Inligting

Hoeveel kopieë van RNA per sel word gewoonlik bereik deur ooruitdrukking in menslike sellyne? (enige tegniek)

Hoeveel kopieë van RNA per sel word gewoonlik bereik deur ooruitdrukking in menslike sellyne? (enige tegniek)


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Na 8 uur se aanlyn-navorsing kon ek glad nie enige inligting vind nie ...

Ek was in staat om 'n paar konkrete kopie getalle van DNA (bv. plasmied) per sel te kry na transfeksie van diverse transfeksie tegnieke, maar ek was nie in staat om enige konkrete kopie nommers van RNA's te kry wat ooreenstem met die transgeen (van enige ooruitdrukking tegniek).

My hoofbelangstelling sal die hek293T-ooruitdrukking RNA-vlakke wees deur die virale plasmied te gebruik, maar konkrete RNA-kopiegetalle van enige moontlike ooruitdrukkingstegniek sal van belang wees. (vir menslike selle soos Hela, Hek, HepG2 ...)

Ideaal gesproke sou ek 'n betroubare bron nodig hê, maar 'gut-feeling comments' word ook verwelkom.

Op die ou end wil ek ooruitgedrukte RNA-konsentrasies met natuurlike uiters hoë gekonsentreerde endogene RNA's vergelyk. Is hierdie vlakke vergelykbaar, of is die (virale) transgeenpromotors soveel meer effektief?

EDIT: Let asseblief ook daarop dat die kern 'n sterk versperring vir vreemde DNA is. Kan hierdie antwoord kompliseer.


Hoeveel kopieë van RNA per sel word gewoonlik bereik deur ooruitdrukking in menslike sellyne? (enige tegniek) - Biologie

Figuur 1: Agterkant van die koevertberekening wat die fraksie van die seldroëmassa aantoon wat aan ribosome toegewy is teen 'n vinnige bakteriese groeitempo. Aantal ribosome gebaseer op BNID 101441 en sel droë massa gebaseer op BNID 103891.

Figuur 2: Fraksie van ribosomale proteïensintesetempo uit die totale selproteïensintese. Metings is uitgevoer op kulture in gebalanseerde groei en dus is die relatiewe tempo soortgelyk aan die relatiewe oorvloed van die ribosomale proteïene in die proteoom. Aangepas uit J. L. Ingraham et al., “Physiology of the bacterial cell” bladsy 276, Sinauer 1990.

Een van die bekende refreine in byna alle biologie-handboeke is dat proteïene die werkesels van die sel is. Gevolglik is selle diep oplettend vir al die stappe tussen die uitlees van die genetiese inligting wat in DNS versteek is en die uitdrukking van aktiewe proteïene. Een van die maniere waarop die algehele ritme van proteïenproduksie beheer word, is deur die aantal ribosome te verstel. Ribosome is een van die dominante bestanddele in selle en in selle wat vinnig deel, begin hulle 'n beduidende fraksie van die sellulêre binnekant opneem. Die RNA wat hierdie ribosome uitmaak, maak ≈85% van die sel se algehele RNA-poel uit (BNID 106421). Alhoewel DNA-replikasie, transkripsie en translasie die drie pilare van die sentrale dogma is, binne die proteoom, is die fraksie wat aan DNA-polimerase (BNID 104123) of RNA-polimerase (BNID 101440) toegewy is, baie keer kleiner as die tien persent van die selproteïen toegewy aan ribosome (BNID 107349, 102345). As sodanig is daar spesiale belangstelling in die oorvloed van ribosome en die afhanklikheid van hierdie oorvloed van groeitempo. Die seminale werk van Schaechter et al. vroeg reeds die ver-van-triviale waarneming vasgestel dat die ribosomale fraksie 'n funksie van die groeitempo is en meestal onafhanklik van die substraat is, dit wil sê, verskillende media wat tot soortgelyke groeitempo's lei, neig om soortgelyke ribosomale fraksies te hê (M. Schaechter et al. J Gen Microbiol. 19:592, 1958). Lede van die sogenaamde "Kopenhagen-skool" (insluitend Schaechter, Maaloe, Marr, Neidhardt, Ingraham en ander) het voortgegaan om uitgebreide kwantitatiewe karakterisering te maak van hoe die selbestanddele verskil met groeikoers wat dekades na hul publikasie as maatstawwe dien en 'n dwingende voorbeeld van kwantitatiewe biologie lank voor die koms van hoë deursettegnieke.

Tabel 1 toon die aantal ribosome in E coli op verskillende verdubbelingstye. In die tabel is dit ook duidelik hoe die selmassa (en volume) sterk afhang van groeitempo, met vinniger deelende selle wat baie groter is. Soos bereken in die vierde kolom van die tabel, en skematies in Figuur 1, verteenwoordig die 72 000 ribosome per sel teen 'n vinnige verdubbelingstyd van 24 minute meer as 1/3 van die droë massa van die sel (BNID 101441, 103891). Akkurate metings van hierdie fraksie uit die 1970's word in Figuur 2 getoon.

Tabel 1: Aantal en breuk van ribosome as 'n funksie van die verdubbelingstyd. Waardes word tot een beduidende syfer afgerond. Ribosome per sel is van "E. coli & Salmonella handbook", Hoofstuk 97, Tabel 3. Droë massa per sel is van E. coli & Salmonella, Hoofstuk 97, Tabel 2. Ribosoom droëmassafraksie word bereken op grond van ribosoommassa van 2.7MDa (BNID 100118).

Verskeie modelle is uiteengesit om hierdie waargenome tendense vir die aantal ribosome per sel te verduidelik. Om te verdeel, moet 'n sel sy proteïeninhoud herhaal. As die vertaalkoers konstant is, moet 'n netjiese afleiding gemaak word. Ons maak dus hierdie aanname selfs al wissel die vertaalkoers van ≈20 aa/sek in E coli teen vinnige groeitempo tot nader aan ≈10 aa/sek onder stadige groei (BNID 100059). Dink aan 'n gegewe selvolume in die sitoplasma. Ongeag die verdubbelingstyd, moet die ribosome in hierdie volume die totale massa proteïene in die volume binne 'n selsiklus produseer. As die selsiklus sê drie keer korter word dan moet die nodige ribosoomkonsentrasie drie keer hoër wees om die taak te voltooi. Dit neem stilswyend aan dat die polimerisasietempo konstant is, dat aktiewe proteïenafbraak weglaatbaar is en dat die algehele proteïeninhoud nie met groeitempo verander nie. Dit is die logika wat die voorspelling onderlê dat die ribosomale fraksie eweredig is aan die groeitempo. Anders gestel, soos die verdubbelingstyd korter word, word voorspel dat die vereiste ribosomale fraksie sodanig sal toeneem dat die ribosomale fraksie keer die verdubbelingstyd 'n konstante is wat die totale proteoomkonsentrasie weerspieël. Die analise dui ook daarop dat die sintesetempo skaal soos die groeitempo kwadraat, omdat die tyd om die vereiste ribosoomkonsentrasie te bereik korter word in verhouding met die verdubbelingstyd. Hoe goed pas hierdie speelgoedmodel by die eksperimentele waarnemings?

Figuur 3: Krio-elektrontomografie van die piepklein Spiroplasma melliferum. Met behulp van algoritmes vir patroonherkenning en klassifikasie is komponente van die sel soos ribosome gelokaliseer en getel. (A) Enkelkrio-elektronmikroskopiebeeld. (B) 3D-rekonstruksie wat die ribosome wys wat geïdentifiseer is. Ribosome wat in groen gemerk is, is met hoë getrouheid geïdentifiseer terwyl dié wat in geel gemerk is, met intermediêre getrouheid geïdentifiseer is. (C) Naby-aansig van 'n deel van die sel. Aangepas uit J. O. Ortiz et al., Journal of Structural Biology 156:334, 2006.

Soos in die regterkolom van Tabel 1 en in Figuur 2 getoon, is die verhouding van ribosoomfraksie tot groeitempo relatief konstant vir die vinniger groeitempo's in die reeks van 24-40 minute soos voorspel deur die eenvoudige model hierbo en die verhouding is nie konstant teen stadige groeitempo's. Inderdaad by stadiger groeitempo's word voorgestel dat die ribosoomtempo stadiger is (BNID 100059). Meer gevorderde modelle (bv. M. Scott et al., Science, 330:1099, 2010) neem verskillende bestanddele van die selle in ag (byvoorbeeld 'n proteïenfraksie wat onafhanklik is van groeitempo, 'n fraksie verwant aan die ribosome en 'n fraksie verwant tot die kwaliteit van die groeimedium) wat lei tot meer genuanseerde voorspellings wat die data oor 'n groter reeks toestande pas. Sulke modelle is 'n groot stap in die rigting van die beantwoording van die basiese vraag van wat die maksimum groeitempo van selle beheer.

Figuur 4: Tel en lokalisering van ribosome binne selle met behulp van enkelmolekulemikroskopie. (A) Twee ribosome geïdentifiseer uit die volle super-resolusie beeld hieronder getoon. (B) Enkel-molekule intensiteit verspreiding. (C) Aantal ribosome as 'n funksie van sellulêre volume. (Aangepas uit S. Bakshi et al, Molecular Microbiology 85:21, 2012.)

Tradisioneel was die meting van die aantal ribosome per sel gebaseer op die skeiding van die ribosome van die res van die selbestanddele, die meting van watter fraksie van die totale massa van hierdie ribosome kom en dan met omskakelingsfaktore gebaseer op skattings van selgrootte en massa, ribosomale molekulêre gewig, ens. wat die oorvloed per sel aflei. Onlangs word 'n meer direkte benadering beskikbaar wat gebaseer is op die eksplisiete tel van individuele ribosome. In krio-elektronmikroskopie word vinnig bevrore selle vanuit baie hoeke gevisualiseer om wat bekend staan ​​as 'n tomografiese 3D-kaart van die sel te skep. Die bekende struktuur van die ribosoom word dan gebruik as 'n sjabloon wat in die volledige selvomogram gesoek kan word. Hierdie tegniek is toegepas op die klein, spiraalvormige prokariote Spiroplasma melliferum. Soos getoon in Figuur 3, in hierdie klein sel, 10-100 keer kleiner as E coli volgens volume (BNID 108949, 108951) en stadiger in groei, het navorsers gemiddeld 1000 ribosome per sel getel (BNID 108945). Soortgelyke direkte telpogings is aangewend met die gebruik van die superresolusie tegnieke wat fluoressensiemikroskopie beïnvloed het soos getoon in Figuur 4 waar 'n telling gemaak is van die ribosome in E coli. 'n Vergelyking van die resultate van hierdie twee metodes word in Figuur 5 gemaak waar 'n eenvoudige skatting van die ribosomale digtheid gemaak word uit die krio-elektronmikroskopiebeelde en hierdie digtheid word dan opgeskaal tot 'n volle E coli volume, wat 'n bemoedigende konsekwentheid tussen die verskillende metodes toon.

Figuur 5: Agterkant van koevert skatting van hoeveel ribosome in 'n sellulêre volume is.


Abstrak

In vivo aflewering van antigeen-koderende mRNA is 'n belowende benadering tot persoonlike kankerbehandeling. Die terapeutiese doeltreffendheid van mRNA-entstowwe is afhanklik van veilige en doeltreffende geenlewering, biologiese stabiliteit van die mRNA en die immunologiese eienskappe van die entstof. Hier beskryf ons die ontwikkeling en evaluering van 'n veelsydige en hoogs doeltreffende mRNA-entstofafleweringstelsel wat ladingveranderende vrystelbare vervoerders (CARTs) gebruik om antigeenkoderende mRNA aan antigeen-presenterende selle (APC's) te lewer. Ons demonstreer in menslike perifere bloed mononukleêre selle dat CART-entstowwe 'n robuuste antigeen-spesifieke immuunrespons teen mRNA-gekodeerde virale epitope kan aktiveer. In 'n gevestigde muismodel demonstreer ons dat CART's by voorkeur professionele APC's in sekondêre limfoïede organe teiken op i.v. inspuitings en teiken plaaslike APC's op s.c. inspuiting. Laastens wys ons dat CART's saamgeformuleer met mRNA en 'n Tol-agtige reseptorligand gelyktydig teikenselle transfekteer en aktiveer om 'n immuunrespons te genereer wat muise met groot, gevestigde gewasse kan behandel en genees.

Immunoterapie het mondig geword en daarmee saam het 'n groter begrip van die komplekse interaksies tussen kankers en die immuunstelsel gekom (1). Opkomende terapieë maak staat op fundamentele insigte in die meganismes wat immuunselfunksie onderdruk en tumorselle in staat stel om herkenning en dood te ontduik. Vir hierdie doeleindes is groot hulpbronne belê in hoë-deurset sifting vir nuwe teikens, genetiese veranderinge, immuunsel karakterisering, en geoptimaliseerde dwelm-aflewering platforms (2 ⇓ ⇓ ⇓ –6). Uit hierdie pogings kom persoonlike medisyne na vore as die belowende strategie vir kankerbehandeling.

Inenting kan langtermyn beskerming teen eksterne patogene bied en die opruiming van inwonende siek selle inisieer (7). Om dié rede het eksperimentele benaderings van kanker-inenting begin met profilaktiese inenting teen kanker-geassosieerde antigene. Nou het nuwe ontwikkelings die fokus verskuif na die meer klinies relevante terapeutiese gebruik van kankerinenting (3, 7 ⇓ –9). Dit sluit in inentingplatforms wat antigeenlewering aan gespesialiseerde immuunselle teiken, die vinnige identifikasie van immunogene tumor-spesifieke antigene, en alternatiewe molekulêre samestellings van die antigeen (2, 3, 10).

Vir hierdie doel het mRNA-gebaseerde kanker-inenting na vore gekom as 'n belowende benadering. Die konsep om mRNA as basis vir 'n entstof te gebruik, is die eerste keer in 1972 voorgestel (11) en is daarna in 1993 aangemeld vir antigeenspesifieke griepinenting (12) en toe in 1999 vir inenting teen kankerspesifieke antigene (13). In hierdie strategie word 'n mRNA wat vir spesifieke antigeen-epitope kodeer in die immuunstelsel ingebring, wat die liggaam se natuurlike verdediging effektief "oplei" om antigeen-presenterende kankerweefsel te herken en te vernietig. Antigeenaanbieding is die fundamentele beginpunt in alle aanpasbare immuunresponse. Antigeenspesifieke T-selle is nie in staat om te reageer sonder behoorlike antigeenaanbieding nie, en B-selreaksies is dikwels minderwaardig sonder T-selhulp. mRNA-aflewering bied 'n uitstekende strategie om intrasellulêre sintese van enige gewenste proteïen- of peptiedantigeen te veroorsaak. Veral omdat mRNA proteïen katalities produseer, is 'n relatief klein dosis mRNA nodig om baie kopieë van proteïen te produseer, 'n voordeel bo duur heelproteïen-inenting (14). Daarbenewens dra mRNA-terapie nie dieselfde risiko's van invoegingsmutagenese wat met plasmied-DNA-gebaseerde geenterapie geassosieer word nie (15). Boonop kan die aflewering van spesifieke/pasgemaakte proteïenkoderende mRNA aangewend word om die verbygaande uitdrukking van eksogene proteïene in antigeenpresenterende selle (APC's) te veroorsaak (3), 'n buigsaamheid wat ideaal is vir effektiewe kankerinenting teen vinnig muterende kankers (as gevolg van die groot aantal potensiële gemuteerde antigene).

Nieteenstaande hierdie belofte, is mRNA 'n groot, polianioniese molekule wat nie maklik selmembraangrense oorsteek nie en is oor die algemeen onstabiel in sirkulasie as gevolg van skeuring deur inheemse nukleases (16). Daarom is 'n sleutel om hierdie metodologie moontlik te maak, die ontwikkeling van veilige en effektiewe middels wat mRNA verpak, beskerm, lewer en intrasellulêr vrystel (7, 14, 17, 18). Ten spyte van hierdie uitdagings, het vroeë verslae belofte getoon vir mRNA-gebaseerde inenting vir kanker-immunoterapie. Veilige en effektiewe aflewering bly egter 'n groot uitdaging om die breër implementering van hierdie benadering moontlik te maak (19 ⇓ ⇓ –22). As gevolg van die kritieke rol van mRNA-aflewering in terapeutiese inentings, word die bekendstelling en evaluering van veilige, effektiewe en verstelbare mRNA-afleweringsvoertuie vereis vir breër kliniese implementering.

Ons het onlangs die robuuste in vivo lewering en uitdrukking van mRNA gerapporteer met behulp van lading-veranderende vrystelbare vervoerders (CARTs) (10, 23). Die meganisme van mRNA vrystelling vir CARTs verskil van ander afleweringsvoertuie aangesien dit dinamies verloop met 'n instelbare verandering in fisiese eienskappe. Uniek onder ander mRNA-afleweringstelsels soos lipied-nanopartikels (LNP's), 'n sleutelkenmerk van CART's is 'n ladingsveranderende degradasiemeganisme wat die aanvanklike polikationiese ruggraat in neutrale kleinmolekule neweprodukte omskep, en sodoende endosomale ontsnapping help deur die elektrostatiese vrystelling en daaropvolgende vertaling van mRNA. CARTs verteenwoordig 'n heeltemal nuwe klas van transfeksie agente, en omdat hierdie CARTs afbreek tot goed verdra neutrale klein molekules, hulle vermy die bekende toksisiteit kommer wat verband hou met kationiese lipiede en materiale (24). Hierin rapporteer ons dat mRNA-CART-entstowwe wat heelproteïen-koderende mRNA gebruik, nie net antigeen-spesifieke aktivering van T-selle in menslike perifere bloed mononukleêre selle (PBMC's) induseer nie, maar dit meer effektief doen as die konvensionele sintetiese virale peptiedmengsels. Boonop demonstreer ons data die sterkte van hierdie vektore in die terapeutiese behandeling van tumordraende diere, wat beklemtoon dat hierdie strategie muise teen inenting met kankerselle beskerm en muise met gevestigde kankers genees.


HBV-infeksie en replikasie: 'n kort oorsig

HBV is die prototipiese lid van die hepadnaviridae, 'n familie van klein omhulde hepatotropiese DNA-virusse wat 'n soortgelyke genoomorganisasie en replikasiestrategie deel. Die soogdiervirusse (orthohepadnaviridae) sluit, byvoorbeeld, woodchuck hepatitis virus (WHV) en grond eekhoring hepatitis virus en, meer onlangs ontdek, HBVs van wollerige ape17 en vlermuise.18 Voëlvirusse (avihepadnaviridae) sluit onder andere dié van Pekin-eende (eend HBV (DHBV)) en reier HBVs in. Geen hepadnavirus is egter gevind in gevestigde proefdiere soos muise, rotte of hoenders nie.

Soos getoon in figuur 1A, bestaan ​​HB-virions,19 , 20 of 'Dane-deeltjies'21 uit 'n buitenste omhulsel van die lipied-ingebedde klein (S), middel (M) en groot (L) oppervlakproteïene (HBsAg in serologie) en 'n binneste nukleokapsied (kernpartikel hepatitis B-kernantigeen in serologie) waarvan die ikosaëdriese dop deur 120 dimere van die kernproteïen gevorm word. ' (RC) DNA waarin die 5'-punt van die (-)-string kovalent gekoppel is aan die virale P-proteïen26-vorming van hierdie ongewone struktuur deur proteïen-geprimeerde omgekeerde transkripsie, word hieronder uiteengesit.

Basiese molekulêre kenmerke van HBV. (A) Virion-struktuur. Aansteeklike virions bestaan ​​uit 'n buitenste omhulsel met die lipied-ingebedde oppervlakproteïene klein (S), middel (M) en groot (L), en 'n ikosaëdriese binnenukleokapsied wat die virale genoom huisves as 'n ontspanne-sirkulêre DNA wat kovalent gekoppel is aan die terminale proteïen (TP) domein van P proteïen. (B) Genoomorganisasie. Buitelyne dui virale transkripsies aan, pylpunte transkripsie begin ε simboliseer die RNA-inkapselingsein op pregenomiese (pg)RNA. Die twee DNA-stringe word getoon as teenwoordig in ontspanne sirkelvormige (RC)-DNA om die relatiewe posisies van RC-DNA-tipiese kenmerke uit te lig, maar die virale RNA's wat kodeer vir die oop leesrame (ORF's) wat in die middel uitgebeeld word, word eintlik van kovalent getranskribeer geslote sirkelvormige DNA. Let op die hoogs kompakte organisasie met oorvleuelende ORF's en regulatoriese elemente (groen pyle, promotors Enh I/Enh II, transkripsionele versterkers direkte herhaling (DR)1, DR2, direkte herhalings kronkelende rooi lyn, RNA-primer op (+)-DNA). (C) Domeinstrukture van HBV-strukturele proteïene. Getalle verteenwoordig aminosuurposisies, gebaseer op genotipe D, subtipe ayw. Die intree-inhibeerder Myrcludex B is afgelei van die N-terminale deel van die PreS1-domein. Die middeloppervlak-proteïen M bestaan ​​uit PreS2 plus S. GAG, glikosaminoglikane NTCP, natriumtaurocholaat-kotransporterende polipeptied P, POL/RT, DNA-polimerase/omgekeerde transkriptase RH, RNase H L, groot oppervlakproteïen wat PreS1, PreS2 en S-domein myr, myristoyl bevat.

Die merkwaardigste kenmerke van die genoom (figuur 1B) is sy klein grootte (~3 kb) en uiters kompakte organisasie, met elke nukleotied (nt) wat noodwendig kodeerfunksie in een of selfs twee (oorvleuelende) oop leesrame (ORF'e) het. , alle regulatoriese elemente vir geenuitdrukking en talle cis-elemente vir replikasie oorvleuel met koderingsinligting.Opvallend is dat avihepadnavirusse nie 'n funksionele X-proteïen het nie, wat in die soogdiervirusse noodsaaklik blyk te wees om infeksie te vestig (sien hieronder), verder produseer hulle L en S, maar geen M-oppervlakproteïen nie. Die domeinstrukture van HBV se strukturele proteïene word in figuur 1C uiteengesit.

'n Sleutelkenmerk wat deur alle hepadnavirusse gedeel word, is hul smal gasheerreeks, wat vir HBV in wese uit mense en die Groot Ape bestaan. Hierdie beperking het funksionele studies grootliks belemmer en die belangrikheid van die diere-HBV's as meer hanteerbare surrogate vasgestel. WHV in woodchuck is 'n relevante prekliniese model vir nuwe HBV antivirale,27 en DHBV was onontbeerlik in die vestiging van fundamentele aspekte van hepadnavirus infeksie en replikasie.28

Aangevul deur studies wat transfeksie met menslike HBV-uitdrukkingsvektore van menslike hepatoomsellyne gebruik, byvoorbeeld HepG2 en Huh7, wat replikasie ondersteun (maar nie vatbaar is vir infeksie nie), het dit gelei tot 'n algemene skema vir die HBV-aansteeklike siklus.29 Afgesien van uit 'n paar onlangse HBV-spesifieke bevindings (NTCP as reseptor, waarskynlike funksie van HBV X-proteïen (HBx)) wat in figuur 2 aangedui word, sal die basiese beginsels waarskynlik van toepassing wees op alle hepadnavirusse.

Vereenvoudigde skema van die HBV-aansteeklike siklus. (A) Aanhangsel en inskrywing. (B) Vrystelling van die nukleokapsied in die sitoplasma. (C) Nukleokapsied-gemedieerde kernvervoer en vrystelling van P-gekoppelde ontspanne sirkelvormige (RC)-DNA by die kernporie in die kern. (D) RC-DNA na kovalent geslote sirkelvormige (ccc)DNA-omskakeling. (E) Transkripsie van virale RNA's. (F) RNA-kernuitvoer. (G) Vertaling. (H) Voorkoming van cccDNA-transkripsie-stilte deur HBV X-proteïen (HBx). (I) Mede-verpakking van P en pregenomiese (pg)RNA in nukleokapsiede. (J) Eerste-string-DNS-sintese (geïnhibeer deur nukleos(t)ide-analoog (NA's)), pgRNA-afbraak en tweede-string-DNS-sintese wat lei tot nuwe RC-DNA. (K) Omhulsel van volwasse RC-DNA wat nukleokapsiede bevat. (L) Afskeiding van nuwe virions bygestaan ​​deur komponente van die multivesikulêre liggaam (MVB) masjinerie. (M) Afskeiding van hepatitis B e antigeen (HBeAg) en oortollige subvirale deeltjies (SVP) wat die grootste deel van hepatitis B oppervlak antigeen (HBsAg) uitmaak. GAG, glikosaminoglikane L, groot M, middel NTCP, natriumtaurocholaat saamvervoerende polipeptied S, klein.

