Inligting

Waarom is stikstofisotopiese etikettering nodig vir proteïen-KMR?

Waarom is stikstofisotopiese etikettering nodig vir proteïen-KMR?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Waarom word etikettering vir stikstof vereis (deur 15N) vir die bestudering van struktuur van 'n proteïen deur gebruik te maak van KMR?


Dit word nie streng vereis nie. Isotoop etikettering is vereis word wanneer die gewone isotoop nie 'n magnetiese spin het nie (byvoorbeeld 12C). 14N het 'n spin van 1 en vertoon 3 spin-toestande: -1, 0 en 1. Die isotoop, 15N het 'n 1/2 spin. Soos in hierdie boek opgemerk, bestaan ​​analitiese metodes vir beide stikstofisotope.

Maar 15N word verkies vir KMR-studies omdat die chemiese verskuiwings wat deur 14N kan te wyd wees om deur 'n hoë resolusie KMR-spektrometer opgespoor te word.

Van wikipedia:

Stikstof-15 word gereeld in kernmagnetiese resonansiespektroskopie (KMR) gebruik, want anders as die meer volop stikstof-14, wat 'n heelgetal kernspin en dus 'n vierpoolmoment het, 15N het 'n fraksionele kernspin van die helfte, wat voordele vir KMR bied soos nouer lynwydte.

Van http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/techniques/1d/row2/n.html:

Die 1D 14Stikstof KMR-eksperiment is baie minder sensitief as Proton (1H) maar het 'n baie groter chemiese verskuiwingreeks. Sy seine word verbreed deur vierpolêre interaksies. Hoe groter die molekule en hoe meer asimmetries die stikstof se omgewing, hoe breër die sein. Gevolglik gee die klein en hoogs simmetriese waterige ammoniumioon 'n baie skerp lyn (fig. 3), minder as een Hertz wyd. Vloeibare ammoniak, wat minder simmetries is, is 16 Hz breed (op 'n 400 MHz-spektrometer by kamertemperatuur). Ureum is groter en asimmetries, so die lynwydte is ongeveer 1 KHz. Molekules wat aansienlik groter as ureum is, lewer seine wat te breed is om met 'n hoë-resolusie KMR-spektrometer waargeneem te word. Die stikstof chemiese verskuiwing reeks is egter wyd en kan dus geredelik gebruik word om stikstof spesies vir baie klein molekules te onderskei.


Bakteriële fermentasie en isotoop-etikettering geoptimaliseer vir amyloïdogene proteïene

Vir korrespondensie. E-pos [email protected] Tel. +3613722500/1653 Faks +3613722620.

Laboratorium vir Strukturele Chemie en Biologie, Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Hevesy György PhD Skool vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Laboratorium vir Strukturele Chemie en Biologie, Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Hevesy György PhD Skool vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Laboratorium vir koppelvlakke en nanostrukture, Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Laboratorium vir Strukturele Chemie en Biologie, Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Hevesy György PhD Skool vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Laboratorium vir Strukturele Chemie en Biologie, Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

MTA-ELTE Proteïenmodellering Navorsingsgroep, Eötvös Loránd Navorsingsnetwerk (ELKH), Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

MTA-ELTE Proteïenmodellering Navorsingsgroep, Eötvös Loránd Navorsingsnetwerk (ELKH), Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Laboratorium vir koppelvlakke en nanostrukture, Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Laboratorium vir Strukturele Chemie en Biologie, Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

MTA-ELTE Proteïenmodellering Navorsingsgroep, Eötvös Loránd Navorsingsnetwerk (ELKH), Instituut vir Chemie, Eötvös Loránd Universiteit, Pázmány P. stny. 1/A, Boedapest, H-1117 Hongarye

Vir korrespondensie. E-pos [email protected] Tel. +3613722500/1653 Faks +3613722620.

Hierdie navorsingsprojek is ondersteun deur die Europese Unie en die staat Hongarye en gefinansier deur die Europese Streeksontwikkelingsfonds (VEKOP-2.3.2-16-2017-00014) toekenning van die NKFIH van die Hongaarse Akademie vir Wetenskappe.


