaktiewe sein van die LMW-fraksie kom, wat heelwat hoër was as die verwagte 3%. Hierdie sein verminder tot 20% tydens timienhonger. Op grond van hierdie waarnemings het Kuzminov en Rao tot die gevolgtrekking gekom dat die LMW-fraksie die hoofbron van timien was wat in DNA-sintese gebruik word tydens die weerstandsfase van timienhonger.

Nadat toetse uitgevoer is met verskeie mutante wat gebrekkig is in eksopolisakkariedkapsulesintese, het die span tot die gevolgtrekking gekom dat timien-suikervoorlopers van hierdie polisakkariede die grootste deel van LMW-timien vorm. Bakteriese selle gebruik eksopolisakkariede om selwande te versterk en om die omliggende omgewing te bespeur en met ander selle in aanraking te kom.

“Hierdie polisakkariedmolekules op E. coli-oppervlak is nie anders as bont op bontdiere nie. Hulle is ook redelik lank,” het Kuzminov gesê.

Die span het ook die spesifieke rolle bevestig wat elk van die ensieme in die produksie en benutting van hierdie LMW-timienbron gehad het. Een van die mees noemenswaardige effekte van die inhibering van hierdie ensieme is met die rffC-defek gesien.

“Die thyA rffC-dubbelmutante het geen weerstandsfase tydens timienhonger nie en sterf baie dieper as thyA-enkelmutante. Hulle ervaar wat ons 'hiper-timienlose dood' noem,” het Rao gesê. “Dit is een van die toestande wat ons geïdentifiseer het wat die ernstigste verlies in lewensvatbaarheid het tydens timienhonger.”

Die span is geïnspireer deur die skerp seldood wat in rffC-mutante gesien word om te sien of hierdie effekte gebruik kan word om die uitwerking van antibakteriese middels te versterk. Hulle het dit getoets met trimetoprim. Hierdie middel is bedoel om timienlose dood in die geteikende bakteriese populasie te veroorsaak, maar voorkom eerder bakteriese groei. Soos Rao en Kuzminov egter verwag het, is die rffC-mutante dramaties deur dieselfde trimetoprim-behandeling doodgemaak.

As sodanig glo die span dat kombinasiemedikasiebehandelings wat beide die eksopolisakkariedsintese-ensieme inaktiveer en trimetoprim lewer, meer effektief kan wees as die antibakteriese middel alleen. Hierdie selfde teorie kan ook implikasies hê vir die toediening van timienlose doodveroorsakende middels wat kanker behandel.

Kuzminov-laboratorium beplan om aan te hou om die raaisel van timien-hongersnood te ontrafel.

"Ons weet al 65 jaar van timienlose dood, maar ons weet steeds nie wat dit is nie, hoewel ons 'n duideliker begrip kry van wat dit nie is nie," het Kuzminov gesê. “Dit beteken dat timienlose doodsmeganisme 'n baie komplekse, moeilik-oplosbare verskynsel moet wees. Pritha was dapper om in te waai en vreesloos te eksperimenteer.”


Aanvullende teks en figure

Aanvullende resultate, Aanvullende Tabel 1 en Aanvullende Figure 1–7. (PDF 18963 kb)

Aanvullende datastel 1

Mutasie resultate vir eksoomvolgordebepaling van HCT-116 klone. 'n Lys van alle bespeurde nie-sinonieme, splitsingsplek en invoeging/uitwissingsmutasies vir 19 HCT-116 klone. 6 van hierdie klone was bestand teen CD437 (CD437R) en 13 ander was sensitief (Beheer). (XLSX 3448 kb)

Aanvullende datastel 2

Gene met missense mutasies in HCT-116 klone. 'n Lys van gene waarvoor eksoomvolgordebepaling missense mutasies in ten minste een van die 19 HCT-116 klone geopenbaar het. Gene wat missense-mutasies in CD437R-klone gehuisves het, maar nie beheerklone nie, word uitgelig en bo-aan gelys. (XLSX 506 kb)


Kyk die video: Síntese Proteica Parte 1 - Transcrição. Prof. Samuel Cunha (Oktober 2022).