Kortliks, HB-virions is gekonsentreer op vatbare selle deur interaksie van 'n blootgestelde gebied in die S-domein wat oorvleuel met die immunodominante 'a-determinant', wat die meeste van die HBV-neutraliserende epitope dra, en seloppervlakglikosaminoglikane.30 , 31 Dan, 'n hoë-affiniteit interaksie tussen die gemyristoyleerde N terminale PreS1 streek van die L proteïen met NTCP, en waarskynlik verdere gasheer faktore,32 snellers opname (waarskynlik deur endositose) van die virion. Die PreS1-domein is veral ook noodsaaklik vir nukleokapsied-omhulsel, wat verantwoord word deur sy dubbele topologie (figuur 1A), met een deel wat na die virion-interieur kyk en die ander na die virion-oppervlak.33 Vir die interaksie met NTCP, ongeveer 50 aa vanaf die PreS1 N-terminus en N-terminale vetasylering is voldoende (figuur 1C), die basis vir intree-inhibisie deur PreS1-afgeleide lipopeptiede ('Myrcludex B'11). Na virionopname word die RC-DNA-bevattende nukleokapsiede in die gasheersel-sitoplasma vrygestel. Die proses word swak verstaan, maar sal waarskynlik toegee aan nuwe in vitro-infeksiestelsels gebaseer op NTCP-getransfekteerde hepatoomselle. Blootstelling van kernlokaliseringseine in die Arg-ryke C terminale domeine (CTD's)34 van die kernproteïen (figuur 1C), moontlik gereguleer deur CTD-fosforilering en/of voltooiing van die onvolledige (+)-string in RC-DNA, maak vervoer moontlik van die nukleokapsied na die kernporie waar die kapsieddop disintegreer,35 wat die virale polimerase-gebonde RC-DNA in die nukleoplasma vrystel, daar omskakeling na cccDNA en vorming van 'n nukleosoomgebonde minichromosoom, waarskynlik geassosieer met HBx en kernproteïen, vind plaas.36 Soos op sellulêre DNA, bied dit talle opsies vir dinamiese epigenetiese beheer van cccDNA transkripsionele aktiwiteit, soos hoogs skematies uiteengesit in figuur 3. Dit sluit in DNS-modifikasies soos metilering, onderdrukkende en aktiverende post-translasionele modifikasies (PTM's) van die histone soos asetilering , metilering, fosforilering en ander,37 nukleosoomspasiëring en waarskynlik meer onlangs ontdekte meganismes wat optree via nie-koderende RNAs38 of vervanging van normale h istone deur spesifieke variante.39 Veral, in die afwesigheid van HBx, blyk dit dat cccDNA vinnig stilgemaak word, terwyl HBx 'n transkripsie-aktiewe toestand bevorder40 wat korreleer met die teenwoordigheid van sommige van die bekende aktiverende histoon PTM's.41 , 42 Die meganisme van HBx-gemedieerde de-silencing is onduidelik, en die volle repertorium van potensieel aktiveer versus onderdrukkende regulering is grootliks onontgin, asook die vraag of chromatinisering reeds op RC-DNA geïnisieer kan word. Vervolgens speel cccDNA sy sleutelrol as sjabloon vir gasheer-RNA-polimerase II-gemedieerde transkripsie van subgenomiese RNA's (vir die oppervlakproteïene en HBx) en twee groter-as-genoom-lengte RNA's, dit wil sê die pregenomiese (pg) RNA en die voorkern-RNA wat aanleiding gee tot die voorkern-proteïenvoorloper van die sekretoriese hepatitis B e-antigeen (HBeAg). Alle RNA's is 5'-beperkte en 3'-polyadenilated, soos sellulêre mRNA's. Doeltreffende cccDNA-transkripsie word gereguleer deur lewerspesifieke transkripsiefaktore43, maar hang ook af van HBx,40 wat waarskynlik transkripsie-stilstelling van die cccDNA teenwerk (sien hieronder). Na kernuitvoer word die RNA's vertaal. Die omhulselproteïene word na die endoplasmiese retikulum gerig vanwaar hulle die sekretoriese pad binnegaan om 'n groot oormaat leë koeverte oor volledige virions te lewer. Hierdie subvirale deeltjies vorm die grootste deel van HBsAg en is die basis van die hepatitis B-entstof. Translasie van die bisistroniese pgRNA lewer kernproteïen plus P-proteïen, vir DHBV waarskynlik deur 'n rangeermeganisme wat blykbaar nie op die menslike virus van toepassing is nie.44

Epigenetika van kovalent geslote sirkelvormige (ccc) DNA. Kern-cccDNA word gevind as 'n mini-chromosoom, geassosieer met ongeveer 15–16 nukleosome (bestaande uit die kern histone H2A, H2B, H3, H4 plus die skakel histoon H1) en nie-histon proteïene, waarskynlik insluitend die virale kern proteïen en HBV X-proteïen (HBx). Die gevolglike chromatien-argitektuur, tesame met potensiële DNA-modifikasies soos metilering ('ek'), beïnvloed sterk toeganklikheid van regulatoriese elemente op die DNA tot transkripsiefaktore en RNA-polimerase en kan dus transkripsionele aktiwiteit beheer. Belangrike faktore is nukleosoomspasiëring, self veranderbaar deur chromatienhermodelleerders, en verskeie post-translasie histoon modifikasies (PTMs), wat die omvang van DNA verdigting reguleer. Op sellulêre DNA, en miskien op HBV cccDNA, addisionele regulering (aangedui as 'et al' in die figuur) kan plaasvind via variante histone of nie-koderende RNA's. In die afwesigheid van HBx, blyk dit dat cccDNA vinnig stilgemaak word (geslote toestand) HBx bevorder de-silencing (oop toestand), hetsy deur aktivering van modifikasies te stimuleer, of deur onderdrukkende modifikasies (of albei) te blokkeer. potensiële bydraes deur ander epigenetiese kontroles moet nog wees verken.


Abstrak

RNA-modulasie het 'n belowende terapeutiese benadering geword vir die behandeling van verskeie tipes siektes. Die opkomende veld van nie-koderende RNA-gebaseerde terapieë het nou onder die aandag gekom van kardiovaskulêre navorsing, waarin dit waardevolle vooruitgang kan bied in vergelyking met huidige farmakoterapie soos kleinmolekulêre middels of teenliggaampies. In hierdie oorsig fokus ons op nie-koderende RNA-gebaseerde studies wat hoofsaaklik in grootdiermodelle uitgevoer is, insluitend varke, hase, honde en nie-menslike primate. Die struikelblokke en beloftes om lang nie-koderende RNA's en circRNA's as terapeutiese modaliteite by mense te teiken, word spesifiek bespreek. Ons beskryf ook nuwe ex vivo-metodes gebaseer op menslike selle en weefsels, soos gemanipuleerde hartweefsels en lewende miokardiale snye wat kan help om die gaping tussen in vivo-modelle en kliniese toepassings in die toekoms te oorbrug. Laastens som ons antisense oligonukleotiedmiddels op wat reeds deur die Food and Drug Administration goedgekeur is om mRNA's te teiken en bespreek die vordering van niekoderende RNA-gebaseerde middels in kliniese proewe. Bykomende faktore, soos geneesmiddelchemie, geneesmiddelformulerings, verskillende toedieningsroetes en die voordele van RNA-gebaseerde middels, word ook in die huidige oorsig ingesluit. Onlangs is eerste terapeutiese miRNA-gebaseerde inhiberende strategieë in hartversakingpasiënte sowel as gesonde vrywilligers getoets om effekte op wondgenesing te bestudeer (NCT04045405 NCT03603431). Samevattend, 'n kombinasie van nuwe terapeutiese RNA-teikens, grootdiermodelle, ex vivo-studies met menslike selle/weefsels en nuwe afleweringstegnieke sal waarskynlik lei tot aansienlike vordering in die ontwikkeling van niekoderende RNA-gebaseerde volgende generasie terapeutika vir kardiovaskulêre siektes .

Dit is algemeen bekend dat <2% van die menslike transkriptoom proteïenkoderende RNAs kodeer, terwyl die meerderheid niekoderende RNAs (ncRNAs) is, insluitend ribosomale RNA, tRNA, mikroRNA (miRNA, of miR), lang niekoderende RNA (lncRNA), sirkelvormige RNA. (circRNA), en ander klein RNA's. 1,2 Oor die afgelope 2 dekades was daar toenemende bewyse dat ncRNA's optree as sleutelspelers in die aanvang en vordering van kardiovaskulêre siektes (CVD's). 3–5 Soos die ncRNA-navorsingsveld gevorder het, het navorsers komplekse instrumente ontwikkel om hierdie ncRNA's te moduleer met die doel om nuwe, volgende generasie strategieë te vestig om CVD's te bestry. 6 Byvoorbeeld, sommige van die eerste miRNA- of lncRNA-teikens wat in harthermodellering geïdentifiseer is, was miR-21 en die lncRNA Kast. 7,8 Daarom kan ncRNA-georiënteerde volgende generasie medisyne 'n nuwe terapeutiese opsie bied vir CVD's, waarvoor innovasies skaars was in die laaste paar dekades.

CVD's is die hoofoorsaak van dood in beide Europa en die Verenigde State, volgens Atlas (European Society of Cardiology) en die Centers for Disease Control and Prevention (CDC, Verenigde State). 9,10 Een van die nadele om nuwe terapeutiese innovasies te ontwikkel, is dat die meeste waarnemings slegs in in vitro-stelsels of kleindiermodelle (bv. knaagdiere) gemaak is, maar nog nie gerepliseer is nie of nie in groter dieremodelle gerepliseer is nie. Inderdaad, knaagdiere vertoon verskeie fundamentele verskille in sekere kardiovaskulêre fisiologie-elemente, soos hartgewig, hartklop, bloeddruk en die koronêre arteriestelsel, in vergelyking met groter diere en mense wat eksperimentele gevolgtrekkings kan beïnvloed. 11,12 Opwindend genoeg is verskeie RNA-gebaseerde middels wat KVS teiken reeds deur die Amerikaanse voedsel- en dwelmadministrasie goedgekeur, en die farmaseutiese ontwikkeling van ncRNA's is ook tans aan die gang. 13–15 Om in kliniese toepassing te vorder, is bewys van konsep en veiligheidsevaluering in groot dieremodelle, soos varke en nie-menslike primate, nuttige en dikwels noodsaaklike stappe voor die aanvang van eerste-in-mens proewe. Dus, in die huidige oorsig, fokus ons op ncRNA-gerigte terapeutiese studies wat hoofsaaklik uitgevoer word in groot diere en huidige kliniese proewe.

MiRNA-studies in groot diere

MiRNA's is 'n klas ncRNA's met kort (≈18–22 nukleotiede) en hoogs gekonserveerde volgordes wat oorwegend in eukariote bestaan. Funksioneel is miRNA's betrokke by verskeie geenregulerende meganismes insluitende mRNA-afbraak en translasie-onderdrukking via die RNA-geïnduseerde stilmaakkompleks. 16 Aangesien miRNA's hoogs behoue ​​bly, kort rye vertoon en hoogs volop is, het hulle die eerste klas ncRNA's geword wat in groot dieremodelle bestudeer is (Tabelle 1 en 2 Figuur 1) en onlangs, kliniese proewe (Tabel 3 Figuur 1).

Tabel 1. Modulasie van miRNA-uitdrukking in verskillende grootdiermodelle

AF dui op boezemfibrilleren AV, adenovirus IRI, iskemie-herperfusiebesering LV, lentivirus en MI, miokardiale infarksie.

Tabel 2. Die ontwikkelingsvordering van ncRNA-studies in verskillende modelle en kliniese proewe

lncRNA dui op lang niekoderende RNA en ncRNA, niekoderende RNA.

Tabel 3. Kliniese proewe met ncRNA-gebaseerde terapie

LNA dui op geslote nukleïensuur en ncRNA, niekoderende RNA.

Figuur 1. Skema van oligonukleotied-gebaseerde RNA aflewering.A, AntimiR's (miRNA-inhibeerders) kan met verskillende chemiese modifikasies gemodifiseer word, insluitend geslote nukleïensure (LNA's) en suikerruggraatmodifikasies (2'-O-Me, 2'-F/MOE en 2'-O-MOE), terwyl miRNA kan ook verbeter word deur miRNA nabootsers. Om mRNA's of lang niekoderende RNA's (lncRNA's) te inhibeer, word kort haarnaald-RNA's (shRNA's), of LNA/GapmeR algemeen gebruik. B, Adenovirus, adeno-geassosieerde virus (AAV), en lentivirus deeltjies kan as 'n vektor gebruik word om teikengene stil te maak of te oordruk. Benewens virale-gebaseerde aflewering, is liposome of nanopartikels 'n ander manier om antimiRs of miRNA-nabootsers te lewer. C, Verskeie afleweringsbenaderings kan in verskillende spesies toegepas word. Atrium-inspuiting word byvoorbeeld by konyne en honde met boezemfibrilleren uitgevoer. Vir varke word binneaarse inspuiting, kateter-gebaseerde inspuiting en intrakoronêre inspuiting algemeen gebruik. Subkutane inspuiting kan ook gebruik word. Klinies is subkutane inspuiting, binneaarse inspuiting en intradermale inspuiting aantrekliker en makliker afleweringsroetes by mense.

Varkstudies

Varke is 'n gewilde model om menslike hartsiekte na te boots, veral vir miokardiale infarksie (MI) studies, aangesien die varkhart baie ooreenkomste met die menslike hart deel, insluitend hartgewig, bloeddruk en hartklop. 11,43,44

Een van die eerste studies wat miRNA-terapeutika in grootdiermodelle ondersoek het, het die miRNA miR-92a geteiken. MiR-92a word alomteenwoordig uitgedruk en het verskeie funksies in die liggaam, insluitend die modulasie van angiogeniese weë. 29 In 'n muismodel is getoon dat miR-92a opgereguleer is na kardiale isgemiese besering. Die stilmaak van miR-92a deur 2'-O-metiel (2'-O-Me)-gemodifiseerde antagomir-92a het angiogenese in vitro en in vivo aansienlik verbeter. Verder het die inhibisie van miR-92a in 'n MI muismodel die infarkgrootte verminder en sekere kardiale funksies verbeter. 29 Intussen, in 'n iskemie-herperfusie-besering-varkmodel, was daar 'n vermindering in infarkgrootte, minder kardiomiosiet-apoptose en beter miokardiale funksie na die inhibisie van miR-92a-uitdrukking. 18 Die afregulering van miR-92a het ook kapillêre digtheid verhoog en hartontsteking verminder, hierdie studie het egter slegs gefokus op die korttermyn (drie of sewe dae) effek van antagomir-92a behandeling. Om meer langtermyn-effekte te bestudeer en die potensiële buite-teikenkwessies van 'n sistemiese miR-92a-blokkade te oorkom, het Bellera et al 19 antimiR-92a gelewer wat in bioabsorbeerbare en bioversoenbare mikrosfere ingekapsuleer is via intrakoronêre inspuitings in 'n MI-varkmodel. Die mikrosfeer-antimiR-92a is hoofsaaklik in die kapillêre van die anterior miokardiale wand opgespoor en het verbasend geen verspreiding na afgeleë organe getoon nie. Wat die langtermyn-effekte van mikrosfeer-antimiR-92 betref, het die behandeling ook angiogenese 1 maand na MI-induksie geïnduseer. Hierdie data het aan die lig gebring dat 'n geneesmiddel wat bedoel is om miRNA's te inhibeer, 'n hoër spesifisiteit en 'n groter langtermyn-effek kan hê wanneer dit met behoorlike fisiese beskerming of vervoegingchemie verander word. 'n MiR-92a inhibeerder is verder getoets in 2 fase I kliniese proewe (Tabel 3) en is genoem MRG-110 (miRagen Therapeutics, Inc, NCT03603431 en NCT03494712). 17 MRG-110 sal na verwagting wondgenesing versnel deur bloedvloei te verbeter via sy proangiogene eienskappe. Inderdaad, Gallant-Behm et al 17 het in 'n varkmodel gedemonstreer dat die toediening van antimiR-92a-inhibeerders bloedvloei en hervaskularisasie in peri-wond areas aansienlik verhoog het. Die resultate van hierdie fase 1-studies is nog nie gepubliseer nie.

Nog 'n meganisme wat deur miRNA's gereguleer word en wat dikwels bydra tot CVD is mitochondriale disfunksie. Daar is getoon dat 45 MiR-15b betrokke is by mitochondriale disfunksie deur Arl2 (ADP-ribosileringsfaktor-agtige 2) te teiken. In 'n primêre rot-kardiomiosietmodel het beide sellulêre atriale tachypacing (ATP) vlakke en Arl2 mRNA uitdrukking afgeneem na miR-15b ooruitdrukking, terwyl miR-15b inhibisie hierdie fenotipe omgekeer het. 30 Hullinger et al 20 het verder geslote nukleïensuur (LNA)-gemodifiseerde antimiR-15b op 'n MI-varkmodel toegepas en getoon dat miR-15b-inhibisie varkhartfunksie herstel het. Benewens 'n 16-meer antimiR, het navorsers ook 'n kort 8-meer antimiR-15b ontwikkel en gevind dat dit miR-15b uitdrukking doeltreffend onderdruk en ook hartfunksie verbeter. Interessant genoeg was daar verskille tussen die 2 oligonukleotied inhibeerders. Byvoorbeeld, behandeling met 'n 16-meer (maar nie 'n 8-meer nie) antimiR het linkerventrikulêre einddiastoliese druk verhoog, terwyl behandeling met slegs die 8-meer antimiR die infarkgrootte aansienlik verminder het. 20 Hierdie data het die belangrikheid van die ontwerp van miRNA-inhibeerders aangedui om 'n doeltreffende terapeutiese respons te bereik.

Dit is belangrik dat die farmakologiese effekte van antimiRs deur die siektetoestand beïnvloed kan word. Die hart-verrykte miR-208a word byvoorbeeld vanaf die intron van die α-MHC geen en is na berig word verantwoordelik vir kardiale hipertrofie en fibrose. 46 Montgomery et al 32 het verder gedemonstreer dat die inhibisie van miR-208a hartfunksie verbeter het in 'n hipertensie-geïnduseerde hartversaking rotmodel. Eding et al 21 het egter getoon dat differensieel uitgedrukte stroomaf-gene wat deur antimiR-208a gemoduleer is, verskillend is in TAC- en MI-rotmodelle, en 'n soortgelyke stres-afhanklike antimiR-effek is ook in 'n vark-MI-model waargeneem. Hierdie resultate het dus voorgestel dat die siektetipe en erns van 'n siekte in ag geneem moet word in die prekliniese ontwikkeling van 'n miRNA-middel.

Nog 'n miRNA, miR-132, is deurslaggewend betrokke by hartgroei en outofagie. 40 Inderdaad, miR-132 is beide nodig en voldoende om patologiese kardiomiosietgroei aan te dryf, 'n kenmerk van nadelige harthermodellering. Onlangs is die veiligheid, verdraagsaamheid, gunstige farmakokinetika, dosisafhanklike farmakokinetiese/farmakodinamiese (PK/PD) verwantskappe en die hoë kliniese potensiaal van 'n antimiR-132 behandeling by varke na miokardiale infarksie gedokumenteer. 23

Dit is bekend dat die volwasse soogdierhart geen noemenswaardige regeneratiewe kapasiteit het na besering nie, wat massiewe kardiomiosietverlies veroorsaak en gevolglik lei tot hartdisfunksie en hartversaking. Gebaseer op 'n heel-genoom miRNA biblioteek sifting wat postnatale dag 1 en dag 7 knaagdierharte vergelyk het, is miR-199a geïdentifiseer en voorgestel om die kardiomiosiet selsiklus hertoetrede beide in vitro en in vivo te bevorder. Die ooruitdrukking van miR-199a het kardiomiosietproliferasie verhoog en hartfunksie behou nadat MI in muise geïnduseer is. 31 Dieselfde groep het volgende miR-199a in varke ooruitgedruk na MI via die intramiokardiale inspuiting van adeno-geassosieerde virusbevattende miR-199a.22 Inderdaad, die ooruitdrukking van miR-199a in varkharte post-MI het kardiale kontraktiliteit verbeter, spiermassa verhoog en littekengrootte verminder, maar 70% van die adeno-geassosieerde virus-miR-199a behandelde varke (7 uit 10) het skielik gevrek hartdood 7 tot 8 weke na virusinspuiting. Verdere histologiese analise het aan die lig gebring dat 'n klein groepie selle wat selproliferasiemerkers uitdruk (bv. Ki67) en vroeë hartontwikkelingsmerkers (soos GATA4) die geïnfarkteerde miokardium infiltreer. Hierdie selle was swak gedifferensieerde, hoogs prolifererende en onvolwasse premiosiete wat waarskynlik die waargenome ventrikulêre fibrillasie en skielike hartdood van die varke veroorsaak het. 22 In die algemeen het hierdie miR-199 varkstudie die krag van miRNA's in die bereiking van biologiese effekte in die hart indrukwekkend gedemonstreer en die behoefte aan die noukeurige prekliniese karakterisering en buite-teiken effekvoorspelling van miRNA-gebaseerde middels voor kliniese toetsing beklemtoon.

As gevolg van die ooreenkoms tussen varke en mense ten opsigte van hul kardiovaskulêre stelsels en fisiologie, kan (mini-)varke ook waardevolle modelle vir aterosklerose wees. Gebaseer op verskillende genetiese veranderinge, is minivarke met konstitutiewe en/of dieetafhanklike verhogings in serumcholesterol reeds gegenereer en in dwelmtoetsing gebruik. Byvoorbeeld, stamme met 'n veranderde LDL-reseptorgeen of apolipoproteïen E-tekort het serumcholesterol verhoog en aterosklerose ontwikkel. 47,48 Die gemanipuleerde hartweefsel (EHT) gemaak van miniatuur varke wat die hipertrofiese kardiomiopatie mutasie dra MYH7 R403Q het verhoogde styfheid en verswakte spierverslapping aangebied. 49 Mentzel et al 50 het die miRNA-profiele van dieetgebaseerde vetsugtige varke ondersoek en gevind dat verskeie miRNAs potensiële biomerkers en terapeutiese teikens is. In die toekoms kan die toetsing van ncRNA-terapeutiese doeltreffendheid in sulke siektemodelle belangrike bydraes lewer tot 'n meganistiese begrip en farmaseutiese ontginning van die onderskeie RNA-verbindings.

Honde en konynstudies

In teenstelling met varke, het hondeharte oorvloedige kollaterale koronêre vate en is dus nie maklik bruikbaar as 'n MI-model nie. 11,44,51 Daarteenoor het hondeharte 'n elektrofisiologiese stelsel wat baie soortgelyk is aan dié van mense, is geneig om boezemfibrilleren (AF) te ontwikkel en word dus dikwels as 'n voorkeurmodel vir AF-navorsing gebruik.

Daar is 'n verskeidenheid metodes om AF by honde te veroorsaak, insluitend nikotienbehandeling en ATP. 24,25,52,53 In 'n ATP-geïnduseerde AF-hondmodel is gevind dat miR-328 boonop opgereguleer is, en die ooruitdrukking van miR-328 via 'n adenovirale benadering het AF-fenotipes in gesonde honde gerekapituleer. Bykomend het berekeningsvoorspelling aan die lig gebring dat die kalsiumspanning-gehekte kanaalsubeenhede α1c en β1 2 gene is wat deur miR-328 geteiken is. Behandeling met antimiR-328 het die uitdrukking van CACNA1C en CACNB1 en omgekeerde AF. 24

Daarbenewens is getoon dat miR-206 aan AF-vordering deelneem. MiR-206 is 'n spierverrykte miRNA en word ook benodig vir die regenerasie van neuromuskulêre sinapse. Die uitklophou van miR-206 in 'n amiotrofiese laterale sklerose-muismodel het die siektevordering versnel. 33 Die miRNA-profilering in 'n AF-hondmodel het aan die lig gebring dat miRNA-206 10-voudig geïnduseer is in vergelyking met in die kontrolegroep. Daarbenewens het die inhibisie van miR-206 deur lentivirale-antimiR-206-inspuiting die AF-geïnduseerde simptome verswak. 25 Alhoewel neuronale herlewing wat deur miR-206 geïnduseer is, die noodsaaklike rol van miR-206 tydens spierdenervasie en herinnervering aangedui het, 33,34 het die ooruitdrukking van miR-206 die AF-geïnduseerde simptome vererger. Hierdie resultate beklemtoon dat miRNA's verskillende funksies in verskillende organe kan hê en soms spesie-spesifieke effekte kan toon.

In 'n ATP-geïnduseerde AF-konynmodel, is gerapporteer dat miR-1 kardiale aritmieë bevorder en kalsiumvrystelling verbeter deur verskeie ioonkanaalgene te teiken. Hierdie bevindings is ook in muis- en rotmodelle waargeneem. 26,35,36 Die inhibisie van miR-1 via lentivirale-gebaseerde antimiR-1-infeksies het die atriale effektiewe refraktêre periode aansienlik verleng en die kaliumspanning-omheinde kanaal (KCN) E1- en B2-uitdrukking, 2 teikengene van miR-1 . 26

Aterosklerose studies is uitgevoer in Watanabe oorerflike hiperlipidemiese hase sedert hul ontwikkeling/ontdekking in die 1970's. Intussen is 2 gevorderde stamme gegenereer: een wat spontane koronêre aterosklerose (Watanabe heritable hyperlipidemic-CA) alleen toon en die ander wat miokardiale infarksie (Watanabe oorerflike hiperlipidemie-MI) toon. 54,55 Ten spyte van sekere verskille van menslike patofisiologie, kan hierdie diermodelle nuttige hulpmiddels wees vir die ondersoek van nuwe geneesmiddelkandidate. Daar was egter tot dusver geen verslae oor die profiele van die effek van miRNA, ander klasse van ncRNA, of hul inhibeerders in Watanabe-konyne nie.

Niemenslike primaatstudies

Chroniese hartversaking, subakute MI-modelle, sowel as modelle van aterosklerose is ook bestudeer in nie-menslike primate 56,57, maar as gevolg van etiese en finansiële kwessies, word primate nie gereeld in kardiovaskulêre navorsing gebruik nie.

Die transkripsiefaktor SREBP (sterol-respons element-bindende proteïen) reguleer gene betrokke by cholesterol biosintese, soos ABCA1 (ATP-bindende kasset vervoerder A1). ’n Verlies aan ABCA1-uitdrukking kan Tangier-siekte veroorsaak, wat gekenmerk word deur ’n lae vlak van sirkulerende HDL. 58 Najafi-Shoushtari et al en Rayner et al het getoon dat die menslike SREBP genoom lokus nie net mRNA transkribeer nie, maar ook 2 miRNAs, miR-33a en miR-33b. MiR-33 inhibeer die uitdrukking van ABCA1, wat lei tot sirkulerende HDL-C-vermindering en dus die stilte van miR-33 verhoog HDL-C-uitdrukking in 'n muismodel. 37–39 Ten spyte van die belowende resultate van die ontwikkeling van miR-33 as 'n terapeutiese teiken teen dislipidemie en aterosklerose, is die kliniese vordering daarvan beperk. MiR-33b, wat geënkodeer is uit die SREBP1 geen lokus, bestaan ​​net in groot diere en nie in muise nie. Hierdie verskil kan ook die resultate wat bestudeer is met behulp van uitklopmuismodelle of insulienrespons-eksperimente in muise aansienlik beïnvloed. 59 Om hierdie probleem op te los, het Rayner et al 27 2'-fluoro/-O-methoxyethyl (2'-F/MOE)-gemodifiseerde antimiR-33a/b onderhuids ingespuit om Afrika-groenape te behandel (Chlorocebus aethiops) met dislipidemie. Hulle het dieselfde resultate gevind as wat in die muismodel waargeneem is: die afbreek van miR-33a/b het ABCA1-uitdrukking en plasma HDL-C-vlakke verhoog. Interessant genoeg, buiten cholesterolmetabolisme, het hulle ook gevind dat gene betrokke by vetsuuroksidasie en biosintese gereguleer word. Hierdie effekte het gelei tot die vermindering van plasma VLDL (baie lae digtheid lipoproteïen) trigliseriedvlakke, 'n nuwe bevinding wat nie in die muismodel waargeneem is nie. 27

Nog 'n studie het onderhuidse toediening van kort saadgerigte 8-meer antimiRs in vetsugtige Afrika-groenape gebruik. 28 In hierdie studie is die de-onderdrukking van verskeie miR-33 teikengene, insluitend ABCA1m waargeneem, plasma HDL-C vlakke is verhoog, en geen nadelige effekte is opgemerk nie. 28 Hierdie 2 studies wat in nie-menslike primate uitgevoer is, het bewys gelewer dat die inhibisie van miR-33a/b om plasma HDL-C vlakke te verhoog 'n belowende terapeutiese strategie vir die behandeling van dislipidemie kan wees.