Segmentele isotopiese etikettering deur asparaginiel endopeptidase-gemedieerde proteïenligasie

Segmentele isotopiese etikettering kan KMR-studies van groot proteïene, multi-domeinproteïene en proteïene met herhalende volgordes fasiliteer deur KMR-seinoorvleuelings te verlig. Segmentele isotopiese etikettering stel ons ook in staat om 'n individuele domein te ondersoek in die konteks van 'n vollengte proteïen deur KMR. Verskeie gevestigde metodes is beskikbaar vir segmentele isotopiese etikettering soos intein-bemiddelde afbinding, maar elkeen het spesifieke vereistes en beperkings. Hier rapporteer ons 'n ensiematiese benadering met behulp van bakterieë geproduseerde asparagien endopeptidase van Oldenlandia affinis vir segmentele isotopiese etikettering van 'n proteïen met herhalende volgordes, 'n ontwerpte armadillo-herhalingsproteïen, deur sommige van die tekortkominge van ensiematiese afbinding vir segmentele isotopiese etikettering te oorkom.

Dit is 'n voorskou van intekeninginhoud, toegang via jou instelling.


Inleiding

Die funksie en oorlewing van sellulêre organismes is afhanklik van die vermoë van selsamelewings om noodsaaklike inligting oor te dra deur kommunikasienetwerke wat algemeen na verwys word as seinpaaie. Die gevolglike sellulêre reaksies van sulke weë word bemiddel deur talle biomolekulêre interaksies wat deurslaggewend is vir die regulering van verskeie lewensbelangrike biologiese prosesse, insluitend seintransduksie, geenregulering, ensiemkatalise, immuunrespons, seinverwerking, enkodering en integrasie (Hunter et al., 2000 Wong en Scott, 2004 Kholodenko, 2006 Anglister et al., 2016). Verskeie belangrike patologieë soos kanker, chroniese inflammatoriese sindroom en diabetes is gewoonlik afhanklik van die wanfunksie van een of meer stappe binne 'n seinweg (Yarden en Sliwkowski, 2001 Fischer et al., 2003 Gray et al., 2003 Solinas et al. , 2007 Wang et al., 2013 Vlahopoulos et al., 2015). Die verkryging van 'n atoomresolusie-begrip van die dinamiese proteïen-proteïen-interaksies onderliggend aan regulering van seintransduksiepaaie is dus noodsaaklik vir die ontwerp van effektiewe strategieë vir terapeutiese intervensie teen menslike siektes.

Hier sal ons moderne KMR-metodologieë beskryf vir die karakterisering van die struktuur en termodinamika van proteïen-proteïen-interaksies. Hierdie bydrae is bedoel vir nie-KMR spesialiste, daarom is dit beperk tot die mees algemene KMR metodes vir die ondersoek van proteïen-proteïen interaksies. Ons sal veral verskeie tegnieke bekendstel vir die definisie van bindingskoppelvlakke en die bepaling van dissosiasiekonstantes (KD), benewens ander pertinente eksperimente vir KMR-struktuurbepaling van proteïen-proteïenkomplekse. KMR is uniek geskik om inligting oor atoomresolusie oor die struktuur, dinamika en termodinamika van proteïen-proteïenkomplekse onder byna fisiologiese toestande te verskaf. Die voortdurende tegnologiese vooruitgang in oplossing en vaste toestand KMR vestig KMR metodes as fundamentele ondersoek instrumente vir die verkryging van insigte in die biochemie van sein transduksie weë.


Resultate en bespreking

Figuur 1 ▶ toon die primêre aminosuurvolgorde van elke peptied wat in 'n GB-1 fusieproteïen gekloneer is, wat wissel van 12 tot 26 residue lank. In hierdie studie het ons peptiede van verskillende lengtes, hidrofobiesiteite en voorspelde sekondêre struktuur gebruik om die doeltreffendheid van peptiedproduksie te evalueer. Die kloningsplek vir die ingevoegde sintetiese peptied-oligonukleotiede is C-terminaal aan die GB-1-domein en N-terminaal na 'n poli-6-his-merker. Drie metionienresidu is teenwoordig in elke samesmeltingskonstruksie een op die N-terminus om transkripsie (beginkodon) te inisieer, wat nie posttranslasioneel geklief word nie, en twee met residue onmiddellik N en C terminaal aan die peptied van belang, waarvoor gekodeer is binne die sintetiese DNA-oligonukleotiede.