LncRNA en circRNA Studies in Groot Diere

LncRNA's is 'n ander klas ncRNA's met langer (>200 nukleotiede) maar minder gekonserveerde volgordes. 60 Met verskeie biologiese funksies, is lncRNA's beslis belowende terapeutiese teikens, maar translasiestudies in diere is moeilik met hierdie klas ncRNA as gevolg van hul swak volgordebewaring tussen spesies. 61,62 Slegs goed bewaarde lncRNA's lyk dus belowend as translasie-relevante siekteteikens vir nuwe terapieë. Inderdaad, die aantal bewaarde lncRNA's is nog redelik beperk. 8,63,64 Aangesien die graad van DNS/RNA-volgordebewaring onder verskillende spesies algemeen gebruik word om die biologiese funksies van die spesie te voorspel, 65,66 verduidelik dit hoekom lncRNA-teikeneksperimente nie gereeld in groot diere uitgevoer word nie. Studies het begin om nuwe ongeannoteerde lncRNA's in verskillende grootdiermodelle te identifiseer. Kern et al het lncRNA's van drie plaasdiere (hoender, beeste en varke) ontleed en gevind dat die helfte nie in NCBI of ander databasisse geannoteer is nie. Soos verwag, was die lncRNA's van hierdie spesies minder bewaar. Interessant genoeg het navorsers ook gevind dat baie lokus-gekonserveerde transkripsies het ('n transkripsie met 'n uiteenlopende volgorde maar dieselfde genomiese posisie as sy naburige gene), wat soortgelyke biologiese funksies tussen mekaar kan aandui. 67 By honde het Béguec et al die lncRNA-profiel van 26 verskillende weefseltipes ontleed en 'n instrument genaamd FEELnc ontwikkel. 68 Verbasend genoeg was ongeveer 900 lncRNA's (10%) hoogs bewaar tot menslike transkripsies, insluitend bekende WARM LUG, MALAT1, en NETJIES1. 68,69 Benewens hierdie spesifieke spesies, is grootskaalse lncRNA-analise in >7 uiteenlopende spesies, van sebravisse tot mense, ook gerapporteer. 70,71

Die dinamiese uitdrukking van lncRNA's in die vordering van hartsiektes is ook belangrik. In 'n vark-iskemiese hartmodel is RNA-seq uitgevoer om die uitdrukking van lncRNA's tussen gesonde en isgemiese sones van die hart te vergelyk. Vierhonderd vyftig lncRNA's is geïdentifiseer wat nie voorheen geannoteer is nie en differensieel gereguleer is na isgemiese besering. Onder hierdie nuwe lncRNA's, transkripsies wat antisense teenoor miokardiale transkripsiefaktore getranskribeer word, soos GATA4, GATA6, en KLF6, is geïdentifiseer en waargeneem om potensieel belangrike biologiese funksies in die hart te hê. 72 'n Eksperimenteel bekragtigde databasis ('n hartsiekteverwante, niekoderende RNA-databasis, HDncRNA) wat deur Wang et al ontwikkel is, bevat ongeveer 2000 lncRNA's wat met hartsiektes in 6 spesies geassosieer word, insluitend mense, knaagdiere, varke, kalwers en honde. Hierdie databasis is toegerus met 'n webgebaseerde koppelvlak wat gebruikers in staat stel om maklik na lncRNA-kandidate te soek en hulle na die oorspronklike relevante publikasies te lei. 73 Onlangs het Wu et al 74 die lncRNA-mRNA-netwerk in karotis aterosklerotiese konynmodelle ontleed en verskeie nuwe lncRNA's ontdek wat betrokke is by die siekteprogressie van ateroscelrose.

Ten spyte van die struikelblokke hierbo genoem, is daar 2 lncRNA-studies in groot diere uitgevoer. LncRNA CHROOM, geïdentifiseer deur Hennessy et al, 41 is gevind om opgereguleer te word in nie-menslike primate met aterosklerotiese vaskulêre siekte. Verdere in vitro data het getoon dat die ooruitdrukking van CHROOM in HepG2-selle het miR-33-uitdrukking verminder en die miR-33-geteikende gene gede-onderdruk, insluitend ABCA1, terwyl die inhibisie van CHROOM deur shRNA of LNA GapmeR in primêre menslike hepatosiete en HepG2-selle het teenoorgestelde effekte gehad. Net so het Li et al 42 getoon dat die uitdrukking van lncRNA H19 verhoog in 2 abdominale aorta-aneurisme-muismodelle sowel as 'n lae-digtheid lipoproteïenreseptor (LDLR) uitklop mini-vark aneurisme model. Die in vitro afslaan van H19 het die apoptotiese tempo van menslike gladdespierselle verlaag. In die algemeen is verdere en meer terapeutiese eksperimente in groot dieremodelle nodig, aangesien geen lncRNA terapeutiese benadering tot dusver in groot diere uitgevoer is nie.

Ten spyte van hul lae volgorde bewaring, het lncRNA's hoër weefselspesifisiteit. Volgens 'n studie wat deur Cabili et al gepubliseer is, kan 75 78% van lncRNA's weefselspesifiek wees, wat baie hoër is as die persentasie wat vir mRNA's aangemeld is (19%). Hierdie gevolgtrekking word ook ondersteun deur 'n onlangs gepubliseerde grootskaalse RNA-volgorde-analise wat aan die lig gebring het dat 51% tot 63% van lncRNA's weefselspesifiek is. 71 Hierdie spesifisiteit maak sekere bewaarde lncRNA's belowende teikens vir geneesmiddelontwikkeling, aangesien middels wat ontwerp is om op te tree gebaseer op weefselspesifieke lncRNA's en hul interaksie minder afgeleë buite-teiken effekte kan produseer.

Sirkelvormige RNA's (circRNAs) is nog 'n nuwe klas RNA-molekules, het 'n struktuur wat kovalent gekoppelde 3'- tot 5'-punte bevat, 76 en is hoogs volop in die menslike genoom. 2,77 'n Oorsig wat onlangs gepubliseer is, het die rol van circRNAs in kardiovaskulêre biologie opgesom. In hierdie oorsig het Aufiero et al 78 verskeie circRNAs met funksies in knaagdierhartsiektemodelle gelys. Byvoorbeeld, 'n circRNA genaamd hartverwante circRNA (HRCR) is gerapporteer om kardiobeskermende funksies te hê deur miR-223 te spons. Die ooruitdrukking van HRCR het miR-223-aktiwiteit geïnhibeer en die stroomafwaartse proteïen-ARC gede-onderdruk en dus hipertrofiese response verswak. 79 Hansen et al 80 het gerapporteer dat 'n sirRNA genoem het ciRS-7 (tans genoem Cdr1as) kan as 'n miRNA-spons dien en by hartsiektes betrokke wees. Later, Cdr1as is verder bewys om miokardiale infarksie te bevorder deur miR-7 te spons. 81 Benewens kardiomiosiete, het Garikipati et al gedemonstreer dat die ooruitdrukking van circFndc3b in endoteel selle verhoogde angiogeniese aktiwiteit en verminder endoteel apoptose. Die kardiobeskermende meganisme van circFndc3b was om met die RNA-bindende proteïen FUS te reageer om die VEGF-A seinweg te reguleer. 82 Aangesien circRNA's uit mRNA's spruit, het verskeie studies ook onlangs gerapporteer dat lncRNA/circRNA-mRNA-miRNA-netwerke 'n belangrike rol speel in hartontwikkeling en siektes, soos AF en aterosklerose. 83–86 Byvoorbeeld, Zhang et al 86 het 7 circRNA's gevind wat in seladhesie, selaktivering en die immuunrespons funksioneer, wat 'n algehele beter begrip van die patogenese van aterosklerose verskaf het. Met die toenemende belangrikheid van masjienleeralgoritmes en kunsmatige intelligensie, hoop ons dat die beter interpretasie van sulke netwerkinteraksies kan lei tot 'n verbeterde begrip van ncRNA-netwerke en hul uitwerking op siektes. Met die hulp van netwerkvoorspelling, Cdr1as Daar is ook getoon dat dit neuronale aktiwiteit in breine reguleer deur 'n spesifieke ncRNA-regulerende netwerk saam met die lncRNA te vorm Cyrano en miR-7/miR-671. 87 Hoë volgorde bewaring, oorvloedige hoeveelheid en 'n hoër stabiliteit as mRNA is al die ander voordele van circRNA in terme van sy potensiaal om in groot dieremodelle bestudeer te word en die toekomstige oorweging daarvan as 'n terapeutiese teiken by mense. 88–90 Verskeie studies het gerapporteer dat 15% tot 30% van circRNAs tussen 3 hoofspesies bewaar word: muis-mens, muis-vark en vark-mens. 91–93

Menslike EHT'e en Lewende Miokardiale Snye

Alhoewel data van groot dieremodelle meer voorspellend vir menslike kardiovaskulêre siektes kan wees, het hierdie studies ook steeds sekere beperkings. Groot diere benodig byvoorbeeld groter teelruimte en hoër onderhoudskoste, en eksperimentele ingrypings kan tydrowend wees en laat nie hoë herhaling toe nie. Sulke omstandighede maak dit moeilik vir navorsers om genoeg monsters binne 'n redelike tyd te versamel om statistiese betekenisvolheid te verkry. 12,94 Boonop het groot diere langer dragtye, wat dit moeilik maak om geen-uitklop-/uitklop-modelle te genereer, alhoewel die onlangse opkoms van die CRISPR/Cas9-tegniek (gegroepeer gereeld tussenpasiëring kort palindromiese herhalings/Cas9) tegniek kan help om hierdie probleem op te los . 11,95 As gevolg van die beperkings hierbo genoem, kan EHT en lewende miokardiale snymodelle afkomstig van menslike selle of weefsels dien as 'n brug tussen in vitro en in vivo modelle (Figuur 2). 96,97

Figuur 2. Werkvloei van 2 3-dimensionele ex vivo modelle, gemanipuleerde hartweefsels (EHT's) en lewende miokardiale skywe.A, Somatiese selle word geïsoleer uit menslike bloedselle of velselle, herprogrammeer in menslike geïnduseerde pluripotente stamselle (hiPSCs), en gedifferensieer in hiPSC-afgeleide kardiomiosiete (hiPSC-CMs). Die hiPSC-CM's word op die steiers gesaai om klop EHT's te genereer. In vergelyking met 'n 2-dimensionele selkultuurstelsel, vertoon EHT's 'n beter struktuur en volwasse fenotipes wat soortgelyk is aan volwasse CM's. Deur die styfheid van die steier te verander, kan verskillende siektemodelle, soos hipertrofiese kardiomiopatie, vasgestel word. EHT's kan verder getoets word vir dwelms of as geenmodulasie-instrumente. Nie net afkomstig van gesonde mense nie, EHT's kan ook gemaak word van pasiënte wat aan hartsiektes ly vir siektemodellering. B, Om lewende miokardiale skywe voor te berei, word klein of groot soogdierharte, insluitend menslike harte, uitgeplant. Die linkerventrikels of ander dele van die hart word dan geïsoleer en in klein weefselblokkies gedissekteer. Honderd tot vierhonderd mikrometer miokardiale skywe word gesny en gebruik vir verdere funksionele studies, byvoorbeeld deur met verskillende middels te behandel of die spanning aan te pas wat die sametrekking van die miokardiale skywe stimuleer. Soortgelyk aan EHT's, kan die lewende miokardiale snye ook van siek dieremodelle voorberei word. Doxo dui op doksorubisien ISO, isoproterenol en PE, fenielefrien.

Sedert die generering van mens-geïnduseerde pluripotente stamselle (hiPSCs) gerapporteer is, het 98,99 studies oor die differensiasie van hiPSCs in verskeie funksionele seltipes, insluitend kardiomiosiete, vinnig in getal toegeneem. 100,101 HiPSC-afgeleide kardiomiosiete (hiPSC-CM's) wat in monolaagstelsels gekweek word, toon egter onvolwasse en fetale fenotipes wat nie die volwasse hart weerspieël nie en versuim om chroniese hartsiekte-fenotipes te rekapituleer. 102 EHT's saamgestel uit hiPSC-CM's en bykomende ondersteunende selle in 'n 3-dimensionele kultuurstelsel kan 'n volledig ontwikkelde hart onder ooreenstemmende siektemodelle beter weerspieël. 103,104 Die EHT, soms gemeng met fibroblast- of endoteelselle, het verbeterde volwasse fenotipes getoon, insluitend staafvormige kardiomiosiete met goed georganiseerde sarkomeerstrukture, sistoliese sametrekking en inotropiese reaksies op geneesmiddelstimulasie. 105,106 Tiburcy et al 105 isoprenalien, 'n β1- en β2-adrenoreseptoragonis vir hiPSC-CM EHT's, verder behandel om hipertrofiese response na te boots, wat die moontlikheid gedemonstreer het om EHT as hartversaking en kardiale herstelmodelle te gebruik. HiPSC's kan nie net deur gesonde individue gegenereer word nie, maar ook van pasiënte wat aan hartsiektes ly. Prondzynski et al 107 het EHT's gegenereer vanaf hipertrofiese kardiomiopatie pasiënt-afgeleide hiPSC-CM's, en die hipertrofiese kardiomiopatie-EHT's het fenotipes getoon, insluitend harthipertrofie, hiperkontraktiliteit en hoër miofilament kalsium sensitiwiteit. Die algehele resultate het die moontlikheid getoon om EHT's in die nabye toekoms in persoonlike medisynebenaderings te gebruik.

Onlangs het lewende miokardiale sny tegnologie na vore gekom as 'n ander opsie vir verdere eksperimentele evaluering voor en bykomend tot groot diermodelle of kliniese proewe. Hier word hartweefsel in dun skywe gesny deur 'n vibratoom, en sulke skywe verskaf 'n 3-dimensionele struktuur wat verskeie seltipes bevat en vertoon behoue ​​elektriese en meganiese verbinding.Hierdie tegnologie het bewys dat dit 'n platform is vir die bestudering van elektrofisiologie, dwelmsifting, kardiale fibrose en hartversaking in hartskywe wat van verskeie diere verkry word, insluitend rotte, proefkonyne, hase, honde en onlangs ook mense. 108-113 Watson et al het 'n gedetailleerde protokol beskryf vir die voorbereiding van volwasse ventrikulêre miokardiale skywe met behoue ​​kardiomiosiet lewensvatbaarheid (97%) en funksionaliteit vir tot 1 week. Die dikte van elke miokardiale sny is 100 tot 400 µm, wat toegelaat het dat suurstof en klein verbindings deur die sny kan diffundeer. Boonop maak ultradun skywe dit ook moontlik om baie eksperimente uit dieselfde hart te produseer en verminder dus die aantal diere wat in 'n studie benodig word. 97 114

Kliniese ervarings met kodering en nie-koderende RNA-terapie

Sedert die biologiese relevansie van ncRNA's erken is, het die kardiovaskulêre gemeenskap begin om moduleerders van hierdie teikens te ontwikkel as 'n nuwe generasie kardiovaskulêre terapeutika. Trouens, RNA-gebaseerde terapeutika is vir die eerste keer in die 1990's ontwikkel, en die eerste Food and Drug Administration-goedgekeurde RNA-gebaseerde geneesmiddel dateer terug na 1998, toe 'n 21-meer fosforothionaat oligonukleotied (fomivirsen) wat CMV IE-2 proteïen teiken, voedsel ontvang het en dwelmadministrasie-goedkeuring. 14 Sedertdien is nog 6 verbindings deur die Food and Drug Administration goedgekeur gebaseer op 'n anti-RNA-meganisme wat mRNA's teiken wat relevant is vir ouderdomsverwante makulêre degenerasie, neuromuskulêre versteurings, familiële hipercholesterolemie en transtiretien-gemedieerde amiloïdose, wat betrokke is by hart mislukking as gevolg van die hartafsetting van TTR amiloïed fibrille. 115 Byna 50% van hierdie innoverende middels het dus op indikasies in die kardiovaskulêre veld gefokus (Tabel 4). Mipomersen ('n GapmeR gerig op Apolipoproteïen B-100) word egter nie meer in die Verenigde State bemark nie, en 2 onlangs goedgekeurde middels vir die behandeling van transtiretien-gemedieerde amiloïdose moet steeds kliniese sukses toon in 'n mededingende mark, waarin die hoë koste behandeling kan 'n groot nadeel wees. 116

Tabel 4. FDA-goedgekeurde antisense middels

AMD dui op ouderdomverwante makulêre degenerasie CMV, sitomegalovirus DMD, Duchenne spierdistrofie hATTR, oorerflike transtiretien-gemedieerde amyloïdose hoFH, homosigotiese familiële hipercholesterolemie en SMA, spinale spieratrofie.

Huidige kliniese antisense-gebaseerde geneesmiddelontwikkelings is talle (onlangs hersien deur Bennet et al 13 ) en sluit in CVD-teikens soos PCSK9 in LDL-C-hipercholesterolemie (NCT01350960, NCT02597127), Apolipoproteïen CIII in familiale applikasie-sindroom-sindroom ontvang die EU beskikbaar via die Early Access Program in die VSA, NCT 03544060), of Lipoproteïen A (Novartis/Akcea Therapeutics, NCT04023552 Amgen, NCT03626662). Boonop is verdere middels tans in 'n ontwikkelingspyplyn vir die behandeling van CVD, wat onder andere mRNA's vir angiopoëtien 3, faktor XI of apolipoproteïen(a) teiken. 117–119 Al hierdie bogenoemde terapeutiese entiteite gebruik 'n RNAseH-afhanklike meganisme of siRNA/RNAi om die uitdrukkingsvlakke van die teikentranskripsie te onderdruk. Ander middels wat mRNA's teiken maak gebruik van splitsingsmodulasie om die uitdrukking van 'n voordelige funksionele transkripsie oor 'n veranderde of ontbrekende splysieproduk in die betrokke siekte te verbeter, soos distrofien in Duchenne-spierdistrofie of die SMN-proteïen in spinale spieratrofie (sien Eteplirsen en Nusinersen in Tabel 4). Splitsingsmodulasie sal in beginsel 'n relevante meganisme vir lncRNA's en circRNA's wees wanneer hulle in die toekoms as farmaseutiese middels geteiken word. Soos hierbo beskryf, is hierdie meganismes tans onderwerpe van intensiewe navorsing.

MiRNA's het tot dusver die kliniese stadium bereik, hoewel kliniese studies wat miRNA's gebruik of teiken, steeds skaarser is as antisense-strategieë vir mRNA's. Die meerderheid resultate van die Amerikaanse databasis van kliniese proewe (www.clinicaltrials.gov) verwys na die evaluering van miRNA as biomerkers of prognostiese faktore. Nogtans is 'n aantal miRNA's tans onder kliniese ontwikkeling en word hieronder opgesom (Tabel 3).

Orgaanfibrose

'n Verbinding wat miRNA-29a in kliniese ontwikkeling naboots, het ten doel om die funksionele vlakke van miRNA-29a te verhoog om fibrose te bekamp. Daar is getoon dat MiRNA-29a kollageenuitdrukking verminder en word afgereguleer in verskeie fibrotiese toestande, insluitend, maar nie beperk nie tot, fibrose van die hart, longe, lewer en niere en sistemiese sklerose. 120 Een vroeë omvattende studie het aan die lig gebring dat miR-29a 'n belangrike rol speel in die patologiese hermodellering van die hart na miokardiale infarksie. 121 Onlangs, en in teenstelling met die voorgestelde voordelige effekte van miR-29a-ooruitdrukking, is dit gedemonstreer dat kardiomiosiet-uitgedrukte miR-29 patologiese hermodellering van die hart bevorder deur Wnt-sein te aktiveer. 122 MiRNA-29a-nabootser, genaamd Remlarsen (MRG-201), 123 is suksesvol getoets in 'n fase I-studie met geneesmiddeltoediening aan 54 gesonde vrywilligers (NCT02603224), tans word 'n fase II-kliniese proef wat op kutane fibrose gerig is, uitgevoer om te bepaal of die stof kan die vorming van veselagtige littekenweefsel in sekere velsiektes beperk (NCT03601052). Hierdie studies kan die weg baan na die ondersoek van hierdie middel in idiopatiese pulmonale fibrose en ander toestande van patologiese fibrose.

MiR-21 is 'n profibrotiese molekule wat in 2008 ontdek is en wat tans in 'n kliniese fase II-proef geteiken word. AntimiR-21 is beskryf as sterk antifibroties 7 en is tans klinies ontwikkel vir die behandeling van Alport-sindroom, 'n kollageen IV-defek wat fibrotiese niersiekte, gehoorverlies en sigprobleme veroorsaak. 124–126 'n Natuurgeskiedenisstudie en 'n eerste-in-mens-verhoor is albei suksesvol voltooi (NCT03373786). 'n Fase II-proef vir die assessering van veiligheid, verdraagsaamheid en doeltreffendheid om die afname in nierfunksie te verminder, is begin in 'n gerandomiseerde, dubbelblinde, placebo-beheerde ontwerp, met weeklikse subkutane inspuitings van óf die toetsstof óf 'n placebo oor 48 weke (NCT02855268).

Isgemiese toestande en hartversaking

Nog 'n verbinding wat bedoel is om die groei van nuwe bloedvate te bevorder deur miR-92a (MRG-110) te inhibeer, is tans onder kliniese ontwikkeling. Die voordelige effekte van miR-92a-stilte in iskemiese harttoestande en vir die bevordering van angiogenese, soos waargeneem in muise en varke, is hierbo beskryf. 'n Fase I-proef vir die ondersoek van 'n intradermale inspuiting van miR-92 antimiR in wondgenesing en insnydingskomplikasies het onlangs werwing voltooi (NCT03603431). Die veiligheid van antimiR-92-toediening via binneaarse inspuiting is by gesonde vrywilligers beoordeel, maar die resultate van die studie is nog nie publiek beskikbaar nie (NCT03494712).

Onlangs is 'n kliniese dosis stygende en dosis herhaling fase 1b studie geïnisieer om die veiligheid, farmakokinetika en farmakodinamiese parameters van 'n antimiR-132 inhibeerder in stabiele hartversaking pasiënte (NCT04045405) te bepaal. Prekliniese data het voorgestel dat hierdie miRNA 'n sleutelrol speel in die patologiese kardiale hermodelleringsproses. 23,40

Ander kliniese ontwikkelings

Nog 'n inhibeerder teen 'n miRNA, miR-155, wat voorheen ook beskryf is in kardiovaskulêre siekte, 127 word ontwikkel vir die behandeling van verskeie bloedkankers, insluitend, maar nie beperk nie tot, T-sel limfoom en chroniese limfositiese leukemie. Hierdie LNA-antimiR, genaamd Cobomarsen (MRG-106), het kliniese fase II bereik met 2 tans aktiewe proewe, PRISM en SOLAR (NCT03713320, NCT03837457). Twee ander ontwikkelings maak staat op die verhoging van die funksie van miR-16 (NCT02369198) en miR-34a (NCT01829971) in pasiënte met verskeie gevorderde maligniteite. 'n Fase I-proef met behulp van TargomiRs (miniselle gerig op EGFR) gelaai met miR-16-gebaseerde nabootsende mikroRNA is voltooi met bemoedigende resultate. 128 Die effekte van TargomiRs in pasiënte met kwaadaardige pleurale mesothelioom vereis egter verdere ondersoek. Een fase I-proef met 'n miR-34a-nabootsing (MRX34) wat 155 proefpersone ingeskryf het, is deur die borg teruggetrek na 5 ernstige immuunverwante nadelige gebeurtenisse (NCT01829971). Dit illustreer die potensiële immunogenisiteit en buite-teiken-effekte wat deur sommige RNA-middels geïnduseer word. 129

’n AntimiR-122 is geëvalueer vir die behandeling van hepatitis C by pasiënte wat nie op gepegileerde-interferon-alfa en ribavirien gereageer het nie, maar die kliniese ontwikkeling daarvan het tot dusver nie verder as fase II voortgegaan nie (NCT02508090, NCT02452814).

Geneesmiddelformulerings en verskillende toedieningsroetes

Soos hierbo genoem, het ncRNA-gebaseerde terapieë onlangs toenemende aandag getrek. In vergelyking met ander geneesmiddelformulerings, soos klein molekules of teenliggaampies, het RNA-terapieë verskeie voordele. Vorige studies het getoon dat baie proteïen-teikens (80%–85% van die proteïenkoderende gene) steeds "onbederfbaar" is, meestal steierproteïene of transkripsiefaktore. 130,131 Daarteenoor bestaan ​​98% van die menslike transkripsie uit nie-koderende RNA's, daarom bied RNA-terapie behandelingsopsies aan daardie siektes met "onbederfbare" proteïenteikens. Geneesmiddelweerstand van 'n ABC-vervoerder of van epigenetiese modifikasies is 'n ernstige probleem in die behandeling van kanker of aansteeklike siektes, 132,133, terwyl ncRNA-terapie tot dusver geen sulke probleme het nie. Nog 'n voordeel van ncRNA is die parakriene effek. Vorige studies het getoon dat verskeie seltipes in die kardiovaskulêre stelsel verskillende soorte vesikels genereer, soos mikrovesikels en eksosome, wat in staat is om die ncRNA's na ander organe of seltipes te vervoer. Die parakriene effek verskaf ncRNA-gebaseerde middels met breër teikens vir die hele seinweg in vergelyking met teenliggaampies of klein molekules. 134,135 Daarbenewens, met verskillende chemiese modifikasies, kan die halfleeftyd van ncRNA-middels lank wees (weke tot maande), en dus kan pasiëntdoseringsfrekwensie verminder word in vergelyking met klein molekules of teenliggaampies. 136,137 'n Verdere voordeel is dat een of meer volledige siekteweg gemoduleer kan word deur niekoderende RNA-gebaseerde terapeutiese benaderings. 138

Met betrekking tot chemiese modifikasies is die miRNA-agoniste en -antagoniste wat in die vorige afdelings genoem is almal sintetiese oligonukleotiede maar behoort aan verskillende chemiese klasse. Dit wissel van klein dubbelstring-RNA's (siRNA—bv. Patisiran en miRNA-nabootsing—bv. MesomiR) oor antisense DNA/RNA-oligonukleotiede met ruggraatmodifikasies (bv. Fomivirsen, Eteplirsen). Verder, die tweede generasie antisense oligonukleotiede (ASO's), wat suikermodifikasies bevat soos 2'-O-methoxyethyl (2'-O-MOE, bv. Mipomersen) of 'n 2'-4' eterbrug wat lei tot 'n bisikliese suiker deel, gewoonlik na verwys as LNA, is ook goed ontwikkel. Om RNAse H-splitsing te handhaaf, moet hierdie terapeutiese ASO's 'n komplementêre volgorde-teiken hê wat bestaan ​​uit DNA wat deur die gemodifiseerde residue geflankeer word. Hierdie entiteite word GapmeR of chimeriese LNA genoem (bv. Miravirsen, Cobomarsen Figuur 1).

Die eerste stappe in kliniese ontwikkeling het hoofsaaklik gebruik gemaak van plaaslike toediening, byvoorbeeld, intravitreal vir oogsiektes, intradermaal vir wondgenesing en intratekaal vir neurologiese afwykings. Intussen word sistemiese toedienings, soos binneaarse of subkutane inspuiting, verkies vir die meeste kliniese toepassings, maar laat die vraag ontstaan ​​van weefselspesifieke geneesmiddellewering teenoor buite-teiken-effekte. 139 Huidige nie-kliniese studies in hartsiekte-modelle kan gebruik maak van plaaslike toediening, insluitend intrakoronêre of intramiokardiale inspuiting, maar die vertaling daarvan in die kliniese werklikheid bly twyfelagtig en moeilik (Figuur 1). Daarom is verskillende strategieë ontgin om terapeutiese ASO te rig om weefsel en seltipes te teiken. In CVD kan dit belangrik wees, afhangende van die patomeganisme van die kliniese entiteit, om die geneesmiddel aan die kardiomiosiete, endoteelselle, kardiale fibroblaste of die immuunselle in die hart te lewer. Virale en nievirale benaderings is die onderwerpe van deurlopende ondersoeke in RNA-gebaseerde diagnostiese en terapeutiese strategieë vir CVD, soos onlangs deur Lu en Thum hersien. 6 Terwyl die rigting van ASO-middels na die lewer via GalNAc-vervoeging of liposomale formulering reeds 'n kliniese stadium bereik het, insluitend Food and Drug Administration-goedkeuring (Patisiran), is getoon dat mikroRNA-nabootsers spesifiek kankerselle bereik via liposomale (MRX34) of TargomiR-formulerings ( MesoMiR). Die aflewering van kardiale-spesifieke ASO-middel bly egter 'n uitdaging wat in die toekoms opgelos moet word (Figuur 1).

In 'n sistematiese studie wat 135 groot dierevarke betrek het, is potensiële verskille tussen binneaarse en intrakoronêre toedienings van antimiR-132 getoets. 23 Gebaseer op gedetailleerde plasma PK en weefsel opname metings van die antimiR-132, kon dit aangetoon word dat daar geen beduidende PK verskille tussen hierdie 2 roetes van toediening was nie. Of dit egter na ander antimiR-molekules en/of chemieë vertaal kan word, moet egter nog getoets word.

Virusgebaseerde benaderings, veral via adeno-geassosieerde virus, is tans kragtige instrumente vir menslike geenterapie, maar uitdagend as gevolg van hoë teenliggaampies wat by baie pasiënte gevind word, wat die aantal kwalifiserende pasiënte wat kliniese toetse betree, beperk. 140–143 'n Moontlike oplossing kan nuwe kapsied-gemodifiseerde adeno-geassosieerde virusse wees met verbeterde spesifisiteit vir aflewering aan die kardiovaskulêre stelsel en/of 'n verminderde vermoë om 'n immuunrespons te verhoog. 144–146 Kardiale spesifieke afleweringstrategieë word ook tans ontwikkel in die deurlopende EU-projek CardioReGenix. 147

Ten slotte, die meeste studies is gewoonlik uitgevoer in enkel-model stelsels in klein knaagdiere, wat kliniese vertaling belemmer. Kardiovaskulêre studies in grootdier-, nieknaagdierstudies of menslike ex vivo-studies kan meer voorspellend wees vir toekomstige kliniese sukses in volgende generasie ncRNA-gebaseerde terapeutika. 97

Gevolgtrekkings

Hier het ons die moderne ncRNA-gebaseerde terapieë beskryf wat op die hart gerig is, wat wissel van grootdier-hartsiektemodelle tot kliniese studies (Figuur 3).

Figuur 3. Prosesse van niekoderende RNA (ncRNA)-gebaseerde geneesmiddelontwikkeling. Nuwe ncRNA-kandidate word gekies uit 'n RNA-volgende profiel of ander ncRNA benader 40,148 en dan bekragtig in kardiovaskulêre selle (in vitro). Na basiese karakterisering word die ncRNA-kandidate verder in dieremodelle (in vivo) ondersoek. Verskeie patofisiologiese dieremodelle van kardiovaskulêre komplikasies is beskikbaar in verskillende spesies, wat wissel van klein tot groot diere, deur die toepassing van chirurgiese tegnieke, genetiese ingenieurswese of dieetveranderinge. Sommige effektiewe dog nie-toksiese ncRNA-kandidate word gekies vir verdere kliniese ontwikkeling. Suksesvolle oorgange van prekliniese na kliniese studies is egter oor die algemeen klein in getal. Dikwels is in vitro modelle maklik om toe te pas, maar het beperkte kliniese relevansie terwyl in vivo modelle hoër kliniese relevansie het, hulle is uitdagend om uit te voer en duur. Om die translasiedoeltreffendheid van ncRNA-gebaseerde terapeutiese menslike geïnduseerde pluripotente stamselle en/of ander menslike kardiovaskulêre seltipes en lewende miokardiale snye te verhoog, kan kragtige instrumente wees om die gaping tussen in vivo en kliniese ontwikkeling te oorbrug. IRI dui op iskemie-herperfusiebesering en TAC, transversale aorta-vernuwing.

Die verbetering van bioinformatiese gereedskap verbeter ons begrip van die onderliggende meganismes van die lncRNA/circRNA-mRNA-miRNA netwerk in CVDs. Dit ondersteun dan die ontdekking van nuwe RNA-molekules, wat terapeutiese teikens kan wees en meer en hopelik verbeterde behandelingsopsies aan CVD-pasiënte in die toekoms bied. Verder het groot diermodelle onlangs toenemend aandag gekry vir hul hoë kliniese relevansie, maar alhoewel hulle nader aan mense as knaagdiere is, bly daar beperkings op die vlak van metabolisme of immuunstelsel, wat veroorsaak dat dierestudies in die geheel nie ten volle voorspellend is nie. vir veiligheid en doeltreffendheid by mense. Ten spyte van groot pogings in die laaste paar dekades, word belowende kliniese kandidate steeds uit die ontwikkelingspyplyn uitgeskakel weens veiligheidsredes en/of 'n gebrek aan doeltreffendheid in alle kliniese stadiums. Daarom vorm die vinnige ontwikkeling van menslike ex vivo-stelsels, soos EHT's en lewende miokardiale skywe, nuwe waardevolle instrumente om insig in die vertaalbaarheid van prekliniese studies te verbeter. Sulke ex vivo modelle sal ook uiteindelik bydra tot 'n vermindering van die aantal diere wat in dierestudies in farmaseutiese geneesmiddelontwikkeling gebruik word. Nuwe afleweringstegnieke met die doel om weefsel- en/of seltipe-spesifisiteit te verhoog en sodoende buite-teiken-effekte te verlaag, sal die veiligheid van nuwe ontwikkelingsmiddels verbeter. Boonop is 'n groter begrip van sekere interindividuele en geslagsverskille 'n vereiste voor vordering in persoonlike medisyne.

Benewens die ontwikkeling van tegnieke in die laboratorium, is dit ook belangrik om hierdie nuwe gereedskap en metodes te valideer en te kwalifiseer om gestandaardiseerde toetse te bereik wat vir owerhede aanvaarbaar kan wees binne die regulatoriese prosedure.

Samevattend, gebaseer op (1) in vitro-modelle, (2) knaagdiermodelle, (3) grootdiermodelle, (4) ex vivo-studies met menslike selle en weefsels, en (5) nuwe afleweringstelsels, het ncRNA-terapieë die potensiaal om aansienlike vordering in die ontwikkeling van volgende generasie terapeutika vir kardiovaskulêre siekte moontlik te maak (Figuur 3).


Gekweekte selle: kenmerke, groeiparameters en sinchronisasie

1. Selle wat nie normaalweg in vivo prolifereer nie, kan in kulture gekweek en geprolifereer word.

2. Sel-tot-sel-interaksies in die gekweekte selle is baie laag.

3. Die driedimensionele argitektuur van die in vivo selle word nie in gekweekte selle gevind nie.

4. Die hormonale en voedingsinvloed op die gekweekte selle verskil van dié op die in vivo selle.

5. Gekultiveerde selle kan nie gedifferensieerde en gespesialiseerde funksies verrig nie.

6. Die omgewing van die gekweekte selle bevoordeel proliferasie en verspreiding van ongespesialiseerde selle.

Omgewingsinvloed op gekweekte selle:

Die omgewingsfaktore beïnvloed die selle in kultuur sterk. Die belangrikste roetes waardeur omgewingsinvloed plaasvind, word gelys:

i. Die aard van die substraat of fase waarin selle groei. Vir monolaagkulture is die substraat 'n vaste stof (bv. plastiek) terwyl dit vir suspensiekulture 'n vloeistof is.

ii. Die samestelling van die medium wat gebruik word vir kweekvoedingstowwe en fisies-chemiese eienskappe.

iii. Toevoeging van hormone en groeifaktore.

iv. Die samestelling van die gasfase.

v. Die temperatuur van kultuurinkubasie.

Die biologiese en ander aspekte van gekweekte selle met spesiale verwysing na die volgende parameters word kortliks beskryf:

4. Metabolisme van gekweekte selle.

5. Aanvang van selkultuur.

6. Evolusie en ontwikkeling van sellyne.

Sel Adhesie:

Die meeste van die selle wat uit soliede weefsels verkry word, groei as aanhegte monolae in kulture.Die selle, afkomstig van weefselaggregasie of subkultuur, heg aan die substraat en begin dan prolifereer. In die vroeë dae van kultuurtegnieke is effens negatief gelaaide glase as substrate gebruik. In onlangse jare is plastiek soos polistireen, na behandeling met elektriese ioon-ontlading, in gebruik.

Die seladhesie vind plaas deur seloppervlakreseptore vir die molekules in die ekstrasellulêre matriks. Dit blyk dat die selle matriksproteïene afskei wat op die substraat versprei. Dan bind die selle aan matriks deur reseptore. Dit is 'n algemene waarneming dat die substrate (glas of plastiek) met vorige selkultuur gekondisioneer is om beter oppervlakarea vir adhesie te verskaf.

Sel adhesie molekules:

Drie groepe proteïene waarna gesamentlik verwys word as seladhesiemolekules (CAMs) is betrokke by die sel-sel adhesie en sel-substraat adhesie.

Sel-sel adhesie molekules:

Hierdie proteïene is hoofsaaklik betrokke by sel-tot-sel interaksie tussen die homoloë selle. CAM's is van twee tipes - kalsium-afhanklikes (cadherin’s) en kalsium-onafhanklike CAM's.

Hierdie molekules bemiddel die selsubstraat-interaksies. Integrin’s besit reseptore vir matriksmolekules soos fibronektien en kollageen.

Dit is lae affiniteit transmembraanreseptore. Proteoglikane kan aan matrikskollageen en groeifaktore bind. Seladhesiemolekules is aan die sitoskelette van die gekweekte selle geheg.

Selproliferasie:

Proliferasie van gekweekte selle vind plaas deur die selsiklus, wat vier afsonderlike fases het (Fig. 35.1)

In hierdie fase (M = mitose) skei die twee chromatiede, wat die chromosome uitmaak, na dogterselle.

Hierdie gaping 1-fase is hoogs vatbaar vir verskeie beheerprosesse wat bepaal of sel na DNA-sintese moet voortgaan, weer die siklus moet betree of die koers moet neem na differensiasie.

Hierdie fase word gekenmerk deur DNA-sintese waarin DNA-replikasie plaasvind.

Dit is gaping 2 fase wat die sel voorberei vir herbetreding in mitose. Die integriteit van die DNS, die herstel daarvan of intrede in apoptose (geprogrammeerde seldood) indien herstel nie moontlik is nie, word bepaal deur twee kontrolepunte - aan die begin van DNS-sintese en in G2 fase.

Beheer van selproliferasie:

Vir die selle in kultuur reguleer die omgewingseine die selsiklus en daardeur die selproliferasie. Lae digtheid van die selle in 'n medium tesame met die teenwoordigheid van sekere groeifaktore (bv. epidermale groeifaktor, plaatjie-afgeleide groeifaktor) laat die selle toe om die selsiklus te betree.

Aan die ander kant inhibeer hoë seldigtheid en verdringing van selle die selsiklus en daardeur proliferasie. Behalwe vir die invloed van die omgewingsfaktore, reguleer sekere intrasellulêre faktore ook die selsiklus. Byvoorbeeld, sikliene bevorder terwyl p53- en Rb-geenprodukte selsiklus inhibeer.

Seldifferensiasie:

Die verskillende selkultuurtoestande bevoordeel maksimum selproliferasie en voortplanting van sellyne.

Onder die faktore wat selproliferasie bevorder, is die volgende belangrik:

ii. Lae Ca 2+ konsentrasie

iii. Teenwoordigheid van groeifaktore

Vir die proses van seldifferensiasie om plaas te vind, moet die proliferasie van selle ernstig beperk word of heeltemal afgeskaf word.

Seldifferensiasie kan bevorder (of geïnduseer) word deur die volgende faktore:

ii. Hoë Ca 2+ konsentrasie.

iii. Teenwoordigheid van differensiasie-induseerders (bv. hidro- en skykortisoon, senuweegroeifaktor).

Soos uit bogenoemde blyk, word verskillende en byna opponerende toestande vir selproliferasie en vir seldifferensiasie vereis. As seldifferensiasie dus vereis word, is twee afsonderlike stelle toestande nodig.

1. Om selproliferasie te optimaliseer.

2. Om seldifferensiasie te optimaliseer.

Handhawing van differensiasie:

Dit word nou erken dat die selle hul oorspronklike en oorspronklike funksies lank behou wanneer hul driedimensionele strukture behoue ​​bly. Dit is moontlik met orgaankulture. Orgaankulture kan egter nie gepropageer word nie.

In onlangse jare het sommige werkers probeer om driedimensionele strukture te skep deur monolaagkulture te versmelt. Verder, in vitro kweek van selle op of in spesiale matrikse (bv. sellulose, kollageengel, matriks van glikoproteïene) lei ook tot selle met driedimensionele strukture.

Dedifferensiasie verwys na die onomkeerbare verlies van gespesialiseerde eienskappe van selle wanneer hulle in vitro gekweek word. Dit gebeur wanneer die gedifferensieerde in vitro-selle hul eienskappe verloor (Fig. 35.2). In die in vivo situasie gee 'n klein groepie stamselle aanleiding tot stamvaderselle wat in staat is om gedifferensieerde selpoel te produseer (Fig. 35.2A).

Aan die ander kant, in die in vitro-kultuurstelsel, word stamvaderselle hoofsaaklik geproduseer wat voortgaan om te prolifereer. Baie min van die nuutgevormde selle kan gedifferensieerde selle vorm (Fig. 35.2B). Die netto resultaat is 'n geblokkeerde differensiasie. Dedifferensiasie impliseer 'n onomkeerbare verlies van gespesialiseerde eienskappe van die selle. Aan die ander kant verwys de-aanpassing na die herinduksie van gespesialiseerde eienskappe van die selle deur gepaste toestande te skep.

Metabolisme van gekweekte selle:

Die metabolisme van soogdier-gekweekte selle met spesiale verwysing na energie-aspekte word in Fig. 35.3 uitgebeeld. Die gekweekte selle kan glukose of glutamien as die bron van energie gebruik. Hierdie twee verbindings genereer ook belangrike anaboliese voorlopers.

Aangesien glukose deur glikolise afgebreek word, word laktaat hoofsaaklik geproduseer. Dit is omdat suurstof in 'n beperkte voorraad in die normale kultuurtoestande is (d.w.s. atmosferiese suurstof en 'n ondergedompelde kultuur) wat 'n anaërobiese situasie skep. Laktaat, wat in die medium afgeskei word, versamel.

Sommige hoeveelheid piruvaat wat in glikolise geproduseer word, word deur die Krebs-siklus geoksideer. 'n Klein fraksie van glukose (4-9%) gaan pentosefosfaatweg binne om ribose 5-fosfaat en reducerende ekwivalente (NADPH) vir biosintetiese weë te verskaf, bv. sintese van nukleotiede.

Glutamien is 'n belangrike bron van energie vir die gekweekte selle. Deur die werking van die ensiem glutaminase ondergaan glutamien deaminering om glutamaat en ammoniumione te produseer. Glutamaat vorm by transaminering (of oksidatiewe deaminering) a-ketoglutaraat wat die Krebs-siklus binnegaan.

Piruvaat neem hoofsaaklik deel aan transamineringsreaksie om alanien te produseer, wat maklik in die medium uitgeskei word. In die vinnig groeiende gekweekte selle is transamineringsreaksie 'n dominante roete van glutamienmetabolisme.

Deaminering van glutamien stel vrye ammoniumione vry, wat giftig is vir die gekweekte selle, wat hul groei beperk. In onlangse jare word dipeptiede glutamiel-alanien of glutamiel-glisien gebruik om die produksie van ammoniak te verminder. Verder is hierdie dipeptiede meer stabiel in die medium.

Soos reeds genoem, gaan α-ketoglutaraat verkry uit glutamien (via glutamaat) die Krebs-siklus binne en word geoksideer tot koolstofdioksied en water. Vir die behoorlike werking van Curbs-siklus word balansering van die tussenprodukte van die siklus vereis.

Twee metaboliete van Curbs-siklus, naamlik malaat en oksaloasetaat, verlaat die siklus en word onderskeidelik omgeskakel na piruvaat en fosfoenol piruvaat. Laasgenoemde twee verbindings kan weer die Krebs-siklus binnegaan in die vorm van asetiel CoA. So word die kontinuïteit van Curbs-siklus gehandhaaf. Glukose sowel as glutamien word deur die gekweekte selle gemetaboliseer om energie in die vorm van ATP te voorsien.

Aanvang van selkultuur:

Die selkultuur kan geïnisieer word deur die selle afkomstig van 'n weefsel deur ensiematiese of meganiese behandelings. Primêre kultuur is 'n selektiewe proses wat uiteindelik 'n relatief eenvormige sellyn tot gevolg het. Die seleksie vind plaas op grond van die vermoë van die selle om as monolaagkulture te oorleef (deur aan substrate te kleef) of as suspensiekulture.

Onder die gekweekte selle kan sommige selle groei en vermeerder terwyl sommige nie onder die kultuuromgewing kan oorleef nie. Die selle gaan voort om in monolaagkulture te groei totdat die beskikbaarheid van die substraat beset is.

Die term samevloeiing word gebruik wanneer die gekweekte selle noue kontak met mekaar maak deur die beskikbare groeiarea ten volle te benut. Vir sekere selle, wat sensitief is vir groeibeperking as gevolg van digtheid, hou die selle op met groei sodra samevloeiing bereik is. Die getransformeerde selle is egter ongevoelig vir samevloeiing en bly oorgroei.

Wanneer die kultuur samevloeiend raak, besit die selle die volgende karakters:

1. Die naaste morfologiese ooreenkoms met die weefsel van oorsprong (m.a.w. ouerweefsel).

2. Die uitdrukking van gespesialiseerde funksies van die selle vergelykbaar met dié van die inheemse selle.

Evolusie en ontwikkeling van sellyne:

Die primêre kultuur wat na die eerste subkultuur gekweek is, word sellyn genoem. 'n Gegewe sellyn kan gepropageer word deur verdere sub-kweek. Soos die subkulture herhaal word, oorheers die selle wat die vinnigste prolifereer, terwyl die nie-prolifererende of stadig prolifererende selle verdun sal word en gevolglik verdwyn.

Die geneties bepaalde gebeurtenis van seldelings vir 'n beperkte aantal kere (d.w.s. bevolkingsverdubbeling), gevolg deur hul dood in 'n normale weefsel, word na verwys as veroudering. Kiemselle en getransformeerde selle is egter in staat om voortdurend te prolifereer. In die in vitro kultuur kan getransformeerde selle aanleiding gee tot kontinue sellyne.

Die evolusie van 'n aaneenlopende sellyn word in Fig. 35.4 uitgebeeld. Die kumulatiewe selgetal in 'n kultuur word op die Y-as op 'n log-skaal voorgestel, terwyl die X-as die tyd in weke verteenwoordig. Die tyd vir ontwikkeling van 'n kontinue sellyn is veranderlik. Byvoorbeeld, vir menslike diploïede fibroblaste, ontstaan ​​die aaneenlopende sellyn op ongeveer 14 weke terwyl die veroudering tussen 10 en 20 weke gewoonlik na 30 en 60 selverdubbelings kan plaasvind.

Ontwikkeling van deurlopende sellyne:

Sekere veranderinge in die kultuur wat gesamentlik na verwys word as transformasie, kan aanleiding gee tot kontinue sellyne. Transformasie kan spontaan plaasvind, chemies of viraal-geïnduseer. Transformasie behels basies 'n verandering in groeikenmerke soos verlies aan kontakinhibisie, digtheidsbeperking van groei en verankeringsonafhanklikheid. Die term onsterflikheid word gereeld gebruik vir die verkryging van oneindige lewensduur aan gekweekte selle.

Die vermoë van die selle om voortdurend in sellyne te groei verteenwoordig genetiese variasie in die selle. Meestal is die verwydering of mutasie van die p 53 geen verantwoordelik vir die voortdurende proliferasie van selle. In die normale selle is die normale p 53 geen verantwoordelik vir die arrestasie van selsiklus. Die meeste van die aaneenlopende sellyne is aneuploïed, met chromosoomgetal tussen diploïede en tetraploïede waarde.

Normale selle en deurlopende sellyne:

'n Groot meerderheid normale selle is nie in staat om aanleiding te gee tot aaneenlopende sellyne nie. Byvoorbeeld, normale menslike fibroblaste gaan vir ongeveer 50 generasies voort en hou dan op om te verdeel. Hulle bly egter lewensvatbaar vir ongeveer 18 maande. En dwarsdeur hul lewensduur bly fibroblaste euploïed. Kuikenfibroblaste tree ook op soortgelyke wyse op. Epidermale selle en limfoblastiese selle is in staat om aaneenlopende sellyne te vorm.

Karakterisering van gekweekte selle:

Karakterisering van gekweekte selle of sellyne is belangrik vir verspreiding van sellyne deur selbanke, en om kontakte tussen navorsingslaboratoriums en kommersiële maatskappye te vestig.

Karakterisering van sellyne met spesiale verwysing na die volgende aspekte word oor die algemeen gedoen:

4. Of sellyn getransformeer is of nie.

5. Identifikasie van spesifieke sellyne.

Morfologie van selle:

'n Eenvoudige en direkte identifikasie van die gekweekte selle kan gedoen word deur hul morfologiese eienskappe waar te neem. Die morfologie moet egter met omsigtigheid beskou word aangesien dit grootliks afhanklik is van die kultuuromgewing. Byvoorbeeld, die epiteelselle wat in die middel (van die kultuur) groei, is gereeld veelhoekige met duidelik gedefinieerde rande, terwyl dié wat aan die periferie groei onreëlmatig en uitgerek (geswel) is.

Die samestelling van die kultuurmedium en die veranderinge in die substraat beïnvloed ook die sellulêre morfologie. In 'n weefselkultuurlaboratorium word die terme fibroblasties en epiteel algemeen gebruik om die voorkoms van die selle eerder as hul oorsprong te beskryf.

Vir hierdie selle is die lengte gewoonlik meer as twee keer van hul breedte. Fibroblastiese selle is bipolêr of multipolêr van aard.

Hierdie selle is veelhoekig van aard met gereelde afmetings en groei gewoonlik in monolae. Die terme fibroblastoïed (fibroblast-agtig) en epiteel (epiteelagtig) word gebruik vir die selle wat nie oor spesifieke karakters beskik om as fibroblastiese of epiteelselle te identifiseer nie.

Spesies van oorsprong van selle:

Die identifikasie van die spesie sellyne kan gedoen word deur:

b. Elektroforese van isoënsieme.

c. 'n Kombinasie van beide hierdie metodes.

In onlangse jare word chromosomale identifikasie gedoen deur die gebruik van molekulêre probes.

Identifikasie van weefsel van oorsprong:

Die identifikasie van sellyne met betrekking tot weefsel van oorsprong word uitgevoer met verwysing na die volgende twee kenmerke:

1. Die geslag waaraan die selle behoort.

2. Die status van die selle d.w.s. stamselle, voorloperselle.

Weefselmerkers vir sellynidentifikasie:

Sommige van die belangrike weefsel- of afstammingsmerkers vir sellynidentifikasie word kortliks beskryf.

Gedifferensieerde produkte as selmerkers:

Die gekweekte selle is by volledige uitdrukking in staat om differensiasiemerkers te produseer, wat as selmerkers vir identifikasie dien.

Enkele voorbeelde word hieronder gegee:

a. Albumien vir hepatosiete.

b. Melanien vir melanosiete

c. Hemoglobien vir eritroïedselle

d. Miosien (of tropomiosien) vir spierselle.

Ensieme as weefselmerkers:

Die identifikasie van ensieme in kultuurselle kan gemaak word met verwysing na die volgende karakters:

Die algemeen gebruikte ensiemmerkers vir sellynidentifikasie word in Tabel 35.1 gegee.

Tyrosienaminotransferase is spesifiek vir hepatosiete, terwyl tyrosinase vir melanosiete is. Kreatienkinase (MM) in serum dien as 'n merker vir spierselle, terwyl kreatienkinase (BB) gebruik word vir die opsporing van neurone en neuro-endokriene selle.

Filamentproteïene as weefselmerkers:

Die intermediêre filamentproteïene word baie wyd gebruik as weefsel- of afstammingsmerkers.

Byvoorbeeld:

a. Astrosiete kan opgespoor word deur gliale fibrillêre suurproteïen (GFAP).

b. Spierselle kan deur desmin uitgeken word.

c. Epiteel- en mesotheelselle deur sitokeratien.

Seloppervlak antigene as weefselmerkers:

Die antigene van die gekweekte selle is nuttig vir die opsporing van weefsel of selle van oorsprong. Trouens, baie teenliggaampies is ontwikkel (kommersiële stelle is beskikbaar) vir die identifikasie-sellyne (Tabel. 35.2). Hierdie teenliggaampies word opgewek teen seloppervlak-antigene of ander proteïene.

Die teenliggaampies wat teen afgeskeide antigeen a-fetoproteïen opgewek word, dien as 'n merker vir die identifikasie van fetale hepatosiete. Teenliggaampies van seloppervlak-antigene naamlik integrin’s kan gebruik word vir die algemene opsporing van sellyne.

Getransformeerde selle:

Transformasie is die verskynsel van die verandering in fenotipe as gevolg van die verkryging van nuwe genetiese materiaal. Transformasie word geassosieer met die bevordering van genetiese onstabiliteit.

Die getransformeerde en gekweekte selle vertoon veranderinge in baie karakters met verwysing na:

e. Gespesialiseerde produkvorming.

Terwyl die sellyne gekarakteriseer word, is dit nodig om die bogenoemde karakters in ag te neem om te bepaal of die sellyn afkomstig is van tumorselle of transformasie in kultuur ondergaan het.

Identifikasie van spesifieke sellyne:

Daar is baie benaderings in 'n kultuurlaboratorium om spesifieke sellyne te identifiseer:

c. RNA en proteïen analise

Die spesie en geslag waaruit die sellyn afgelei is, kan deur chromosoomontleding geïdentifiseer word. Verder is dit ook moontlik om normale en kwaadaardige selle te onderskei deur die ontleding van chromosome. Daar kan opgemerk word dat die normale selle meer stabiele chromosome bevat. Die belangrike tegnieke wat met betrekking tot chromosoomanalise aangewend word, word kortliks beskryf.

Deur hierdie tegniek is dit moontlik om individuele chromosoompare te identifiseer wanneer daar min morfologiese verskille tussen hulle is. Chromosoombanding kan gedoen word deur Giemsa-kleuring te gebruik.

'n Direkte telling van chromosome kan per verspreiding tussen 50-100 verspreidings gedoen word. 'n Lucida-kamera of 'n geslote kringtelevisie kan nuttig wees.

Chromosoom kariotipering:

In hierdie tegniek word die chromosome gesny, in volgorde gesorteer en dan op 'n vel geplak. Die beeld kan opgeneem of geskandeer word vanaf die skyfie. Chromosoomkariotipering is tydrowend in vergelyking met chromosoomtelling.

Die totale hoeveelheid DNA per normale sel is redelik konstant, en is kenmerkend vir die spesie van oorsprong, bv. normale sellyne van menslike, kuiken- en hamsterfibroblaste. Die DNS-inhoud verskil egter in die normale sellyne van muise, en ook die sellyne wat van kankerweefsel verkry word. Die meeste van die getransformeerde selle is aneuploïed en heteroploïed. DNA-analise is veral nuttig vir karakterisering van sulke selle. Ontleding van DNS kan uitgevoer word deur DNS-hibridisasie en DNS-vingerafdrukke.