Eksperimentele Metodes

Materiaal

99,9% 12 C), 15 N uitgeputte ammoniumsulfaat (

99,95% 14 N), deuteriumoksied D2O (99,9%), mieresuur, en protease tipe XIII van Aspergillus satoi is verkry van Sigma Aldrich (St. Louis, MO, VSA). Tris, MOPS, NaCl, KCl, MgCl2, MgSO4 ureum, en ultrahoësuiwer HPLC-oplosmiddels (water en asetonitril) vir massaspektrometriese analise is verkry vanaf VWR international (Suwanee, GA, VSA).

Proteïenuitdrukking en suiwering

Plasmiedvektore, wat die gene van die troponienkompleks subeenhede dra, is uitgedruk en afsonderlik gesuiwer van E coli bakterieë (BL21 DE3-stam) soos voorheen beskryf. 35 – 37 Proteïene met natuurlike oorvloed isotope is uitgedruk in Luria Broth (LB) medium. Daarbenewens was TnC en TnI isotopies uitgeput in óf 13 C (enkele uitputting) óf beide 13 C en 15 N (dubbele uitputting). Vir uitgeputte proteïene is die uitdrukking uitgevoer in minimale medium (M9) waarin die enigste bron van koolstof 13 C-uitgeputte glukose is en die enigste bron van stikstof 15 N-uitgeputte ammoniumsulfaat is. Die M9-medium is voorberei in 10 mM fosfaatbuffer by pH 7.5, 10 mM NaCl, 20 mM (NH)4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 5 µM FeCl3, 4 g/L glukose en 3 mM vitamien B1. Die BL21-selle is gegroei in die teenwoordigheid van ampicillien by 37 ° C. By 'n optiese digtheid (OD) van

0.6 by 600 nm, is die uitdrukking geïnduseer met isopropyl β-D-1-tiogalaktopiranoside en toegelaat om voort te gaan vir 'n bykomende 4 uur. Die medium is gesentrifugeer en die korrel is hersuspendeer in die toepaslike lisisbuffer vir suiwering volgens protokolle wat voorheen beskryf is 35 – 37

Komplekse hersamestelling

Vier verskillende troponienkomplekse is hersaamgestel: a) alle troponien subeenhede C, T en I met natuurlike oorvloed isotope b) slegs TnC was isotoopies uitgeput in 13 C c) slegs TnI was isotopies uitgeput in 13 C en d) beide TnC en TnI was isotopies uitgeput in 13 C. Die finale rekonstitusiebuffer was: 50 mM MOPS in die teenwoordigheid van 0.1 M KCl en 3 mM MgCl2 by pH 7,2.

Monstervoorbereiding en massaspektrometriese analise

Elk van die bogenoemde komplekse (4 µM) is vir 2 minute verteer met protease XIII wat in 2% mieresuur teen 4.5 mg/ml voorberei is. 38 Die finale pH van die oplossing was

2.3. Die digest is op 'n ProZap C ingespuit18 kolom en geëlueer teen 300 µL/min met 'n kort, 1.5 min gradiënt (2% tot 95% asetonitriel) om terug-uitruiling te minimaliseer. 12 Die eluent is na-kolom verdeel (1:100) en in 'n hibriede 14.5 T LTQ-FT-ICR massaspektrometer ingebring deur mikro-elektrosproei-ionisasie. 39 Dieselfde prosedure is gevolg vir die HDX-eksperimente, maar die komplekse is vir óf 1 min óf 8 uur in gedeutereerde buffer geïnkubeer voor blus en vertering. FT-ICR massaspektrometrie bied sub-dpm massa akkuraatheid en ultrahoë massa-oplosvermoë (m/Δm50% = 200 000 by m/z 400, waarin m die ioonmassa is en Δm50% is die massaspektrale piek volle breedte by halfmaksimum piekhoogte). Data is deur X-calibur-sagteware (Thermo-Fisher) ingesamel en deur 'n pasgemaakte prosedure ontleed. 23 Alle stappe van die HDX-eksperiment is deur 'n robot (LEAP-tegnologieë) geoutomatiseer om menslike foute uit te skakel en tydsberekening te standaardiseer. 40 Elke eksperiment is in drievoud uitgevoer om reproduceerbaarheid te bepaal.