Die gewilde Southern kladtegniek kan gebruik word om unieke DNS-volgordes op te spoor. Spesifieke molekulêre probes met radio-isotoop, fluoresserende of luminescerende etikette kan vir hierdie doel gebruik word. Die DNA van die verlangde sellyne word onttrek, gesny met restriksie-endonukleases, onderwerp aan elektroforese, op nitrosellulose geskrap, en dan gehibridiseer met 'n molekulêre (gemerkte) sonde, of 'n stel probes. Deur hierdie benadering kan spesifieke volgordes van DNS in die sellyne opgespoor word.

Daar is sekere streke in die DNA van 'n sel wat nie getranskribeer word nie. Hierdie streke, waarna verwys word as satelliet-DNS, het geen bekende funksies nie, en daar word geglo dat hulle 'n reservoir vir genetiese evolusie kan verskaf. Satelliet-DNS-streke word beskou as streke van hiperveranderlikheid. Hierdie streke kan gesny word met spesifieke beperking endonukleases, en opgespoor word deur gebruik te maak van cDNA probes.

Deur elektroforese en outoradiografie te gebruik, kan die patrone van satelliet-DNS-variasies opgespoor word. Sulke patrone waarna verwys word as DNS-vingerafdrukke is sellynspesifiek. In onlangse jare het die tegniek van DNS-vingerafdrukke 'n baie gewilde en 'n kragtige hulpmiddel geword om die oorsprong van sellyne te bepaal.

RNA en proteïen analise:

Die fenotipe eienskappe van 'n sellyn kan opgespoor word deur geenuitdrukking d.w.s. identifikasie van RNA's en/of proteïene. mRNA's kan deur Northern blot-tegniek geïdentifiseer word terwyl proteïene deur Western blot-tegniek opgespoor kan word.

Sommige van die in vivo ensiemaktiwiteite gaan verlore wanneer die selle in vitro gekweek word. Byvoorbeeld, arginase-aktiwiteit van die lewerselle gaan binne 'n paar dae na verbouing verlore.Sekere sellyne druk egter spesifieke ensieme uit wat vir die opsporing daarvan aangewend kan word bv. tyrosine aminotransferase vir hepatosiete, glutamiel sintase aktiwiteit vir astroglia in die brein. Vir meer voorbeelde van ensieme wat nuttig is in sellynopsporing, verwys Tabel 35.1.

Die veelvuldige vorme van 'n ensiem wat dieselfde reaksie kataliseer, word na verwys as isoënsieme of isosime. Isoensieme verskil in baie fisiese en chemiese eienskappe—struktuur, elektroforetiese en immunologiese eienskappe, Km en Vmaks waardes.

Die iso-ensieme kan geskei word deur analitiese tegnieke soos elektroforese en chromatografie. Meestal word elektroforese deur die gebruik van agarose, sellulose-asetaat, stysel en poliakrielamied gebruik. Die ru-ensiem word op een punt op die elektroforetiese medium toegedien. Soos die iso-ensieme migreer, versprei hulle in verskillende bande, wat opgespoor kan word deur met geskikte chromogeniese substrate te kleur.

Isoensieme is kenmerkend vir die spesie of weefsel. Isoensieme van die volgende ensieme word algemeen gebruik vir sellynopsporing:

c. Glukose 6-fosfaat dehidrogenase

d. Aspartaat aminotransferase

Isoënsiemanalise is ook nuttig vir die opsporing van interspesie-kruiskontaminasie van sellyne. Besoedeling van muissellyn met hamstersellyn kan byvoorbeeld geïdentifiseer word deur peptidase B-isoensieme te gebruik.

Sellyne kan gekenmerk word deur die opsporing van antigeniese merkers deur die gebruik van teenliggaampies. Die antigeniese merkers kan op die seloppervlak geleë wees of deur die selle in die kultuurmedium afgeskei word. Sommige van die teenliggaampies wat algemeen gebruik word vir die opsporing van verskillende seltipes word in Tabel 35.2 gegee (Sien bl. 430).

Meting van groeiparameters van gekweekte selle:

Inligting oor die groeitoestand van 'n gegewe kultuur word benodig om:

a. Ontwerpkultuureksperimente.

b. Roetine instandhouding van kultuur.

c. Meting van selproliferasie.

d. Ken die tyd vir subkultuur.

e. Bepaal die kultuurreaksie op 'n bepaalde stimulus of toksien.

Sommige van die algemeen gebruikte terme met betrekking tot die meting van groei van gekweekte selle word verduidelik.

Bevolkingsverdubbelingstyd (PDT):

Die tydsinterval vir die selpopulasie om te verdubbel in die middel van die logaritmiese (log) fase.

Selsiklus tyd of generasie tyd:

Die interval van een punt in die seldeling na dieselfde punt in die siklus, een deling later. Selsiklustyd word dus vanaf een punt in die selsiklus gemeet totdat dieselfde punt weer bereik word.

Dit dui op die kultuurstadium waar al die beskikbare substraat (groeiarea) benut word, en die selle in noue kontak met mekaar is.

Inhibisie van selmotiliteit en plasmamembraan-ruppeling wanneer die selle in volle kontak met ander aangrensende selle is. Dit vind meestal plaas by samevloeiing en lei tot die staking van die selproliferasie.

Die aantal selle per ml van die medium.

Die digtheid van die selle (selle/ml 2 , oppervlakte) in die platofase.

Groeisiklus van gekweekte selle:

Die groeisiklus van gekweekte selle word konvensioneel deur drie fases voorgestel — die vertragingsfase, die log (eksponensiële) fase en die platofase (Fig. 35.5). Die eienskappe van die gekweekte selle verskil in die fases.

Die vertragingsfase verteenwoordig 'n tydperk van aanpassing waartydens die sel die seloppervlak en ekstrasellulêre matriks vorm (wat verlore gaan tydens tripsinisering), aan die substraat heg en uitsprei. Daar is 'n verhoogde sintese van sekere ensieme (bv. DNA-polimerase) en strukturele proteïene, wat die selle voorberei vir proliferasie.

Die produksie van gespesialiseerde produkte verdwyn wat dalk nie weer verskyn totdat die selproliferasie ophou nie. Die vertragingsfase verteenwoordig die voorbereidende stadium van die selle vir proliferasie na subkultuur en hersaai.

Die logfase word gekenmerk deur 'n eksponensiële groei van selle, wat die vertragingsfase volg.

Die duur van logfase hang af van die selle met verwysing na:

c. Digtheid na proliferasie.

Tydens die logfase is die gekweekte selle in die mees eenvormige en reproduceerbare toestand met hoë lewensvatbaarheid. Dit is 'n ideale tyd vir monsterneming. Die logfase eindig nadat samevloeiing bereik is met 'n byvoeging van een of twee populasieverdubbelings.

Soos die selle samevloeiing bereik, word die groeitempo baie verminder, en die verspreiding van gekweekte selle stop amper.

Hierdie stadium verteenwoordig plato of stilstaande fase, en word gekenmerk deur:

b. Verminderde plooiing van plasmamembraan.

c. Selle wat minimum oppervlakte beslaan.

f. Uitputting van voedingstowwe en groeifaktore.

g. Verminderde sintese van strukturele proteïene.

h. Verhoogde vorming van gespesialiseerde produkte.

Die meerderheid normale gekweekte selle wat monolae vorm, hou op groei soos hulle samevloeiing bereik. Sommige van die selle bly egter met aanvulling van medium groei (teen 'n verminderde tempo) na samevloeiing, wat veelvuldige lae selle vorm. Die getransformeerde gekweekte selle bereik gewoonlik 'n hoër seldigtheid in vergelyking met die normale selle in die platofase (Fig. 35.6).

Plateerdoeltreffendheid van gekweekte selle:

Plateringsdoeltreffendheid, wat kolonievorming by lae seldigtheid verteenwoordig, is 'n maatstaf wat gebruik word vir die ontleding van selproliferasie en -oorlewing.

Wanneer die selle, teen lae digthede, in die vorm van enkelsel-suspensies gekweek word, groei hulle as afsonderlike kolonies. Plateringsdoeltreffendheid word soos volg bereken.

Plateringsdoeltreffendheid = Aantal kolonies gevorm/No. van selle gesaai × 100

Die term kloningsdoeltreffendheid word gebruik (in plaas van plaatdoeltreffendheid) wanneer elke kolonie uit 'n enkele sel groei.

Saaidoeltreffendheid wat die oorlewing van selle by hoër digthede verteenwoordig, word soos volg bereken.

Saaidoeltreffendheid = Aantal selle herwin/Getal. van selle gesaai × 100

Selsinkronisasie:

Sinchronisasie beteken letterlik om twee of meer dinge presies gelyktydig te laat gebeur. Byvoorbeeld, twee of meer horlosies kan gesinchroniseer word om presies dieselfde tyd te wys. Die selle in verskillende stadiums van die selsiklus in 'n kultuur kan gesinchroniseer word sodat die selle in dieselfde fase sal wees. Selsinchronie is nodig om die vordering van selle deur selsiklus te bestudeer. Verskeie laboratoriumtegnieke is ontwikkel om sel-sinchronisasie te bewerkstellig.

Hulle word breedweg in twee groepe ingedeel:

1. Fisiese fraksionering vir selskeiding.

2. Chemiese blokkade vir selskeiding.

Selskeiding deur fisiese middele:

Fisiese fraksionering of selskeidingstegnieke, gebaseer op die volgende kenmerke, word gebruik:

c. Affiniteit van teenliggaampies op seloppervlak-epitope.

d. Ligverstrooiing of fluoresserende emissie deur gemerkte selle.

Die twee algemeen gebruikte tegnieke naamlik sentrifugale elutriasie en fluoressensie-geaktiveerde selskeiding word kortliks hieronder beskryf.

Sentrifugale elutriasie:

Die fisiese kenmerke - selgrootte en sedimentasiesnelheid is werksaam in die tegniek van sentrifugale elutriasie. Sentrifugale elutriator (van Beckman) is 'n gevorderde toestel om die sedimentasietempo te verhoog sodat die opbrengs en resolusie van selle beter is. Die selskeiding word in 'n spesiaal ontwerpte sentrifuge en rotor uitgevoer (fig. 35.7). Die selle in die medium word in die skeikamer gepomp terwyl die rotor draai.

As gevolg van sentrifugale krag sal die sel na die kante gedruk word. Aangesien die medium dan deur die kamer gepomp word op so 'n manier dat die sentripetale vloei gelyk is aan die sedimentasietempo van selle. As gevolg van verskille in die selle (grootte, digtheid, seloppervlakkonfigurasie), is die selle geneig om teen verskillende tempo's te sedimenteer en ewewig op verskillende posisies in die kamer te bereik.

Die hele werking in die elutriator kan deur die poort gesien word, aangesien die kamer deur stroboskopiese lig verlig word. By die ewewig kan die vloeitempo verhoog word en die selle kan uitgepomp word, en in versamelhouers in verskillende fraksies geskei word. Dit is moontlik om skeiding van selle in 'n volledige medium uit te voer, sodat die selle direk na skeiding gekweek kan word.

Fluoresensie-geaktiveerde selsortering:

Fluoresensie-geaktiveerde selsortering is 'n tegniek om die selle uit te sorteer gebaseer op die verskille wat deur ligverstrooiing (bv. selgrootte) of fluoressensie-emissie (deur voorafbehandelde DNA, RNA, proteïene, antigene) opgespoor kan word. Die prosedure behels die deur van 'n enkele stroom selle deur 'n laserstraal sodat die verstrooide lig van die selle opgespoor en aangeteken kan word. Wanneer die selle voorbehandel word met 'n fluoresserende vlek (bv. chromomisien A vir DNA), kan die fluoresserende emissie wat deur die laser opgewek word, opgespoor word.

Daar is twee instrumente wat gebruik word gebaseer op die beginsel van fluorescent-geaktiveerde selsortering:

Hierdie instrument is in staat om selle (van 'n populasie) in verskillende fases van die selsiklus uit te sorteer gebaseer op die metings van 'n kombinasie van selgrootte en DNA-fluoressensie.

2. Fluorescent-activated cell sorter (FACS):

In hierdie instrument word die emissieseine van die selle gemeet, en die selle uitgesorteer in versamelbuise.

Vergelyking tussen fisiese metodes:

Vir die skeiding van 'n groot aantal selle word sentrifugale elutriator verkies. Aan die ander kant word fluorescent-geaktiveerde selsortering meestal gebruik om hoëgraadse suiwer fraksies van selle uit klein hoeveelhede selle te verkry.

Selskeiding deur chemiese blokkade:

Die selle kan geskei word deur metaboliese reaksies te blokkeer. Twee tipes metaboliese blokkades word gebruik - inhibisie van DNA-sintese en voedingsdeprivasie.

Inhibisie van DNA-sintese:

Tydens die S-fase van selsiklus kan DNA-sintese geïnhibeer word deur inhibeerders soos timidien, aminopterien, hidroksiureum en sitosienarabinosied te gebruik. Die effekte van hierdie inhibeerders is veranderlik. Die selsiklus word hoofsaaklik in S-fase geblokkeer wat lei tot lewensvatbare selle.

Voedingsgebrek:

Eliminasie van serum of isoleucien uit die kweekmedium vir ongeveer 24 uur lei tot die ophoping van selle by G1 fase. Hierdie effek van voedingsdeprivasie kan herstel word deur hul byvoeging teen watter tyd die sel-sinchronie plaasvind.

Enkele hoogtepunte van selsinchronisasie:

a. Selskeiding deur fisiese metodes is meer effektief as chemiese prosedures.

b. Chemiese blokkade is dikwels giftig vir die selle.

c. Getransformeerde selle kan nie gesinchroniseer word deur voedingsdeprivasie nie.

d. 'n Hoë graad van sel-sinchronie (>80%) kan in die eerste siklus verkry word, en in die tweede siklus sal dit <60% wees. Die selverspreiding kan willekeurig in die derde siklus plaasvind.

Sellulêre veroudering en apoptose:

Soos die selle in kultuur groei, word hulle oud as gevolg van veroudering, en hulle kan nie meer vermeerder nie. Die einde van die proliferatiewe lewensduur van selle word na verwys as veroudering.

Sellulêre veroudering:

Die groei van die selle word gewoonlik gemeet as bevolkingsverdubbelings (PD's). Die PD's verwys na die aantal kere wat die selpopulasie in getal verdubbel gedurende die tydperk van kweek en word deur die volgende formule bereken.

Meld10 (Aantal selle geoes) & # 8211 log10 (Aantal selle gesaai)/ log10 2

Die verskynsel van veroudering is meestal met menslike fibroblastkulture bestudeer. Na 30-60 populasies verdubbel, is die kultuur hoofsaaklik saamgestel uit senescent fibroblaste. Hierdie senesente fibroblaste is nie in staat om te verdeel in reaksie op mitotiese stimuli nie. Daar moet kennis geneem word dat die selle nie skielik verskyn nie, maar hulle akkumuleer geleidelik en neem toe in getal gedurende die lewensduur van die kultuur.

Die verskillende parameters wat gebruik word vir die meting van selgroei in kulture word hieronder gelys:

a. Direkte maatstaf van selnommer.

b. Bepaling van DNA/RNA inhoud.

c. Beraming van proteïen/ATP konsentrasie.

Meting van veroudering:

Die direkte meting van senescent selle is taamlik moeilik.

Sommige van die indirekte maatreëls is:

a. Verlies aan metaboliese aktiwiteit

b. Gebrek aan gemerkte voorloper (3 H-timidine) inkorporasie in DNA.

c. Sekere histochemiese tegnieke.

Veroudering-geassosieer β-galaktosidase aktiwiteit toets

Daar kom 'n ooruitdrukking van die lisosomale ensiem β-galaktosidase voor by veroudering. Hierdie ensiemverhoging word ook geassosieer met 'n toename in die selgrootte namate die sel 'n permanente nie-delende toestand betree. Die aantal senesente selle in 'n kultuur kan gemeet word deur veroudering-geassosieerde β-galaktosidase (SA-β) toets.

Die toets bestaan ​​uit die volgende fases:

1. Was die selle en maak dit vas met 'n fikseermiddel (bv. para formaldehied), en was weer.

2. Voeg die kleuroplossing (X-gal poeier in dimetielformamied opgelos in buffer) by die gefixeerde selle en inkubeer.

3. Die senesente selle vertoon 'n digte blou kleur wat getel kan word.

Apoptose:

Die proses van geprogrammeerde seldood (PCD) word na verwys as apoptose. Die seldood kan geïnisieer word deur 'n spesifieke stimulus of as gevolg van verskeie seine wat van die eksterne omgewing ontvang word. Apoptose vind plaas as gevolg van inherente sellulêre meganismes, wat uiteindelik lei tot selfvernietiging. Die sel aktiveer 'n reeks molekulêre gebeurtenisse wat 'n ordelike degradasie van die sellulêre bestanddele veroorsaak met minimale impak op die naburige weefsels.

Redes vir in situ apoptose:

1. Vir behoorlike ontwikkeling:

Die vorming van vingers en tone van die fetus vereis die verwydering van die weefsels tussen hulle. Dit word gewoonlik deur apoptose uitgevoer.

2. Vernietiging van selle wat die integriteit van die organisme bedreig:

Geprogrammeerde seldood is nodig om die selle te vernietig en te verwyder wat andersins die organismes kan beskadig.

Enkele voorbeelde word gelys:

a. Selle met beskadigde DNA gedurende die verloop van embrioniese ontwikkeling. As hulle nie vernietig word nie, kan hulle geboortedefekte tot gevolg hê.

b. Selle van die immuunstelsel ondergaan na hul toepaslike immuunfunksie apoptose. Dit is nodig om outo-immuun siektes te voorkom bv. rumatoïede artritis.

c. Selle wat met virusse besmet is, word deur apoptose vernietig.

3. Selvernietiging as gevolg van negatiewe seine:

Daar is verskeie negatiewe seine binne die selle wat apoptose bevorder. Dit sluit in ophoping van vrye radikale, blootstelling aan UV-strale, X-strale en chemoterapeutiese middels.

Meganisme van apoptose:

Die geprogrammeerde seldood kan voorkom as gevolg van drie verskillende meganismes:

1. Apoptose as gevolg van interne seine.

2. Apoptose veroorsaak deur eksterne seine bv. tumor nekrose faktor-α (TNF-α), limfotoxien.

3. Apoptose veroorsaak deur reaktiewe suurstofspesies.

Rol van caspases in apoptose:

'n Groep ensieme, naamlik geaktiveerde proteases, speel 'n deurslaggewende rol in die geprogrammeerde seldood. Hierdie proteases is eintlik cysteiniel aspartaat spesifieke proteïnases of in kort, algemeen na verwys as caspases. Daar is ongeveer tien verskillende tipes kaspases wat op verskillende substrate inwerk wat uiteindelik tot seldood lei. Byvoorbeeld, kapsase I klief interleukien 1β.

Inhibisie van kaspase-aktiwiteite:

Aangesien die kaspases nou betrokke is by apoptose, is dit moontlik om seldood te voorkom deur hul aktiwiteite te inhibeer. Sekere spesifieke peptiede wat kaspases, en dus apoptose kan inhibeer, is geïdentifiseer.

Meting van apoptose:

’n Eenvoudige en maklike manier om dooie of sterwende selle op te spoor is die direkte mikroskopiese waarneming. Die sterwende selle is afgerond met digte liggame wat onder fasekontrasmikroskoop uitgeken kan word. Die selle wat apoptose ondergaan het, bevat gefragmenteerde chromatien wat deur konvensionele kleurtegnieke opgespoor kan word. In onlangse jare is meer sensitiewe en betroubare tegnieke ontwikkel om apoptose te meet.

Sommige van hulle word kortliks beskryf:

Bepaling ADP/ATP-verhouding:

Beide die groei en apoptose van selle vereis ATP. Maar wanneer daar groeistop is, vind 'n verhoging van ADP plaas. Die meting van ADP/ATP-verhouding sal dus lig op die dooie selle werp. Trouens, sommige toetsstelsels vir die meting van ADP/ATP-verhoudings is kommersieel beskikbaar.

'n Beduidende biochemiese gebeurtenis vir die apoptose is die aktivering van endogene nuklease-aktiwiteit. Hierdie ensiem klief DNA in fragmente met vrye 3-hidroksielgroepe. Die nuutgevormde klein DNS-fragmente kan uitgebrei word deur die ensiem DNS-polimerase te gebruik. As gemerkte nukleotiede gebruik word vir DNA-fragment verlenging, kan dit opgespoor word.

TUNEL is 'n afkorting vir TdT-gemedieerde dUTP nick-eind-etiketteringstoets. TUNEL is baie vinnig en effektief vir die bepaling van DNA-fragmente wat deur endogene nuklease-aktiwiteit gevorm word. Die apoptotiese kerne kan geïdentifiseer word deur 'n fluoresserende tegniek deur gebruik te maak van fluoressensie-isotiosianaat (FITC) en 4,6-diaminofenielindool.

Gedurende die verloop van apoptose word die genomiese DNA tot mono- en oligonukleosomale DNA-fragmente geklief. Hierdie fragmente kan geskei word deur agarose-elektroforese, en opgespoor word. Die nukleosomale fragmente van apoptotiese selle gee 'n kenmerkende leerpatroon op elektroforese.

Beperkings van die toets:

DNS-leertoets is nie baie spesifiek nie, aangesien verskeie selle wat apoptose ondergaan het dalk nie DNS-leer toon nie. Verder kan sommige selle wat nie aan apoptose onderworpe is nie, ook DNA-lere toon, om hierdie redes word DNA-leertoets gepaard met 'n ander toets vir die meting van apoptose.


Inleiding

Diere-RNA-virusse, oor die algemeen, toon hoë mutasietempo's volgens Combe en Sanjuán (2014), die frekwensie van nuwe mutasies in hierdie virions wissel van 10 –4 tot 10 –6 substitusies per nukleotied per rondte van kopiëring, met oorgange wat meer algemeen is as transversies. Daarbenewens word die mutasieproses ook deur die gasheerselle beïnvloed, met VSV wat teen 'n aansienlik hoër tempo in soogdierselle muteer as in insekselle. Ander faktore wat die frekwensie van mutasie beïnvloed, is die virale familie, die polariteit van die RNA (+ of positiewe-sin, 5'-tot-3'-of negatiewe-sin, 3'-tot-5'), en of die genoom is enkelstring (ssRNA) of dubbelstring (dsRNA). Die RNA-afhanklike RNA-polimerases in hierdie virusse het nie die proefleesmasjinerie om verkeerd geïnkorporeerde nukleotiede reg te stel nie, wat dikwels lei tot 'n hoë generasie van gemuteerde fenotipes. Dit beteken dat RNA-virusse goeie vermoëns toon om die druk van óf entstowwe óf antivirale middels te oorkom hierdie virusse het 'n voordeel bo DNA-virusse in hierdie verband, aangesien laasgenoemde proefleesmeganismes bevat. Selfs al word infeksie geïnisieer deur 'n enkele patogeniese RNA-bevattende eenheid, bevat die viruspopulasie na 'n paar rondes van replikasie gereeld 'n verskeidenheid mutante (bekend as "die mutante swerm" Novella et al. 1995) ten minste in teorie, die mutante wat ontstaan ​​het, sal wissel in hul sensitiwiteit vir beide die teenliggaampies wat deur die gasheer geproduseer word en die antivirale middels wat in terapie gebruik word. Al hierdie variante staan ​​bekend as 'n virale 'kwasispesie' (Holland et al. 1992), hulle bevat 'n aansienlike verskeidenheid genome, en vorm die rede waarom RNA-virusse van duisende tot miljoene kere vinniger as DNA-gebaseerde organismes ontwikkel.Dit is van besondere relevansie vir entstowwe en antivirale middels, wat dit noodsaaklik maak om die navorsing oor plant- en diervirusse uit te brei om nuwe antivirale middels te ontwikkel, om op hoogte te bly van die virusse wat weerstand ontwikkel, asook die toepaslike opdatering van die relevante entstowwe (Domingo et al. 1997). Gelukkig vertoon beide plante en diere 'n ou antivirale sisteem (post-transkripsionele genestiling) wat tot 'n sekere mate die mutasie-neiging van RNA-virusse kan weerstaan ​​(Marathe et al. 2000).

Isaacs en Lindenmann het in 1957 'n stof met antivirale aktiwiteit, gesintetiseer deur embrioniese hoendereiers wat met die griepvirus besmet is, berig dat hulle "interferon" (IFN) genoem het. Hierdie baanbrekerswerk het die deur oopgemaak vir die studie van antivirale verbindings wat deur hoër selle geproduseer word en het gelei tot die huidige klassifikasie van interferone as seinproteïene (sitokiene) wat in staat is om die immuunstelsel selektief te aktiveer, hierdie verdedigingsmeganismes sluit in die aktivering van natuurlike moordenaarselle en makrofage, sowel as 'n verhoogde uitdrukking van die belangrikste histoversoenbaarheidskompleks antigene. Interferone word in drie groepe georganiseer, Tipe I, Tipe II en Tipe III. Tipe I INF's, voorheen bekend as suurbestande IFN's, is geglikosileerde of gefosforileerde proteïene wat nege subtipes insluit, IFN-α, IFN-β, IFN-δ, IFN-ε, IFN-ζ, IFN-κ, IFN-ν, IFN-τ, en IFN-ω (Dussurget et al. 2014), en word geproduseer deur leukosiete wat aan patogene blootgestel is. Tipe II IFN, ook bekend as immuun interferon of γ interferon, is 'n suur-labiele lipoproteïen wat oor 166 aminosure in mense strek, terwyl die minder bestudeerde tipe III IFN oorspronklik beskryf is as 'n antivirale proteïen deur Wheelock en Sibley (1965). Aangesien interferon een van die vernaamste hindernisse teen virale infeksies by gewerwelde diere uitmaak, is dit noodsaaklik om virale mutasies te identifiseer wat virusse weerstandbiedend teen IFNs maak.

Figuur 1 beeld die verskillende virale families uit wat in hierdie artikel ingesluit is, terwyl Tabel 1 die eienskappe van die virusse opsom.

Grafiese voorstelling van die 10 menslike virusse wat in die teks beskryf word (kreatiewe algemene lisensiesyfers van VIPERdb https://viperdb.scripps.edu (Carrillo-Tripp et al. 2009) en Reddy et al. 2015). Die virusfamilies wat hier ingesluit is, is: a Picornaviridae, b Coronaviridae, c Caliciviridae, d Astroviridae, e Togaviridae, f Bunyaviridae, g Rhadoviridae, h Filoviridae, i Orthomyxoviridae, en j Paramyxoviridae

Positiewe sintuig enkelstring-RNA-virusse (+ ssRNA)

Die positiewe-sin enkelstring-RNA wat in hierdie virusse teenwoordig is, werk as 'n mRNA wanneer dit die sitoplasma bereik van die selle wat dit besmet. Eukariotiese mRNA's het 'n gemetileerde kapstruktuur wat noodsaaklik is vir hul stabiliteit en proteïentranslasie (Furuichi en Shatkin 2000). Tydens virus-gasheer ko-evolusie het virusse verskillende strategieë ontwikkel om hul RNA's te verander om eukariotiese mRNA's na te boots, om opsporing deur die aangebore immuunstelsel te ontsnap en om doeltreffende proteïentranslasie te verseker. Die twee hoofbenaderings behels dat 'n peptied of 'n 7-metielguanosiendop kovalent aan die eerste nukleotied by die 5'-punt van hul RNA's geheg word. Virale families, soos Picornaviridae, Caliciviridae en Astroviridae, kovalent heg 'n proteïen bekend as VPg (virale proteïen genoom-gekoppel), terwyl Coronaviridae en Togaviridae heg 'n pet aan, via 'n trifosfaatbrug (Beoordeel deur Decroly et al. 2012). Koronavirusse kodeer hul eie afdek-ensieme en volg die kanoniese afdekkingsweg, bestaande uit vier opeenvolgende ensiematiese reaksies, wat lei tot 'n m7GpppAm-cap (Sun et al. 2014 Sola et al. 2015). Togaviridae kan ook 'n virale kappie sintetiseer wat identies is aan 'n eukariotiese pet, maar volg 'n onkonvensionele sintesepad (Decroly et al. 2012).

Picornavirusse

Dit is klein positiewe-sin enkelstrengige RNA-virusse (22–32 nm in deursnee) wat direk repliseer in die sitoplasma van geïnfekteerde selle. Die picornavirus + ssRNA is 7.2–9.0 kb lank en bevat 'n viraal-gekodeerde proteïen (VPg) aan die 5'-punt wat die rol van 'n primer in transkripsie speel, dit besit ook 'n poli (A) stert aan sy 3'-punt. Positiewe sintuig-RNA is soortgelyk aan mRNA (wat dieselfde sintuig vertoon), wat beteken dat die nukleïensuur direk deur die gasheersel vertaal kan word, hierdie kwaliteit maak die naakte + ssRNA vermoedelik aansteeklik, hoewel in 'n mindere mate as die volledige virion. RNA-translasie lei tot 'n enkele poliproteïen, wat later gesplit word om al die aktiewe virale proteïene te produseer (Villa-Kumaroff et al. 1975). Die ikosaëdriese kapsied van die virion bevat 60 kopieë van elk van vier kapsiedproteïene, VP1, VP2, VP3 en VP4, die eerste drie is groot proteïene, terwyl die kleiner VP4 op die binneoppervlak van die kapsied geleë is, in kontak met beide die RNA en die aminotermini van die polipeptiede VP1 en VP3 (Mosser et al. 1994). Picornaviridae is 'n groot familie virusse wat die klassieke genera insluit Enterovirus (wat die veroorsakende middel van poliomyelitis insluit), Rhinovirus, Hepatovirus, Kardiovirus, en Aftovirus daarbenewens is daar 'n aantal genera wat onlangs ontdek is, hierdie inkorporeer Kobuvirus (Sasaki et al. 2001), Tremovirus (Johansson et al. 2002), Techovirus (King et al. 2000), Parechovirus (Joki-Korpela en Hyypiä 2001), en Erbovirus (Pringle 1999). Die picornavirusse produseer 'n verskeidenheid menslike siektes, maar tot op hede is daar net doeltreffende entstowwe vir poliomyelitis en hepatitis A. Entstofproduksie vereis geïnaktiveerde of verswakte virale stamme en sekere mutasies in die virale genoom kan verswakte stamme produseer, daarom is dit noodsaaklik om identifiseer hierdie RNA-mutasies, aangesien dit vermeende entstowwe kan verteenwoordig vir patogeniese picornavirusse wat hulle steeds ontbreek.

Opmerklike voorbeelde van picornavirus

Poliovirusse bevat 3 antigenies afsonderlike serotipes, tipe 1, 2 en 3, en al drie word benodig vir 'n entstof om mense teen die siekte te beskerm, dienooreenkomstig, studie van hul mutasietempo's sowel as hul genetiese drywing is noodsaaklik om effektiewe entstowwe te ontwerp. Die artikel wat Richard I. Carp in 1963 gepubliseer het, verteenwoordig (Carp, 1963), na die beste van ons kennis, een van die vroegste studies oor die variasie van die mutasietempo in picornavirus. Karp het twee besondere kenmerke in verskeie poliovirusstamme bestudeer, die reproduktiewe temperatuur/40 + (rct40 + ) en guanidien afhanklike (g + ) karakters, en tot die gevolgtrekking gekom dat die mutasietempo's verskil tussen die verskillende poliovirusstamme wat bestudeer is. Daarbenewens het die variasies in mutasietempo's wat in verskillende stamme teëgekom word nie gekorreleer met die aantal stappe wat nodig is om die gemuteerde karakter te bereik nie en, meer betekenisvol, nie ooreenstem met die stabiliteit van die stam tydens deurgang in die menslike ingewande nie.

Die poliovirus tipe 1 genoom is volledig deur Kitamura en medewerkers in 1981 gevolgorde, wat demonstreer dat die positiewe sin RNA 'n poliproteïen van 247 kDa kodeer. Tot 1982 was min bekend oor die effek van mutasies op die lewensiklus van poliovirusse en op daardie stadium het die enigste mutasies wat gekenmerk is, ooreengestem met die virale pelsproteïen en deeltjies geproduseer wat defektiewe steur. In 1982 kon Hewlett en kollegas ses temperatuur-sensitiewe mutante van poliovirus tipe 1 isoleer, wat 'n groot aantal hidroksielamien-gegenereerde mutasies bevat. inhibisie was net effens laer as dié wat deur die wilde-tipe poliovirus geproduseer word. Parvin en kollegas het egter in 1986 ontdek dat die poliovirus-genoom redelik stabiel is, ten minste as dit vergelyk word met dié van die griepvirus, het die skrywers berig dat die mutasietempo vir die VP1-geen minder as 2,1 × 10 -6 mutasies per nukleotied per aansteeklike is siklus. Ten spyte van hierdie relatief lae mutasietempo, het Racaniello en Meriam in 1986 die bestaan ​​van puntmutasies beskryf wat die virale produksiesiklus wesenlik kan verander. in virale nageslag, in vergelyking met die wildtipe virus. Die strategie om mutasies kunsmatig by die 5'-terminus te genereer, is ook suksesvol deur Izuka en medewerkers in 1989 uitgebuit, wat stabiele poliovirusse ontstaan ​​het wat minder neurovirulent is.

Dunn et al. (1990) het poliovirusuitskeiding bestudeer deur babas wat hul eerste inenting met lewende orale polio-entstof ondergaan het, en het opgemerk dat die mutasies in die 5'-niekoderende streek hierbo genoem, tipies van verswakte fenotipes, vinnig teruggekeer het vir tipe 3, en teen 'n stadiger tempo vir tipe 1 virusse. Afgesien van geïnduseerde mutasies, vertoon poliovirusse ook spontane mutasies wat, volgens Drake in (1993), eintlik 300 keer hoër is as dié wat voorheen gerapporteer is vir virale deeltjies wat DNA-genome bevat. Klaarblyklik moet hierdie feit in ag geneem word wanneer poliovirusstamme gekies word om in entstofvoorbereiding te gebruik. Daarbenewens het Chumakov en kollegas, wat met 'n Sabin-afgeleide poliovirus tipe 3-stam gewerk het, 'n interessante publikasie in 1994 gelewer wat demonstreer dat virusrevertante, afkomstig van virions wat 'n puntmutasie by nukleotied 472 bevat, teen verskillende tempo's verskyn het, afhangende van die stamme wat verbasend gebruik is , het die resultate voorgestel dat gasheerfaktore betrokke kan wees by die seleksie van die revertante.

Die replikasie van RNA-virusse hang gewoonlik af van 'n RNA-polimerase wat die nukleïensuur met lae getrouheid kopieer, wat lei tot 'n hoë frekwensie (wat wissel van 10 –3 tot 10 –4 ) van verkeerd geïnkorporeerde nukleotiede per rondte van replikasie. Poliovirusse blyk besonder hoë mutasietempo's te hê, tot 'n miljoen keer hoër as die organismes wat hulle besmet. Mutasies speel 'n belangrike rol in virale aanpassing, maar as dit te hoog is, is dit skadelik, daarom kan verwag word dat die mutasietempo's van hierdie ensieme geoptimaliseer sal word deur natuurlike seleksie. Dit blyk nie die geval te wees vir poliovirusse nie, wat beskryf word as 'n keuse vir vinniger repliserende ensieme, wat dus verantwoordelik is vir verhoogde foutkoerse (Duffy 2018). Die poliovirus polimerase (3Dpol) is een van die bes bestudeerde virale ensieme, dit strek oor 'n GDD-motief, sowel as twee streke gedenomineer A en B. Die GDD-motief, ook bekend as die C-motief, bevat twee asparaginsuurreste en is goed bewaar in virale RNA-afhanklike RNA-polimerases is die A- en B-motiewe ook goed bewaar. Van die twee asparaginale residue in GDD is die eerste een noodsaaklik vir ensiematiese aktiwiteit, terwyl vervanging van die tweede aminosuur deur asparagien 'n ensiem produseer wat 'n mate van aktiwiteit onder sekere toestande vertoon (Jablonski en Morrow 1995). Hierdie feit kan relevant wees wanneer reversies in poliovirusstamme wat vir entstofproduksie gebruik word, ontleed word, soos die geval is vir Sabin 2-isolate (Taffs et al. 1995). Verskeie studies het gefokus op die skepping van variante vir die "D-motief", aangesien dit as 'n relevante teiken voorgestel is om 'n verskeidenheid virale stamme te verkry wat goeie entstofkandidate kan verteenwoordig (Liu et al. 2013).

Die fout-geneigde aard van die RNA-afhanklike RNA-polimerase kan ook verantwoordelik wees vir die generering van virale stamme wat bestand is teen antivirale middels. Gevolglik het Meng en Kwan in (2014) berig dat die enterovirus 71, wat 'n L123F-mutasie in sy RNA-afhanklike RNA-polimerase bevat, 'n verswakte antiviraal-weerstandige stam is wat as 'n doeltreffende entstof teen hierdie virus gebruik kan word, dit voeg nog 'n laag op die onderwerp van die skep van nuwe entstowwe deur die mutasiestrategie van die virus te benut en te beheer. In sommige picornavirus, soos bek-en-klouseervirus (FMDV), het Zeng en kollegas (2014) gerapporteer dat hoër replikasiegetrouheid geassosieer word met verswakte virale stamme, kan hierdie kandidate goeie entstofalternatiewe vir die, tans gebruik, chemies-geïnaktiveerde stamme verteenwoordig.

Gitlin et al. (2002) het kort interfererende RNA's (siRNA) geïdentifiseer as 'n nuwe tipe antivirale middels teen poliovirusse, hierdie siRNA verleen intrasellulêre antivirale immuniteit in menslike selle, en skep dus 'n nuwe strategie om poliovirus te beheer. Dit is duidelik dat mutasies in virale RNA hierdie siRNA's verouderd kan maak, en dus nie meer in staat is om virale replikasie te beheer nie. In ooreenstemming het Schott et al. het in 2005 berig dat veelvuldige RNA-interferensie (RNAi) nodig is vir selle om infeksie deur vesikulêre stomatitisvirus (VSV) te weerstaan, wat daarop dui dat die sellulêre RNAi-masjinerie 'n rol speel in die stryd teen virusse in die natuur.

Coronaviridae

Die Coronaviridae familie (subfamilie Coronavirinae) is ingesluit in die Nidovirales orde (de Groot et al. 2011) en omvat die genera Alphacoronavius, Betacoronavirus, Gammacoronavirus, en Deltakoronavirus. Hierdie virusse bevat positiewe-sin enkelstrengige RNA, met 'n viraal-gekodeerde proteïen aan die 5'-punt en 'n poli (A) stert aan sy 3'-punt. Dit is nog 'n virale familie waarin die positiefstrengs nukleïensuur as 'n mRNA werk wanneer dit die gasheer sitoplasma bereik, en die eerste proteïen wat vertaal word, is die RNA-afhanklike RNA-polimerase. Hierdie replikase word bygestaan ​​deur 'n nie-strukturele proteïen wat proefleesaktiwiteit het. Hierdie ensiem verskil van dié wat in ander positief-gestrengde RNA-virusse voorkom, aangesien dit 'n mutasie dra wat dit in staat stel om 'n verskeidenheid mutageniese middels te weerstaan ​​(Sexton et al. 2016) vroeë werk deur Xu et al. 2003). Gevolglik is beide positief- en negatief-gestrengde RNA-populasies wat deur die virus in die opeenvolgende replikatiewe siklusse gegenereer word redelik homogeen, dit impliseer dat die genetiese drywing van hierdie virusse laag is, wat entstofontwerp vergemaklik.

Coronavirus vertoon heliese simmetrie en bevat die grootste genoom onder RNA-virusse. Hierdie groep is in die 1960's ontdek en 'corona' (Latynse naam wat kroon beteken) genoem vanweë sy mikroskopiese voorkoms. Die Coronaviridae vertoon 'n S peplomeer op die virale oppervlak, dit is 'n glikoproteïenpiek op die virale omhulsel wat die gasheerreseptor herken en reageer met die reseptor bevat N-asetielneuramiensuur en speel 'n groot rol in virale tropisme. Die virus repliseer in die sitoplasma van die menslike lugwegselle, wat simptome soortgelyk aan dié van gewone verkoue veroorsaak. 'n Verskeidenheid koronavirusse is beskryf, hulle word in vier genera geklassifiseer: Alfa-koronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus, en Deltakoronavirus. Die Alfa-koronavirus sluit in HCoV-229E, HCoV-NL63, Miniopterus vlermuis koronavirus 1, Miniopterus vlermuis koronavirus HKU8, vark epidemiese diarree virus, Rhinolophus vlermuis koronavirus HKU2, en Scotophilus bat coronavirus 512. Enkele voorbeelde van Betacoronavirus is betacoronavirus 1, menslike koronavirus HKU1, muriene koronavirus, Pipistrellus vlermuis koronavirus HKU5, Rousettus vlermuis-koronavirus HKU9, ernstige akute respiratoriese sindroom-koronavirus (SARS-CoV), Tylonycteris vlermuis-koronavirus HKU4, Midde-Ooste respiratoriese sindroom-koronavirus (MERS-CoV), menslike koronavirus OC43 (HCoV-OC43), en krimpvarkie-koronavirus 1 (EriCoV). Beluga-walviskoronavirus SW1 en aansteeklike brongitisvirus IBV behoort tot die genus Gammacoronavirus, terwyl die Deltakoronavirus genus sluit HKU11 en HKU15 in.

Die verteenwoordigende menslike koronavirusse sluit in HCoV-229E, HCoV-OC43, SARS-CoV, HCoV-NL63, HKU1 en MERS-CoV. Die jongste geïdentifiseerde menslike koronavirus is SARS-CoV-2 (ernstige akute respiratoriese sindroom coronavirus 2), ook bekend as 2019-nCoV, "novel coronavirus 2019" en COVID-19 (Liu et al. 2017 Corman et al. 2018). SARS-CoV-2 is die veroorsakende agent van die huidige wêreldwye pandemie, wat in Desember 2109 in Wuhan, die hoofstad van die Hubei-provinsie, China, begin het. Die pandemie was die gevolg van 'n diervirus wat suksesvol geïnfekteer en onder mense versprei het. Die virus het 'n geskatte inkubasietyd van 14-20 dae, en produseer 'n sindroom wat gekenmerk word deur kortasem, seer keel en koors. Dit kan gevolg word deur 'n tweede stadium wat gekenmerk word deur longontsteking, wat dodelik kan wees in ouer mense en ander met óf comorbidities óf 'n genetiese aanleg, maar die sterftesyfer wat deur hierdie virus geproduseer word, is nie te hoog nie (in die tyd wat hierdie manuskrip geskryf is) , het die Wêreldgesondheidsorganisasie 'n sterftesyfer van 3,4% geraam. Daarbenewens blyk dit dat die virus 'n lae genetiese drywing het, wat daarop dui dat entstofontwikkeling 'n doeltreffende manier van epidemiese beheer moet bied.

'n Aantal verbindings is reeds in 2004 gebruik om koronavirusinfeksie te behandel, Chang-Jer et al. beskryf dat niklosamied (wat as 'n antihelmintiese middel gebruik word) die replikasie van koronavirusse soos SARS-CoV geredelik geïnhibeer het (Chang-Jer et al. 2004). Die ooreenkomste tussen SARS-CoV en SARS-CoV-2 dui daarop dat hierdie verbinding 'n belowende middel kan verteenwoordig om die COVID-19-pandemie-stam te bekamp as die behandeling suksesvol is, kan niclosamine in die nabye toekoms klinies gebruik word, aangesien die studies oor sy sekondêre effekte by mense is reeds uitgevoer toe die geneesmiddel as 'n farmaseutiese aktiewe beginsel geklassifiseer is (Fig. 2). Bykomende klein molekules, soos tetra-O-galloyl-β-d-glukose (Fig. 3) en luteolien, is ook beskryf om die virus te inhibeer om aan menslike selle te kleef (Ling et al. 2004). In 1983 het Higgins en kollegas suksesvol intranasale behandeling met interferon α gebruik om eksperimentele respiratoriese koronavirusinfeksie by vrywilligers te voorkom, is interferon β ook beskryf om SARS-koronavirusinfeksie in vitro te inhibeer (Tan et al. 2004). Selfs aminoglikosied-antibiotika, soos higromisien B, is gerapporteer om muriene koronavirusinfeksies effektief te beheer (Macintyre et al. 1991) terwyl die sisteïenproteïenase-inhibeerder (2S,3S)-transepoksisuksiniel-l-leucylamido-3-metielbutaan-etielester beskryf is om te inhibeer SARS-CoV Urbani-stam (Yount et al. 2003). Vincent en kollegas het in 2005 berig dat die middel chlorokien, wat sedert die 1940's gebruik is vir die voorkoming en behandeling van malaria, SARS-CoV sterk inhibeer (Fig. 4).

Chemiese struktuur van niklosamied (2′, 5-dichloor-4′-nitrosalisielanilied)

Chemiese struktuur van tetra-O-galloiel-β-d-glukose

Chemiese struktuur van chlorokien

Daarbenewens het Veiga en kollegas in 2003 'n interessante manier voorgestel om enteriese koronavirusinfeksies te beheer, die metode behels Escherichia coli bakteriële selle wat samesmeltings van enkelketting teenliggaampies (scFvs) tot die outotransporter ß-domein van die IgA-protease van Neisseria gonorrhoeae. E coli was die bakterieë van keuse omdat hierdie organisme 'n algemene enteriese commensaal in gesonde mense is, dus deel die bakterie en virus dieselfde ekosisteem.

Talbot en kollegas het in 1988 berig dat inenting met 'n sintetiese dekapeptied, wat ooreenstem met 'n domein in die virale peplomer-stingel, muise beskerm het teen 'n dodelike enkefalitis-veroorsakende koronavirus. Verder het Jiang et al.berig in (2005) dat entstowwe gebaseer op die kapsied-piek (S)-proteïen van SARS-CoV, sterk neutraliserende teenliggaampies induseer en diere teen die koronavirus in 2005 beskerm, het Keng en kollegas aminosure 1055 tot 1192 in die S2-streek van die kapsied S-proteïen, as noodsaaklik om neutraliserende teenliggaampies teen SARS-CoV te induseer.

Caliciviridae

Caliciviridae is 'n virale familie soortgelyk aan picornavirus, wat 'n nie-omhulde nukleokapsied met 'n deursnee van 40 nm vertoon. RNA-genoom van ongeveer 7.5 kb hierdie virusse infekteer vertebrate, insluitend mense, en vertoon 'n nuwe meganisme vir die aanvang van proteïensintese. Die kapsiedproteïen (VPg) is kovalent gekoppel aan die 5'-area van die RNA en kan direk met eukariotiese inisiasiefaktore eIF4E en eIF3 in wisselwerking tree alhoewel Chaudhry et al. berig in 2006 dat calicivirus RNAs blykbaar verskil in hul vereistes vir die proteïene wat die translasie-inisiasiekompleks integreer. Die familie sluit 5 genera in, Lagovirus, Norovirus, Sapovirus, Nebovirus en Versivirus. Die genus Versivirus infekteer katte en is 'n tipiese calicivirus met 'n RNA-genoom rondom 7.7-kb, wat gepoliadenileer is aan die 3'-punt en bevat die VPg-proteïen kovalent gekoppel aan die 5'-punt, soos hierbo genoem en soos die geval is vir picornavirusse. VPg word gekodeer deur die oop leesraam (ORF)1 die virion bevat ook die hoofkapsiedproteïen (VP1), gekodeer deur ORF2, en VP2, 'n proteïen uniek aan calicivirusse wat deur ORF3 gekodeer word. Hierdie proteïene, wat belangrike antigene vir entstofvoorbereiding uitmaak, word blootgestel aan vinnige mutasietempo's tydens virale deurgange, en hierdie mutasies kan stamme genereer wat nie kan voortplant nie. In die besonder, soos beskryf deur Mitra et al. (2004), is mutagenese van tyrosine 24 in die VPg-proteïen dodelik vir katkalicivirus, wat daarop dui dat die tyrosienresidu noodsaaklik is vir die vorming van 'n kovalente binding met die RNA. Daarbenewens het Sosnovtsev et al. (2005) beskryf dat, terwyl uitwissing van ORF3 dodelik is vir die virus, kleiner delesies en vroeë beëindigings wat dele van die unieke VP2-proteïen bewaar nie-aansteeklike virale deeltjies produseer.

Die genus Norovirus sluit die Norwalk-stam in, wat 'n uitbreking in Norwalk, Ohio, in 1968 veroorsaak het, en die Carlow-variant-stam, vernoem na Carlow County, Ierland (Kearney et al. 2007). Hierdie virale genus is die mees algemene oorsaak van gastro-enteritis en produseer meer as 200 000 sterftes per jaar wêreldwyd. Norovirusse word van persoon tot persoon oorgedra, meestal deur besmette water en voedsel, dit produseer naarheid, braking en waterige diarree, gepaardgaande met sterk buikpyn. In ander opsigte, Norovirus is 'n tipiese calicivirus wat gereelde RNA-mutasies ondergaan, met 'n gemiddelde evolusionêre tempo wat wissel van 1,2 × 10 −2 tot 1,4 × 10 −2 nukleotiedsubstitusies per plek per jaar (Victoria et al. 2009). Hierdie vermoë om te muteer is van groot kommer, aangesien dit 'n wesenlike invloed op entstofdoeltreffendheid Lochridge et al. (2007) beskryf, in muriene norovirusse, dat 'n enkele aminosuurvervanging in 'n belangrike domein van die VP1-kapsiedproteïen genoeg is om teenliggaamneutralisasie te ontduik.

Astroviridae

Astrovirusse is vir die eerste keer in 1975 beskryf as veroorsakende middels van menslike diarree, wat beide jong en bejaarde mense besmet (Madeley en Cosgrove 1975) hierdie virusse veroorsaak gewoonlik nie ernstige siektes nie, alhoewel onlangse verslae aandui dat hulle 'n neuro-indringende siekte kan produseer, met sommige besmette babas ernstige enkefalitis ontwikkel (Lum et al. 2016). Die lede van die Astroviridae familie is nie-omhulde virusse, met 'n monoparty positiewe-sin enkelstrengige RNA genoom van ongeveer 7.0 kb. Hulle naam is te danke aan hul steragtige morfologie, die Griekse naam 'astron' beteken ster, en hulle het 'n deursnee van 30 nm. Die virale genomiese RNA is gepoliadenyleer aan die 3'end, en bevat drie ORF's, bekend as ORF1a, ORF1b en ORF2. ORF1 kodeer die poliproteïen 1ab, terwyl ORF2 kodeer vir die virale strukturele poliproteïen (Chu et al. 2008) aminosuur Thr227, in die kapsiedproteïen, speel 'n noodsaaklike rol in die samestelling van aansteeklike nageslagvirusse (Matsui et al. 2001). Soos die geval is met ander RNA-virusse, vertoon astrovirusse 'n hoë evolusionêre tempo, wat deur Babkin en kollegas in 2012 beraam is as 3,7 × 10 –3 nukleotiedvervangings per plek per jaar (Babkin et al. 2012). Hierdie virusse gebruik 'n klatrien-afhanklike pad om die gasheerselle binne te gaan (Méndez et al. 2014) en aangesien die kapsiedproteïen verantwoordelik is vir virale toetrede, kan 'n mutasie in hierdie virale polipeptied daartoe lei dat die toegang tot die virus vertraag of selfs heeltemal stop. sou die mutantstam nie-patogenies maak, wat dit omskep in 'n goeie kandidaat vir entstofontwikkeling. In (2017), Bogdanoff et al. gerapporteer dat serien tot prolien mutasies in die PL-2 epitoop, geleë binne die piekdomein van die kapsiedproteïen, die gemuteerde stam weerstandbiedend maak teen neutralisasie deur 'n monoklonale teenliggaam, het die skrywers tot die gevolgtrekking gekom dat, as gevolg van die minimale veranderinge wat nodig is vir 'n astrovirus om te ontsnap teenliggaamneutralisasie, moet doeltreffende entstowwe ontwerp word om 'n verskeidenheid van teenliggaamreaksies te ontlok, aangesien dit meer uitgebreide beskermingsmaatreëls teen virale infeksie sal bied.

Togaviridae

Die gesin Togaviridae bevat omhulde, ikosaëdriese (met 'n triangulasiegetal van 4) virusse, met monoparty positiewe-sin enkelstrengige RNA, wat geleedpotiges, soos muskiete, as hul natuurlike gashere het. Die RNA het 'n metielguanosien-dop aan sy 5'-punt, wat oor 'n nie-vertaalde 14-nukleotied-lang volgorde strek, en 'n polyadenylated stert aan sy 3'-end, soos die geval is vir picornavirus, word die togavirus-RNA in 'n enkele poliproteïen van 200 kDa, wat later verwerk word in polipeptiede p150 (strukturele proteïen) en p90 (RNA-afhanklike RNA-polimerase).

Die familie sluit twee genera in, Alfavirus en Rubivirus, wat menslike siektes soos Duitse masels (aka rubella) veroorsaak, sommige voorbeelde is Sindbis-virus, wat artritiese siekte veroorsaak, en Chikungunya-virus, wat gewrigspyn (artralgie) veroorsaak (Chen et al. 2018). Die studie van die mutasietempo van hierdie virusse is belangrik, aangesien dit die doeltreffendheid van menslike entstowwe beïnvloed. Die entstof wat tans teen Duitse masels gebruik word, is 'n lewendige verswakte weergawe van die virus, hierdie inenting is veral belangrik by vroue van vrugbare ouderdom, aangesien virale infeksie tydens vroeë swangerskap ernstige gevolge kan veroorsaak, soos miskrame, doodgeboortes en ernstige geboortedefekte by die kind , gedenomineerde aangebore rubella-sindroom. Veranderinge in die rubella-virusgenoom kan puntmutasies tot gevolg hê, maar dit kan ook gebrekkige-interfererende RNA's genereer, wat 'n verminderde aantal nukleotiede bevat, en gevolglik kan sommige van hierdie RNA's 7000 nt strek, alhoewel hulle gewoonlik korter is. as 300 nt (Derdeyn en Frey 1995). Waar verswakte entstowwe gebruik word, soos die geval is vir rubella, kan nuwe mutasies óf terugkeer voorkom óf dit vergemaklik. Daarbenewens kan die gemuteerde entstof nadelige reaksies vertoon, hetsy wanneer dit gebruik word as deel van 'n multivirus-entstof of wanneer dit alleen toegedien word, een so 'n voorbeeld, gerapporteer deur Domegan en Atkins in (2002), betrokke sellulêre apoptose in rot glia sel kulture. Die La polipeptied is 'n proteïen van 47 kDa wat as 'n outo-antigeen kan optree in menslike outo-immuun siektes, soos sistemiese lupus erythematosus en Sjögren-sindroom. Daar is gevind dat hierdie proteïen in sommige gevalle interaksie het met die 5'-stam lus-RNA van die rubella-virus, hierdie interaksie kan rubella-patologie beïnvloed, asook nadelige reaksies veroorsaak wanneer teen hierdie virus ingeënt word, alhoewel die voordele van rubella-inenting duidelik swaarder weeg as die risiko's . Mutasies in die 5'-stamlus lei tot 'n beduidende vermindering in die produksie van virale nie-strukturele proteïene (Pugachev en Frey 1998). Aangesien togavirusse omhulde virusse is, kan mutasies in hul geglikosileerde membraanproteïene, E1 en E2 wat 'n heterodimeer vorm, verhoed dat die virale membraan saamsmelt met die selmembraan Yang en medewerkers het in 1998 gerapporteer dat aminosuursubstitusies op posisies 81 en 109 in die E1-proteïen, het heterodimeervorming tussen E1 en E2 ontwrig, wat daartoe gelei het dat die virus membraanfusie-aktiwiteit ontbreek. Bykomende mutasies in die E1-proteïen, soos die vervanging van 'n enkele tirosienresidu in die glikoproteïen wat deur Yao en Gillam (2000) gerapporteer is, was voldoende om virusvrystelling te blokkeer. In 'n interessante publikasie in 2001 het Kakizawa et al. ontdek 21 verskillende mutasies teenwoordig in 'n verswakte stam van rubella-virus, in vergelyking met die wild-tipe stam 13 van hulle was in die nie-strukturele proteïen, terwyl 5 die strukturele proteïen beïnvloed en drie voorgekom het in die onvertaalde streek. 'n Kritieke bevinding wat deur die skrywers gerapporteer is, is dat die mutasies wat virale verswakking veroorsaak, verskil in elke entstofstam blyk te wees.

Verder is die GDD-motief wat in die p90-proteïen teenwoordig is belangrik vir RNA-replikasie, aangesien verandering van enige van die aspartaatreste virusreplikasie stop, maar puntmutasies kan ook die verswakte virus volledig herstel, wat lei tot die produksie van aansteeklike virions, wat die entstowwe onveilig maak. . Verswakking van rubella-stamme lei dikwels tot temperatuursensitiewe mutante, met mutasie van histidien by posisie 1042 in die p150-streek, noodsaaklik vir die generering van die fenotipe (Sakata et al. 2009). Bykomende newe-effekte wat deur die rubella-entstof geproduseer word, kan verband hou met die vermoë van die kapsiedproteïen om met mitochondria te reageer, wat proteïeninvoer in die organel inhibeer, hierdie saak moet aangespreek word om hierdie ongewenste effek uit te skakel wanneer entstowwe ontwerp word (Ilkow et al. 2010).

Virusse wat negatiewe sin ssRNA bevat

Bunyavirusse

Bunyavirusse is onlangs herklassifiseer as 'n bevel wat die families bevat Hantaviridae, Feraviridae, Fimoviridae, Jonviridae, Nairoviridae, Peribunyaviridae, Phasmaviridae, Phenuiviridae, en Tospoviridae. Hulle is omhulde negatiewe-sin ssRNA-virusse, filivormig in vorm, wat algemeen in geleedpotiges besmet, hoewel sommige spesies menslike patogene is, sluit laasgenoemde virusse in soos die Krim-Kongo hemorragiese koors, slenkdalkoors (met 'n sterftesyfer wat wissel van 0,5 tot 2%) en hantavirus hemorragiese koors (met 'n sterftesyfer wat 55% kan bereik). Hulle genomiese RNA is drieledig, gevorm deur 'n L-segment wat 'n RNA-afhanklike RNA-polimerase kodeer, 'n M-segment wat vir die virale glikoproteïene kodeer, en 'n S-segment wat die nukleokapsiedproteïen kodeer. Daar is tans geen gelisensieerde entstowwe vir bunyavirusse nie, alhoewel entstofstam MP-12, sowel as nie-verspreidende replikondeeltjies van die slenkdalkoorsvirus, as entstofkandidate bly, beteken dit dat dit op hierdie stadium nie moontlik is om die effek van mutasies op die verswakte virusse, wat die entstofstam in ten volle patogene virions kan omskep. Sommige skrywers het egter omgekeerde genetiese benaderings beskryf, wat die selektiewe ontwrigting van die virale deubiquitinase en deISGylase ensieme behels, om virale stamme te genereer met vermoedelike gebruik beide in terapie en as entstowwe (Scholte et al. 2017). Behandeling van bunyavirus-siektes berus egter hoofsaaklik op antivirale middels, soos ribavirien, met goeie in vitro-aktiwiteit, maar minder in vivo-doeltreffendheid. muise, verhoog oorlewing (Atkins en Freiberg 2017). Toekomstige behandelings kan voordeel trek uit die vermoë van endosymbiont-bakterieë, soos Wolbachia, om die replikasiesiklus van bunyavirusse te inhibeer, en hierdie mikro-organisme kan selfs die virions uitskakel (Schnettler et al. 2016). Natuurlik, as Wolbachia as antivirale behandeling gebruik word, kan mutasies wat die bakterie aantas die doeltreffendheid van die behandeling beïnvloed.

Rhabdovirusse en filovirusse

Rhabdovirusse en filovirusse behoort aan die Mononegavirales, 'n orde wat 'n groot aantal virusse met nie-gesegmenteerde negatiewe sin ssRNA bevat. Benewens die hondsdolheid en Ebola-virusse, sluit hierdie groep die menslike respiratoriese sinsitiale virus, masels en pampoentjies virusse in, wat almal aansienlike siektes en lyding by mense veroorsaak. Vesikulêre Stomatitis Virus (VSV) is die rhabdovirus argetipe, en Wang et al. (2015) het hierdie virus gebruik om 'n rekombinante verswakte stam te ontwikkel wat 'n goeie antigeenafleweringsplatform kan verteenwoordig om mense teen ander in te ent. Mononegavirales.

Rhabdovirusse is koeëlvormige omhulde virusse, wat ongeveer 75 nm wyd en 180 nm lank is, met 'n heliese kapsied en eenpartydige negatiewe-sin ssRNA, hulle behoort aan die genus Lyssavirus. Die volwasse virions bevat 5 proteïene, twee hiervan (L en P) vorm die polimerasekompleks, die glikoproteïen (G) maak die peplomere, die nukleoproteïen (N) is die hoofnukleokapsiedkomponent, en die matriksproteïen (M) omring die nukleokapsied . Die G-glikoproteïen, wat trimere en projekte, soos spykers, van die nukleokapsied maak, is verantwoordelik vir binding aan reseptore op die gasheerselle, en is die proteïen wat neutraliserende teenliggaampies induseer (Wiktor et al. 1973). Alhoewel sommige rabdovirusse, soos vesikulêre stomatitisvirus, interferonproduksie kan induseer, 'n sitokien wat getoon is dat dit diere beskerming bied teen virale progressie (Youngner en Wertz 1968), word verdediging teen virusse soos hondsdolheid die beste bereik deur inenting met verswakte virale stamme. Die volledige nukleotiedvolgorde van die verswakte hondsdolheidvirus SAD B19 is deur Conzelmann et al. (1990), maar dit was eers in 2008 dat Szanto en kollegas die volledige volgorde van die wasbeerhondsdolheidvirus gepubliseer het, die tweede Noord-Amerikaanse wildhondsdolheidvirusstam wat volledig gekarakteriseer is.

Rhabdovirusse toon 'n eksponensiële toename in fiksheid tydens groot populasies oordrag (fiksheid is 'n parameter wat die virus vermoë meet om te repliseer) en hierdie toename kan 5000% bereik na 50 passasies in die geval van bakterieë, soos bv. E. coli, fiksheidsverhogings is hiperbolies en bereik eers 'n maksimum van 37% na 2000 generasies (Lenski en Travisano 1994 Novella et al. 1995). Enkelnukleotiedmutasies is voldoende om die graad van fiksheid in RNA-virions te beïnvloed (Sanjuán et al. 2004a) en selfs stille mutasies kan aansienlik bydra tot aanpassing in hierdie virusse (Novella et al. 2004, 2005). Novella et al. beskryf in (2010) dat kontrolepopulasies by 'n gegewe aantal virale passasies groter fiksheidstoenames ondergaan het as mutantpopulasies. Daarbenewens verander die A-tot-I deaminase-ensieme (ADARs), wat RNA-redigering op virale negatiewe sin dubbelstrengs RNA uitvoer, adenosiene na inosiene (wat as guanosiene gelees word) wat bydra tot die mutasietempo Carpenter et al. (2009) beskryf hipermutasies in die sigma-virus, 'n rhabdovirus wat infekteer Drosophila melanogaster, genereer proteïendiversiteit in die sentrale senuweestelsel van die insek.

Dit is moeilik om die mutasies wat in hondsdolheidvirus voorkom vas te stel, aangesien baie van ons kennis afkomstig is van VSV-studies wat relevante mutasies vir laasgenoemde insluit, dié wat deur Pringle in 1970 gerapporteer is, veroorsaak deur 5-fluorouracil, 5-azacytidine en etielmetaansulfonaat, en die spontane termosensitiewe mutante wat deur Flamand ontdek is, ook in (1970). Die baanbrekerswerk van Clark en Koprowski (1971) het die generasie van "vaste" hondsdolheidvirusmutante geïdentifiseer deur behandeling met HNO2, 5-fluorouracil, of 5-azacytidine. Sommige van hierdie mutante wat ontstaan ​​het, is termosensitief (met 'n nie-permissiewe temperatuur van 40.5 °C) en vertoon 'n merkwaardig lae voorkoms van óf terugval óf lekheid, wat hulle goeie kandidate maak vir vermeende entstowwe. Die karakterisering van lae-reversie hondsdolheid virus mutante is inderdaad belangrik, aangesien Clark (1980) gerapporteer het dat reeksvermeerdering van verswakte hondsdolheid stamme teen 'n lae veelheid van infeksie, gelei het tot die verskyning van virulente revertante, waarskynlik as gevolg van selektiewe replikasie verbetering van hierdie variante tydens viruskultuur.

Die eerste stadium van infeksie vir alle omhulde virusse behels samesmelting tussen die virusomhulsel en die membraan van die teikensel hierdie proses word bemiddel deur die transmembraanproteïen G in rabdovirusse, soos hierbo genoem. Die volwasse G-proteïen assosieer in trimere (Whitt et al. 1991 Gaudin et al. 1992) en verkry hierdie konfigurasie in die endoplasmiese retikulum die vermeende samesmeltingpeptied vir hondsdolheid virus is geleë tussen aminosure 102 en 179 (Durrer et al. 1995). Ander rolle vir hierdie glikoproteïen is sy betrokkenheid by humorale en sellulêre immuunresponse, en sy rol as die eerste determinant vir neurotropisme (Badrane et al. 2001).

Seif en medewerkers het in 1985 gedemonstreer dat mutasies in die kapsied-glikoproteïen G noodsaaklik was om óf verswakte óf nie-patogene stamme van hondsdolheidvirus in die besonder te verkry, 'n puntmutasie by posisie 333, waarin arginien vervang is deur óf glutamien óf glisien, was noodsaaklik om te genereer 'n fenotipe wat avirulent is in muise. Vier jaar later het Tuffereau et al. (1989) het bevestig dat Arginine 333 absoluut noodsaaklik is vir patogenisiteit in die "vaste" rhabdovirusse CVS- en ERA-stamme, alhoewel die virusse na volle patogenisiteit kan terugkeer deur mutasies wat arginien by posisie 333 herstel (Takayama et al. 2006). Gelukkig blyk dit dat die nie-patogeniese glikoproteïengeen dominant oor die patogeniese geen is (Faber et al. 2007). Verder het Ito et al. het reeds in 1994 'n nie-patogene mutant van hondsdolheid-virus beskryf, waarin die arginien op posisie 333 bewaar is, maar ander mutasies bevat het, soos D in plaas van G by posisie 255, wat die stam nie-patogenies gemaak het. Na vervangings soos 333H, 333 N of 333Q, in hondsdolheidvirus straatstamme wat van nie-hematofaag vlermuise in Brasilië geïsoleer is, het die virions egter patogenies gebly vir volwasse muise (Sato et al. 2009) hierdie resultate bevestig die deurslaggewende rol wat gespeel word deur die aminosuur op hierdie posisie in virale patogenisiteit. Daar is oorspronklik gedink dat virusstamme wat nie die G-proteïen het nie, nie vrygestel sou kon word, deur bot, van besmette selle Mebatsion et al. berig in (1996) dat, alhoewel G-proteïen nie absoluut noodsaaklik is vir bot nie, hierdie polipeptied 'n sesvoudige toename in virusproduktiwiteit geproduseer het. Daarbenewens het Faber et al. ontdek in (2005) dat 'n enkele aminosuurverandering (Asn na Lys op posisie 194) in hondsdolheidvirus glikoproteïen G, virusverspreiding verhoog en viruspatogenisiteit aansienlik verhoog.

Mutasies in die G-proteïengeen, veral dié wat veranderinge tussen aminosure 118 en 139 induseer, is belangrik vir die membraansamesmeltingsaktiwiteit van die proteïen en meng dus in met die virale replikasie-siklus, dit is 'n belangrike oorweging vir entstofontwerp (Fredericksen en Whitt) 1995). Inderdaad, en volgens Shokralla et al. (1998), mutasies wat die karboksie-terminale gebied van die G-glikoproteïen verander, beïnvloed veral membraanfusie-aktiwiteit, substitusies van Gly 395, Gly 404, Gly 406, Asp 409 en Asp 411 met Glu, Ala, Ala, Asn, en Asn, onderskeidelik, verminder virion-sel samesmeltingsdoeltreffendheid. Verder is vervanging van 'n enkele glisienresidu in die transmembraandomein van G-proteïen genoeg om die samesmeltingsaktiwiteit van die virus af te skaf (Cleverley en Lenard 1998). Shokralla et al. (1999) het plekgerigte mutagenese gebruik om dubbelplek-mutasies in die G-proteïen van VSV te genereer, hierdie mutante kan toepaslike verswakte stamme vir entstofontwikkeling verteenwoordig, alhoewel selfs dubbele mutante na volle infektiwiteit kan terugkeer, alhoewel teen 'n baie lae koers. In 2002 het Langevin en Tuffereau nuwe mutasies in hondsdolheidvirus ontdek wat buite die gebiede wat tot dusver as antigenies geïdentifiseer is, gekarteer is, hulle het 'n serien- of 'n valienresidu ingesluit wat 'n fenielalanien by posisie 318 vervang, en 'n tirosien of 'n arginien wat 'n histidienresidu op posisie vervang 352 in beide gevalle het die mutasies weerstand teen neutralisasie deur die neurotrofienreseptor p75NTR verleen. Alto et al. (2013) het die evolusie van VSV genomiese RNA bestudeer, in omgewings óf onder konstante óf wisselende temperature, en berig dat, onder enige van die omgewingstoestande wat getoets is, die meerderheid genoomvervangings in die G-glikoproteïengeen plaasgevind het, wat die belangrikheid van hierdie polipeptied voorstel. in rhabdovirus aanpassing by veranderende termiese toestande.

Mutasies in die L-polimerase kompleks en die leier-N geen verbinding is ook belangrik in entstof ontwerp, aangesien verswakte entstowwe wat mutasies in hierdie gene bevat kan terugkeer na 'n kwasi-wilde tipe, of selfs na 'n wilde-tipe, en ondergaan 'n produktiewe patologiese siklus. Gevolglik het Chuang et al. (1997) het die oorskakeling van transkripsie na genoomreplikasie in VSV polR-mutante, wat gebrekkig is in RNA-replikasie, bestudeer en tot die gevolgtrekking gekom dat die L-proteïen tweedeplek-onderdrukkers vir polR bevat, wat die RNA-polimerase na replikasiemodus oorskakel om virions te genereer.

Die matriksproteïen (M) is betrokke by die onderdrukking van β interferon geenuitdrukking, dit word bereik deur 'n algemene inhibisie van beide RNA en proteïensintese in die geïnfekteerde sel (Ahmed et al. 2003). Gevolglik sal enige mutasie in M ​​wat hierdie vermoë ophef, ten minste in beginsel virusneutralisasie deur die gasheerinterferonstelsel vergemaklik.

Die matriksproteïengeen verteenwoordig 'n goeie teiken vir mutasiestudies, aangesien hierdie polipeptied neurale mitochondria teiken wat sellulêre apoptose veroorsaak (Gholami et al. 2008), dus 'n gemuteerde M wat nie in staat is om β-interferon geenuitdrukking te onderdruk of sellulêre apoptose te induseer nie, sou 'n goeie kandidaat wees. om in die ontwerp van verswakte rhabdovirus-entstowwe in te sluit. Die M-proteïene van hierdie virusse beheer ook intrasellulêre virusophoping, wat 'n deurslaggewende faktor in siekte-ontwikkeling is. Finke et al. (2010) het chimeriese hondsdolheidvirusse gekonstrueer, met hul M-proteïene wat deur lyssavirus M-proteïen vervang is, en die rol van M-proteïene in intrasellulêre virus-akkumulasie bevestig. Meer onlangs het Ke et al. (2017) het berig dat die M-proteïen van die hemorragiese septisemie-virus 'n rol speel in die onderdrukking van gasheertranskripsie, dit sluit onderdrukking van die interferonrespons en die antivirale geenuitdrukking in.

Mutasies in die rhabdovirus N-proteïen is ook waardevol Masatani et al. beskryf in (2011) dat die aminosure geleë op posisies 273 en 394, in hondsdolheid virus N proteïen, belangrik is nie net vir patogenisiteit nie, maar ook vir die ontduiking van retinoïensuur-induseerbare geen I (RIG-I)-gemedieerde ingebore immuniteit.

Nog 'n belangrike oorweging is die feit dat 'n toename in die koers van N-glikosilering in die G-proteïen (die algemene N-glikosileringsplekke is Asn-37 en Asn-319, met 'n bykomende plek by A-247), kan soms lei tot die generering van verswakte rhabdovirus-stamme (Yamada et al. 2012). Die skrywers het gerapporteer dat opeenvolgende deurgang van 'n straathondsdolheidvirus in muisneuroblastoomselle stamme met laer patogenisiteit geproduseer het, as gevolg van die verhoogde glikosilering hierbo beskryf, wat hulle effektiewe verswakte stamme maak. Yamada et al. berig in (2014) dat doeltreffend N-glikosilering by posisie 37, maar nie by posisie 146 nie, in die straathondsdolheidvirus glikoproteïen, het gelei tot verminderde virale patogenisiteit. Nietemin, om die risiko van mutasie-terugkeer te vermy, is dit verkieslik om entstofstamme te gebruik wat veelvuldige mutasies bevat, in die gene wat vir proteïene G, N en M kodeer, in teenstelling met enkelmutasies (Nakagawa et al. 2012) alhoewel daar altyd die gevaar van die ophoping van veelvuldige mutasies, byvoorbeeld deur reeksgange in BHK-selle, wat die verswakte hondsdolheidvirusse hipervirulent kan maak (Virojanapirom et al. 2012).

Mutasies in die L-proteïen van rhabdovirusse blyk ook belangrik te wees Tian et al. (2015) het gerapporteer dat aminosure K1685 en K1829 in die L-proteïen betrokke is by patogenisiteit en virale immuunontduiking, wat 'n potensiële gebruik vir mutans in hierdie residue in beide terapeutika en as 'n instrument om avirulente hondsdolheid-entstowwe te produseer. Boonop het mutasies in die hoogs bewaarde gebied van die proteïen, wat ooreenstem met posisie 1914–1933 (NPYNE), pleiotropiese effekte op die virusbiologie, volgens Nakagawa et al. (2017) het die skrywers voorgestel dat hierdie mutante nuttig kan wees in die ontwerp van verswakte entstowwe.

Epistase, die interaksie tussen gene, is ook 'n belangrike onderwerp wat 'n groot rol speel in hoe verskillende mutasies rhabdovirus fiksheid beïnvloed. Hierdie onderwerp is aangespreek deur Sanjuán et al. in hul (2004b) publikasie het die skrywers 47 gemuteerde VSV-genotipes gegenereer en die kompenserende aanpassing vir virions vergelyk met een of twee skadelike mutasies. Hulle het berig dat verskeie pare mutasies beduidende interaksies getoon het wat virale fiksheid beïnvloed het, dit sluit in antagonistiese ('n paar mutasies wat saam 'n kleiner effek skep as die som van die twee individuele effekte) en sinergistiese epistase (wanneer die effek op fiksheid van die twee mutasies saam groter is as die som van die twee individuele mutasies). In 'n latere publikasie het Sanjuán en Elena (2006) tot die gevolgtrekking gekom dat, terwyl eenvoudiger RNA-genome gewoonlik antagonistiese epistase vertoon, meer komplekse genome geneig is om sinergisme te vertoon.

'n Aantal antivirale middels teen rhabdovirus is beskryf, dit sluit hoogs gesulfateerde K5 in E. coli polisakkariedderivate (Cagno et al. 2014), wat menslike infeksie effektief deur respiratoriese sinsitiale virus inhibeer (Villa et al. 2017) Chattopadhyay beskryf in (2006) dat 'n klein kationiese proteïen, uit die eierwit van die skilpad Caretta caretta, is 'n doeltreffende antivirale verbinding teen rhabdovirusse (Chattopadhyay et al. 2006). Natuurlik word die antivirale doeltreffendheid van hierdie molekules beïnvloed deur virale mutasies wat hierdie virusse weerstandig teen hulle kan maak.

Ebolavirus is waarskynlik die bekendste lid van die Filoviridae familie, ander lede sluit in Marburg-virus en Cuevavirus laasgenoemde, wat onlangs as Lloviu-virus gemerk is, is vernoem na 'n grot in Asturië, Spanje, deur Negredo et al. (2011). Filovirus veroorsaak ernstige, hoofsaaklik dodelike, hemorragiese koors by mense. Die Filoviridae familie sluit twee klassieke genera in, Marburgvirus, met verskeie stamme, en Ebolavirus, wat ses spesies insluit, Soedan, Zaïre, Ivoorkus, Reston (eerste Ebolavirus in soogdiere anders as primate), Bundibugyo (Towner et al. 2008), met bogenoemde Cuevavirus as die mees onlangse toevoeging (Negredo et al. 2011). Dit is denkbaar dat nuwe genera in die nabye toekoms by die filovirusgroep gevoeg sal word, aangesien nuwe diere en ekosisteme bestudeer word, as gevolg van die genetiese drywing van hierdie virusse. Soos dit algemeen bekend is, Marburgvirus is beskryf in 1967, in Marburg, Duitsland, tydens 'n toevallige laboratorium-uitbraak terwyl Ebolavirus is in 1976 in Yambuku, Zaïre, opgespoor en toon 'n sterftesyfer wat 90% kan bereik.

Hierdie virusse bevat lang silindriese/buisvormige nukleokapsiede (tot 1000 nm lank), wat blykbaar knope op hul oppervlaktes vertoon, 'n voorkoms tipies van hierdie virusse wanneer dit onder die elektronmikroskoop ondersoek word. Die genoom is monopartiet, met 'n negatiewe sintuig enkelstring-RNA van ongeveer 19 000 nukleotiede, die genoom kodeer vir sewe strukturele proteïene en is georganiseer: 3'–leier–NP (nukleoproteïen)–VP35 (komponent van die virale RNA polimerase kompleks, dit vorm 'n virale samestellingsfaktor wat ook gasheerinterferonproduksie inhibeer)–VP40 (matriksproteïen wat die plasmamembraan binnedring)–GP/sGP (glikoproteïen wat 7–10 nm lange spykers vorm)–VP30 (RNA-bindende proteïen, dien as 'n transkripsie-aktiveerder)– VP24 (multifunksionele sekondêre matriksproteïen)–L (RNA-polimerase)–sleepwa–5′. In teenstelling met hondsdolheid-entstof, wat beskikbaar was vanaf die tyd van Louis Pasteur, in die negentiende eeu, het die entstof vir Ebolavirus eers in Desember 2016 beskikbaar geword, dit is 'n rekombinante vesikulêre stomatitis-virus-Ebola-entstof, goedgekeur vir mediese gebruik in die Europese Unie en Verenigde State in 2019. Vroeëre entstowwe was suksesvol in nie-menslike primate, hulle het óf adenovirusvektore bevat wat kodeer vir gemodifiseerde Ebola GP polipeptiede (Sullivan et al. 2006), óf Ebola-stamme wat nie VP30 het nie (Halfmann et al. 2009). Lázaro-Frías en kollegas het in 2018 'n nuwe strategie vir entstowwe teen Ebolavirus, het die skrywers die gebruik van pokkevirusse voorgestel wat GP- en VP40-antigene uitdruk.

Ebola-virusse vertoon hoë mutasietempo's, in die orde van 2.0 × 10 −3 substitusies per plek per jaar (Jenkins et al. 2002) wat van besondere belang is, is daardie mutasies wat oppervlakglikoproteïene beïnvloed, wat interaksie het met die twee virale reseptore, Niemann-Pick Tipe C1 (Carette et al. 2011) en TIM-1-reseptore (Kondratowicz et al. 2011 Yuan et al. 2015). Matassov et al. (2015) het die belangrikheid van hierdie glikoproteïene in immunisering uitgelig, hulle het 'n rekombinante vesikulêre stomatitisvirus gebruik met sy glikoproteïene verwyder en vervang deur die Ebola GP polipeptiede. Daarbenewens het Lennemann en kollegas, ook in 2015, die rol van mutasies op die glikoproteïen GP2 bestudeer, en gevind dat sommige van die mutasies virusfusie na die gasheermembraan gestop het. Sodra die virus geïnternaliseer is, word glikoproteïen GP verwerk deur die proproteïen convertase furien, wat die proteolitiese produkte GP1 en GP2 wat noodsaaklik is vir Ebola virus patogenisiteit ontstaan ​​(Volchkov et al. 1998). Watanabe en kollegas het in 2000 gedemonstreer dat die opgerolde spoel-motief wat in GP2 voorkom, 'n belangrike rol speel om die toegang van Ebola-virus in die gasheerselle te vergemaklik. Die GP-glikoproteïen bevat 'n hoogs gekonserveerde hidrofobiese streek (wat residue 524-539 insluit) en mutasies in daardie streek, wat aminosuurvervangings soos I532R, F535R, G536A en P537R behels, skakel infektiwiteit byna heeltemal af (Ito et al. 1999). Boonop is mutasies van die twee fenielalanienreste, wat in twee lineêre domeine van GP1 gevind word, van kritieke belang vir virale sel toetrede, dit bied op sy beurt 'n nuwe teiken vir entstowwe en antivirale terapieë (Mpanju et al. 2006). Die fenielalanien by posisie 88 blyk die belangrikste te wees vir gasheerseltoetrede, terwyl die residu by posisie 159 'n minder relevante rol speel, aangesien dit slegs indirek betrokke is (Ou et al. 2010). Dit is egter belangrik om in ag te neem dat mutasies in die omhulselglikoproteïene van Ebola-virusse soms slegs virale toegang op 'n gasheerspesie-spesifieke wyse beperk, soos gerapporteer deur Martínez en kollegas in 2013. Verder, 'n enkele alanien-tot-valien-aminosuur vervanging in die oppervlak glikoproteïen, A82V mutasie, kan virale stamme meer patogenies vir mense maak die Ebola-epidemie van 2013–2016, veroorsaak deur een so 'n stam, het meer as 28 000 mense besmet, meer as die kombinasie van alle vorige uitbrake, en het gelei tot 11 000 ongevalle (Diehl et al. 2016, Bedford en Malik 2016). Bykomende mutasies in GP, ​​soos aminosuursubstitusies R29V, T206M en T230A, gerapporteer deur Urbanowicz et al. (2016), het aan die lig gebring dat daardie mutasies addisionele verhogings in primaatspesifieke infektiwiteit verskaf het.

Prins et al. (2010) het die effek van mutasie in VP35 bestudeer, hulle het twee aminosuurvervangings, K319A en R322A, ingestel in die proteïen wat die VP35 dsRNA-bindingsaktiwiteit heeltemal opgehef het, hierdie veranderinge het verhoed dat die Ebola-virus proefkonyne besmet, wat die belangrikheid van hierdie tipe beklemtoon van stamme in entstofontwikkeling.

Dit is nietemin belangrik om die stelling van Olabode et al. (2015) wat aandui dat “Ebola-virus besig is om te ontwikkel maar nie te verander nie”, aangesien geen funksionele veranderinge in die verskillende uitbrake van die siekte, van 1976 tot 2014, geïdentifiseer is nie.

Ortomixovirus

Die Orthomyxoviridae familie bevat ssRNA van negatiewe polariteit, gewoonlik saamgestel uit ses tot agt polyadenylated segmente, ingesluit in 'n heliese kapsied hulle is omring deur 'n membraan waaruit twee polipeptiede uitsteek, een van die proteïene vertoon ensiematiese aktiwiteit, terwyl die ander interaksie het met rooi selle (neuraminidase) , en hemagglutinien onderskeidelik). Beide hemagglutinien en neuraminidase is immunologies onafhanklike komponente van die virale oppervlak (Seto en Rott 1966), en serologiese toetse het aangedui dat die oppervlakantigene in groep A-griepvirus 'n wye antigeniese variasie vertoon (Pereira 1967 Tůmová en Pereira 1968 Pereira 1969 Schild en Newman 1969). ). Dit het gou duidelik geword dat die neuraminidase van sekere voëlgriep A-stamme nou verwant is aan die ensiem wat in menslike griepvirusse teenwoordig is. vir die ensiem teenwoordig in menslike stamme is hierdie resultate bevestig deur Easterday et al. (1969), wat inhibisie- en immunopresipitasietoetse uitgevoer het. Webster en Pereira het reeds in (1968) beskryf dat griepvirusse van menslike en voëlbronne 'n gemeenskaplike oppervlakantigeen deel. Hierdie noue verwantskap tussen die neuraminidase-ensiem in menslike en voëlvirusse dui op 'n genetiese interaksie, in die natuur, tussen griepstamme van verskillende gashere, wat lei tot die antigeenbestraling wat waargeneem word in die stamme wat regoor die wêreld sirkuleer.

Die Orthomyxoviridae familie sluit vier genera in, Thogotovirus, Isavirus, Quaranjavirus en Influensavirus laasgenoemde is die bekendste, vanweë die relevansie daarvan vir menslike gesondheid, en word in vier groepe geklassifiseer, A, B, C en D. Thogotovirus is oorspronklik as deel van die ou geklassifiseer Arboviridae familie, met gashere onder beide gewerweldes en ongewerweldes (Albanese et al. 1972). Isavirus (Hellebø et al. 2004) infekteer hoofsaaklik euryhalien visse wat aan die genus behoort Salmo (m.a.w. S. salaris) terwyl Kwaranjavirus, met Quaranfil virus as die tipe spesie, behoort aan 'n familievertakking wat hoogs afwyk van die res van ortomiksovirus, en is geïsoleer van Rhipicephalus bosluise (Choletti et al. 2018). Die prominente genus, Griep, produseer gereelde pandemies by mense, wat groepe B en C behels, maar hoofsaaklik groep A, laasgenoemde ondergaan gereelde antigeenverskuiwings, wat jaarlikse inenting teen die seisoenale stam vereis, wat hierdie groep die mees waarskynlike maak om 'n wêreldpandemie te produseer (Gasparini et al. 2014) ). Groep D is die mees onlangs ontdekte, en is geïsoleer van varke en beeste met respiratoriese sindrome (Hause et al. 2014 Collin et al. 2015 Barberis et al. 2016).

Niemand bevraagteken tans die feit dat griep deur 'n virus veroorsaak word nie, maar dit was nie die geval aan die einde van die negentiende eeu, of selfs gedurende die eerste twee dekades van die twintigste eeu, toe daar verkeerdelik aanvaar is dat die siekte veroorsaak is nie. deur 'n bakterie, genoem Bacillus influenzae (Twort en Twort 1921). Bykomende wanopvattings oor die etiologiese middels van ander virussiektes word beskryf in die oorsig deur Villa et al. (2018).

Die verkeerde naam, berugte "Spaanse griep" (Januarie 1918–Desember 1920) is veroorsaak deur die Griep A-pandemie-stam N1H1, 'n ortomiksovirus wat gene van voëloorsprong bevat, wat meer as 500 miljoen mense besmet het en na raming 50 tot 100 mense veroorsaak het. 3–6% van die destydse menslike bevolking). Dit was die tweede bekende grieppandemie wat oor die wêreld versprei het (Villa et al. 2018) die eerste goed gedokumenteerde wêreldwyd het in 1580 plaasgevind, dit het in Asië begin en na Europa versprei, via Klein-Asië, en Noordwes-Afrika, en uiteindelik die Amerikas (Potter 2001). Meer onlangse pandemiegolwe sluit die "Asiatiese griep" in, dit is ontstaan ​​deur 'n voël H2N2-virus wat in 1957 in China begin het en na raming twee miljoen sterftes wêreldwyd veroorsaak het, die "Hongkong"-griep van 1968, geproduseer deur 'n H3N2-griep A-virus wat het gelei tot een miljoen sterftes terwyl 'n nuwe stam van N1H1 in die 2009-pandemie ontstaan ​​het met die vermoë om nie net mense te besmet nie, maar ook verskeie dierspesies, soos varke, perde en voëls. Barberis en medewerkers het in (2016) 'n interessante resensie oor die geskiedenis van griep gepubliseer. Alhoewel die griepvirus 'n neiging toon om pandemies te skep, is dit nie die geval vir ander lede van die Orthomyxoviridae familie.

Pandemiegolwe word nie net deur virusse geproduseer nie, maar kan ook die gevolg wees van bakteriële infeksies dit is die geval vir die "swart dood", wat deur die bakterie veroorsaak word Yersinia pestis en bekend as builepes, wat verskeie infeksiegolwe veroorsaak het en gelei het tot die dodelikste pandemie in die geskiedenis van die mensdom. Daar is 'n aantal pandemies, veroorsaak deur hierdie bakterie, wat in die geskiedenis van die mens aangeteken is, dit sluit in die Justiniaanse plaag in die sesde eeu, wat na raming 20–50 miljoen mense doodgemaak het die Middeleeue plaag in die veertiende eeu, wat Europa geteister en veroorsaak het 'n geskatte 75-200 miljoen sterftes, wat meer as 'n derde van die Europese bevolking van die tyd verteenwoordig. Die laaste buile-pandemie het in die middel van die negentiende eeu in China ontstaan ​​en vinnig na die Amerikaanse vasteland versprei, as gevolg van skeepvaart haweverkeer het die Wêreldgesondheidsorganisasie nie verklaar dat hierdie pandemie tot 1959 geëindig het nie, hoewel daar 'n verdere uitbreking was. in Indië, in 1994, wat 50 sterftes veroorsaak het.

Viroloë het 'n deurlopende genetiese variasie in griepvirusse geïdentifiseer, wat nie in ander virale families soos Rhabdovirus of Coronavirus voorkom nie, wat 'n antigeniese drywing veroorsaak wat lei tot die variasie in die virale oppervlakantigene. Hierdie antigeniese variasie is verantwoordelik vir die griepvirus wat die immuniteit ontduik inenting met die vorige jaar patogeniese stam, dus vereis dat 'n doeltreffende entstof jaarliks ​​opgedateer moet word. Alhoewel wetenskaplikes hul pogings hernu het om 'n "universele griep-entstof" te verkry, bly hierdie saak steeds 'n uitdaging (Wiersma et al. 2015 Barberis et al. 2016). Volgens Barberis en kollegas sluit “huidige navorsingsprioriteite die ontwikkeling van 'n universele griep-entstof in wat beskerming teen alle griepvirusstamme kan bied, en sodoende die uitdagings oorkom wat te staan ​​kom as gevolg van antigeniese dryf en verskuiwing of van samesirkulasie van verskillende virale stamme”. Reeds in (1973) het Kendal en Kiley 'n artikel gepubliseer oor die antigeniese divergensie tussen die neuraminidases van Asiatiese en Hongkongse griepvirusse, en het hierdie divergensie geassosieer met kort veranderinge in die primêre struktuur van die neuraminidase, maar die volle kompleksiteit van hierdie saak het nie duidelik geword totdat dit ontdek is dat griepvirusse van verskillende oorsprong kan rekombineer om óf heeltemal nuwe virale stamme te ontstaan ​​(Desselberger et al. 1978), óf ten minste hul genetiese variasie te verhoog (Young en Palese 1979).

Paramyxovirusse

Die bekendste lede van die Paramyxoviridae familie is die veroorsakende middels van masels en pampoentjies hulle is hoogs aansteeklik, omhulde virusse wat negatiewe sin enkelstrengige RNA bevat, wat tot die genus behoort Morbilivirus en Rubulavirus, onderskeidelik. Die natuurlike gashere van hierdie virusse is mense, en geen ander dierereservoir is tot dusver beskryf nie. Die maselsvirus is oorspronklik in 1954 geïsoleer, en die Wêreldgesondheidsorganisasie erken tans 24 verskillende stamme van hierdie virus, wat behoort aan agt klades genaamd A, B, C, D, E, F, G en H. Die eerste doeltreffende maselsentstof is ontwikkel deur Maurice Hilleman, gelisensieer in 1963 en beraam om meer as een miljoen sterftes per jaar te voorkom, hoewel onlangse data aandui dat maselsvirus steeds verantwoordelik is vir meer as 100 000 sterftes elke jaar. Masels word in sommige ontwikkelde lande as uitgeroei beskou, maar besmet steeds baie mense in nie-ontwikkelde lande (Shi et al. 2011). Soos die geval is vir ander patogene virusse, is dit noodsaaklik om die mutasietempo van die virale stamme te identifiseer, nie net vir entstofontwikkeling nie, maar ook om die waarskynlikheid van antiviraal-weerstandige populasies te skat. Die maselsvirion vertoon mutasietempo's soortgelyk aan ander ssRNA-virusse in die laboratorium, met 'n beraamde mutasietempo van 1,43 per replikasie (Schrag et al. 1999), terwyl die virus hoë genetiese stabiliteit in die natuur vertoon (Rima et al. 1997) so verskillend virale gedrag in die twee omgewings bly onverklaarbaar.

Nichols (1963) en Nichols et al. (1965) het in hul publikasies gerapporteer dat groei van die maselsvirus in vitro chromosoomskade veroorsaak het (hoofsaaklik breuke) hierdie chromosomale abnormaliteite is ook gerapporteer as gevolg van maselsinenting (Levenshtam et al. 1969). Die Edmonston-stam van maselsvirus is beskryf om polyokaryositose te veroorsaak, waarin die polikaryosietkerne geneig is om te versmelt (Heneen et al. 1970) terwyl in (1971), Parker et al. berig dat inenting met 'n verswakte maselsvirusstam 'n infeksie in die menslike sentrale senuweestelsel kan veroorsaak. Ten spyte van hierdie ernstige newe-effekte wat hierbo beskryf is vir die entstof, Mina et al. (2019) het berig dat dit van kardinale belang bly om voort te gaan met wydverspreide inenting teen masels, want benewens die sterftes wat direk deur die virus veroorsaak word, lei maselsinfeksie groot nadelige gevolge in die individue wat oorleef. Hierdie skrywers het tot die gevolgtrekking gekom dat infeksie deur hierdie virus 'n progressiewe verlies van bestaande humorale teenliggaampies by die pasiënt veroorsaak, wat die beskerming van die immuungeheue teen 'n verskeidenheid siektes, insluitend griep, uitskakel. Hierdie resultate, saam met onlangse data wat aandui dat maselsinfeksies langdurige immuunonderdrukking by ongeënte kinders veroorsaak (Petrova et al. 2019), benewens die beskryfde vermoë van die maselsentstof om immunologiese weerstand teen 'n verskeidenheid bakteriese en viruspatogene te verbeter, beklemtoon die belangrikheid van die handhawing van wêreldwye masels-inentingsprogramme.

Daar is voorgestel dat die maselsvirus 'n paradigma van virale stabiliteit in die veld is, aangesien die antigeniese samestelling van die entstof wat gebruik word om dit te voorkom doeltreffend gebly het sedert dit ontwikkel is, in die 1960's, en beskerming verleen teen die 24 sirkulerende genotipes ( Muñoz-Alía et al. 2017). Hierdie skrywers het ook 'n nuwe D4-subgenotipe (D4.2) van die maselsvirus gerapporteer, wat daarop dui dat, alhoewel genomiese drywing plaasvind, dit blyk te gebeur teen 'n baie laer tempo in masels as in lede van die Orthomyxoviridae familie. Die nuwe subgenotipe verteenwoordig 'n verre evolusionêre familielid in die D4 genotipe en, in teenstelling met ander maselsstamme, is dit onderskeibaar deur neutralisasie met teenliggaampies wat teen die virale epitoop NE opgewek is. Sommige virusvariante van die H-klade in China blyk soortgelyke ontwikkelings te ondergaan (Shi et al. 2011). Ten slotte en, ten spyte van die genetiese stabiliteit van die masels virions, is dit waarskynlik dat daar in die toekoms 'n behoefte sal wees om die entstowwe wat tans oor die hele wêreld gebruik word om hierdie siekte te bekamp, ​​by te werk.

Die pampoentjiesvirus, soos hierbo aangedui, is die tweede klassieke voorbeeld van 'n paramyxovirus die siekte wat dit veroorsaak, is lank reeds bekend dat dit hoofsaaklik kinders affekteer, alhoewel dit ernstige simptome by volwassenes kan veroorsaak, insluitend orgitis wat tot manlike onvrugbaarheid kan lei. Die naam "pampoentjies" is die algemene naam wat aan die siekte gegee word in plekke soos Engeland, maar dit staan ​​bekend as "brink" in Skotland, hoewel mediese praktisyns die benaming "angina maxillaris" verkies, veral na Hamilton se publikasie in 1790. Die siekte word gekenmerk deur die pynlike swelling van een of albei parotis speekselkliere en hoewel die sterftesyfer laag is vir hierdie siekte, kan pasiënte newe-effekte ontwikkel soos goedaardige torticollis (McGavin 1913), meningitis (Wollstein 1921), insluitend dodelike meningitis (Griebel). en Schnee 1950), pankreatitis, ontsteking van die hart (Rosenberg, 1945), permanente doofheid (Barr 1889), ernstige diabetes mellitus en pulmonale tuberkulose (Gilhespy en Holden 1917), sowel as die orgitis hierbo genoem (Burne 1851 Hviid et al. . 2008). Die siekte word tans, in ontwikkelde lande, deur 'n entstof voorkom, hetsy op sy eie of in kombinasie met rubella en masels Maurice Hilleman is verantwoordelik vir die ontwikkeling van meer as 40 entstowwe, insluitend masels en pampoentjies (Buynak et al. 1969). Die huidige entstof is beskryf om slegs ongeveer 80% van die ingeënte bevolking ten volle te beskerm (Schlegel et al. 1999), met die oorblywende 20% slegs gedeeltelik beskerm.

Die pampoentjiesvirus genomiese RNA is negatief-sin en enkelstrengs, dit bevat 15 384 basisse wat nege proteïene kodeer, en vertoon lae genetiese drywing. Laasgenoemde word ondersteun deur die feit dat die entstof teen hierdie virus vir soveel jare doeltreffend is. Die Wêreldgesondheidsorganisasie het in 2015 twaalf genotipes vir die pampoentjiesvirus (van A tot N, E en M uitgesluit) erken, gebaseer op die nukleotiedvolgorde van twee gene, 'n klein hidrofobiese (SH) en die hemagglutinien-neuraminidase (Jin et al. 2015). Na opeenvolging van 'n verskeidenheid siekteveroorsakende pampoentjiesvirusse, is ontdek dat die graad van genetiese divergensie (heterogeniteit) vir die klein hidrofobiese geen 20% is, terwyl dit slegs 9% vir die hemagglutinien-neuraminidase geen is. Hierdie genomiese drywing stem ooreen met die velddata oor die doeltreffendheid van die entstowwe wat tans gebruik word. Roetine-monitering van die virale genetiese variasie, in beide masels en pampoentjies, is egter noodsaaklik om die molekulêre diagnostiek van die virusse te verbeter, dit kan maklik en vinnig bereik word deur volgende-generasie volgordebepaling (Dilcher et al. 2018). Deur hierdie tegniek te gebruik, het Willocks et al. (2017) het in Skotland gedemonstreer dat 'n uitbreking van pampoentjies in die studentepopulasie met hoë inentingsyfers veroorsaak is deur 'n virusstam wat 'n genetiese variasie bevat, dit beklemtoon weereens die behoefte aan waaksaamheid in die gesondheidsowerhede, om die doeltreffendheid van entstowwe. 'n Klassieke voorbeeld hiervan is die Urabe AM9-pampoentstof, wat bestaan ​​uit 'n mengsel van virusse met verskillende aminosure op posisie 335 in die hemagglutinien-neuraminidase (Brown et al. 1996), wat verskille in verswakkingskoerse getoon het wanneer dit in die rotneurovirulensie getoets is model (Shah et al. 2009 Schinkel et al. 2017).


2. Aflewering van CRISPR/Cas9 in teikenselle

4.2 kDa) van die SpCas9 endonuklease. AAV-vektore beskik oor beperkte kapasiteit (≤4.7 kb), wat meestal deur die SpCas9 opgebruik word en bykomende modifikasies belemmer. Alhoewel AAV-vektore gewoonlik in 'n ekstra-chromosomale vorm gehandhaaf word, is hoë vlakke van AAV-integrasie gevind in CRISPR-geïnduseerde dubbelstring-breuke (DSB's) in vitro en in vivo. Adenovirusse en lentivirusse kan beide Cas9 en sgRNA in 'n enkele vektor bevat, daarom is die toepassing meer eenvoudig. Die langdurige uitdrukking van CRISPR-komponente en integrasie in die gasheergenoom veroorsaak egter meer gereelde buite-teiken-effekte. Ongelukkig veroorsaak alle virale vektore immuunresponse [17,18,19,20,21,22].

10% onderskeidelik). Boonop was twee keer soveel ES-selle lewensvatbaar na RNP-aflewering, wat daarop dui dat hierdie metode minder sitotoksies is. Nog 'n voordeel van RNP-gebruik is die vermindering in buite-teiken mutasies. Die verhouding van op-tot-af-teiken-effekte in K562-selle was 2,65-voudig tot 14-voudig hoër wanneer RNP's afgelewer is as in vergelyking met plasmiede [23].


Deel 7: Sentrifugering en Chromatografie

A) Basiese beginsels

a. Sentrifugering

Sentrifugering word dikwels gebruik om stowwe van verskillende grootte, digtheid en lengte te skei. Die sentrifuge draai 'n buis wat 'n vloeistofmengsel bevat met stowwe soos proteïen, DNA en RNA. Nadat die buis teen hoë spoed geroteer is, sal digter stowwe en dié met minder oppervlakte (meer aërodinamies) gevind word na die kant van die buis verder van die middel van die sentrifuge, terwyl minder digte stowwe na die kant van die buis nader geleë sal wees. die middel van die sentrifuge.

Dink aan die digte stowwe soos die klere in jou wasmasjien. Jy het dalk opgemerk dat wanneer jy die wasmasjien oopmaak, al die klere aan die binnewande van die wasmasjien vassit, en hulle is nie naby die middel van die wasmasjien nie. Dit is presies wat met die digter materiale in jou gesentrifugeerde mengsel gebeur!

Nadat jy 'n mengsel sentrifugeer, is daar dikwels twee komponente in die buis. Die eerste staan ​​bekend as die korrel, en dit is 'n vaste stof. Soos jy dalk kan raai, vind jy die korrel aan die einde van die buis wat verder van die middel van die sentrifuge was. Hierdie vaste stof word gevorm soos die digte deeltjies die einde van die buis bereik en bo-op mekaar gestapel word. Die tweede komponent staan ​​bekend as die supernatant. Hierdie komponent is vloeibaar en bestaan ​​uit minder digte deeltjies.

Wetenskaplikes gebruik sentrifugering en chromatografie om spesifieke molekules uit 'n groot mengsel van ander molekules te isoleer. Jy begin gewoonlik 'n isolasie deur sentrifugering te gebruik, maar om a baie spesifieke stof, gebruik ons ​​dikwels verskeie vorme van chromatografie. In elk van die verskillende vorme van chromatografie voeg jy jou ongesuiwerde mengsel of mobiele fase na die bokant van 'n vertikale kolom wat geïmmobiliseerde ione, krale, proteïene of ander materiale bevat. Hierdie geïmmobiliseerde stowwe word die genoem stilstaande fase. Die stilstaande fase beweeg nooit, en dit bly vas binne die kolom.

Die stowwe in jou mobiele fase gaan deur jou kolom omdat hulle onderhewig is aan gravitasiekragte, en jy onthou gedeeltes van die mobiele fase soos hulle die onderkant van die kolom verlaat in verskeie verskillende houers, of "breuke". Die eerste breuk sal die materiaal in die mobiele fase bevat wat die vinnigste deur die kolom beweeg het, terwyl die laaste breuk die materiaal sal bevat wat die stadigste beweeg het. Die stowwe beweeg teen verskillende snelhede op grond van hul interaksies met die stilstaande fase, en jy kies die inhoud van die stilstaande fase op grond van wat jy probeer isoleer. Kom ons kyk na 'n spesifieke vorm van chromatografie!

b. Gelfiltrasie (grootte uitsluiting) chromatografie

In gel filtrasie (grootte uitsluiting) chromatografie, jy skei komponente op grond van hul grootte. Om dit te doen, maak jy krale aan jou kolom vas om die stilstaande fase te vorm. Grootte-uitsluitingskrale het klein paadjies wat slegs klein deeltjies kan binnegaan. Wanneer jy jou mobiele fase deur hierdie krale gooi, sal die groot deeltjies baie vinnig deur die kolom beweeg, want hulle sal nie die krale binnegaan nie, en jy sal daardie groter molekules in die eerste breuk vind. Die klein deeltjies sal deur die klein paadjies in die krale beweeg. Hierdie paadjies is soortgelyk aan 'n doolhof, so dit sal langer neem vir die klein deeltjies om die einde van die kolom te bereik. Gevolglik sal die klein deeltjies in die latere breuke gevind word.

c. Ioonuitruilchromatografie

In ioonuitruilchromatografie, is die stilstaande fase saamgestel uit een tipe gelaaide ioon (positief of negatief). In anioon-uitruiling chromatografie, is jou stilstaande fase saamgestel uit baie positief gelaaide stowwe wat negatief gelaaide (anioniese) stowwe in die mobiele fase aantrek. Die naam verwys na die ioon wat na die stilstaande fase aangetrek word!

Net so, in katioonuitruilchromatografie, is jou stilstaande fase saamgestel uit baie negatief gelaaide stowwe wat positief gelaaide molekules in die mobiele fase aantrek. Die aangetrokke stowwe sal stadiger deur die kolom beweeg as wat die ander stowwe sal.

Die interaksie tussen die molekules van die mobiele fase en die stilstaande fase kan uiteindelik baie sterk wees. Byvoorbeeld, in 'n katioonuitruiling kan die katione in die mobiele fase so aangetrokke wees tot die negatief gelaaide stilstaande fase dat hulle dit nie uiteindelik uit die onderkant van die kolom maak nie. Op daardie stadium is dit nodig om elueer die katione, en elueer is net 'n fancy woord vir "losmaak uit die kolom."

d. Affiniteitschromatografie

Die laaste tipe chromatografie staan ​​bekend as affiniteitschromatografie. Vir affiniteitschromatografie gebruik jy jou stilstaande fase om a baie spesifiek stof in jou mobiele fase. Byvoorbeeld, as jy probeer om 'n spesifieke substraat van 'n mobiele fase te isoleer, kan jy die ensiem wat die substraat bind in die stilstaande fase immobiliseer. Die substraat sal aan die geïmmobiliseerde ensiem bind, en die res van die mobiele fase sal vinnig deurgaan.

Die klassieke voorbeeld (ook in die figuur getoon) is die proteïen streptavidien en sy substraat biotien. Streptavidien is 'n ensiem wat 'n uiters hoë affiniteit het vir sy substraat, biotien, wat 'n klein molekule is. So, jy kan die krale bedek met geïmmobiliseerde streptavidien. As jy probeer om biotien of enige stof wat jy aan biotien gekoppel het te isoleer, kan jy die mobiele fase wat biotien bevat deur die stilstaande fase met streptavidien laat loop, en jy sal jou molekule van belang vasvang.

Om op te som, in chromatografie skei jy 'n stof van belang van 'n mengsel deur 'n mobiele fase wat jou stof bevat deur 'n stilstaande fase te gooi wat iets bevat wat jou stof van belang sal aantrek, wat sy reis deur die kolom vertraag. As jou stof nie die kolom wil verlaat nie omdat dit sterk met jou stilstaande fase in wisselwerking was, moet jy dit elueer.


Resultate

PIK3CA mutasies in longkankersellyne en gewasse. Ons het ontleed PIK3CA mutasies in eksons 9 en 20 in longkankersellyne en gewasse (Aanvullende Fig. S1 Tabelle 1 en 2) omdat 80% van die gerapporteerde mutasies van PIK3CA word in hierdie twee eksons gegroepeer (27). Ons het geïdentifiseer PIK3CA mutasies in NSCLC-sellyne (4 van 86, 4.7%) en gewasse (11 van 691, 1.6% Tabel 1). PIK3CA mutasies is versprei onder al die belangrikste histologiese subtipes (Tabel 1 en Aanvullende Tabelle S1 en S2). Mutasies in kankersellyne van kleinseloorsprong is beperk tot twee van drie ExPuSC-sellyne (Tabel 1 en Aanvullende Tabel S2). Al hierdie mutasies was missense mutasies. Een primêre gewas (U1171) het twee missense mutasies en een van hierdie (C1622T, S541F) was 'n nuwe volgorde variant (Aanvullende Fig. S1). Terwyl mutasies by M1043 posisie voorheen beskryf is (27), 'n A3127C (M1043L) mutasie, opgespoor in tumor J-OK398, was ook 'n nuwe volgorde variant (Aanvullende Fig. S1). Die mutasies in NSCLC was meer gereeld in ekson 9 (3 van 4 in sellyne en 7 van 11 in gewasse) as in ekson 20, terwyl beide mutasies in ExPuSC sellyne in ekson 20 was.


Kyk die video: RNA Genetics الحمض النووي الريبي RNA (Oktober 2022).