Inleiding

Alhoewel fluoor volop in die omgewing is, is dit nie 'n voedingstof nie en is dit ook nie 'n kenmerk van biochemie vir die meeste spesies nie [1]. Dit weerspieël sy lae biobeskikbaarheid, aangesien dit tipies in onoplosbare minerale voorkom, en sy fisies-chemiese eienskappe, veral sy hoë redokspotensiaal en die swak reaktiwiteit van die fluoried-ioon in waterige oplossing. Ten spyte van sy byna-afwesigheid in biologie, is dit 'n besonder belangrike element in die breër ruimte van chemiese biologie [2]. Baie kommersiële en industriële verbindings is gefluorineer, insluitend koelmiddels, ontvetters, dwelms, plaagdoders en kleefwerende materiale, en gevolglik is daar 'n hoë mate van interaksie tussen gefluoreerde verbindings en die natuur [3]. Verder, as gevolg van die gebrek aan natuurlik-voorkomende gefluoreerde verbindings, is fluoor 'n nuttige sonde om struktuur en meganisme van biologiese molekules te ondersoek. Sentraal tot hierdie studies is fluoor-19 kernmagnetiese resonansiespektroskopie (19 F KMR), wat die gebruiker in staat stel om veranderinge in chemiese verskuiwing en splitsingspatroon geredelik te visualiseer na gelang van die veranderinge van die (biologiese) omgewing, sonder aansienlike suiwering of verwerking van monsters. . In 2009 het ons 'n resensie gepubliseer wat die toepassing van 19 F KMR in chemiese biologie beskryf [4] en hier bied ons die vordering aan wat sedertdien op hierdie gebied gemaak is.


Geneesmiddelsifting in menslike selle deur KMR-spektroskopie laat die vroeë assessering van geneesmiddelsterkte toe

Struktuurgebaseerde geneesmiddelontwikkeling word dikwels belemmer deur die gebrek aan in vivo-aktiwiteit van belowende verbindings wat in vitro gekeur is, as gevolg van lae membraanpermeabiliteit of swak intrasellulêre bindingselektiwiteit. Hierin wys ons dat ligand-sifting in lewende menslike selle uitgevoer kan word deur "intrasellulêre proteïen-waargenome" KMR-spektroskopie, sonder om ensiematiese aktiwiteitsmetings of ander sellulêre toetse te vereis. Kwantitatiewe bindingsinligting word verkry deur vinnige, goedkoop 1H KMR-eksperimente, wat intrasellulêre dosis- en tydafhanklike ligandbindingskrommes verskaf, waaruit kinetiese en termodinamiese parameters gekoppel aan selpermeabiliteit en bindingsaffiniteit en selektiwiteit verkry word. Die benadering is toegepas op koolstofanhidrase en kan in beginsel uitgebrei word na enige KMR-waarneembare intrasellulêre teiken. Die resultate wat verkry word, hou direk verband met die sterkte van kandidaatmedisyne, dit wil sê die vereiste dosis. Die toepassing van hierdie benadering in 'n vroeë stadium van die geneesmiddelontwerppyplyn kan die lae sukseskoers van moderne geneesmiddelontwikkeling aansienlik verhoog.

Rasionele geneesmiddelontwerp vereis ligand-gebaseerde siftings en proteïen-gebaseerde strukturele studies om die binding aan die teikenproteïen te karakteriseer, gevolg deur loodoptimering om die bindingskonstante te verhoog. Die vermoë om intrasellulêre teikens te bereik moet dan geëvalueer word met ad hoc sel-gebaseerde toetse. Die meeste geneesmiddelkandidate misluk hier of in latere stadiums, as gevolg van 'n gebrek aan aktiwiteit in selle of die voorkoms van nadelige effekte in vivo. 1 Sulke mislukkings word dikwels gekoppel aan swak membraanpermeabiliteit en/of aan die gebrek aan bindingspesifisiteit in die sellulêre omgewing. Kernmagnetiese resonansie (KMR) spektroskopie toegepas op lewende selle 2-6 het die potensiaal om hierdie kritieke knelpunte te oorkom, aangesien dit makromolekule-ligand interaksies direk by atoomresolusie binne die sellulêre omgewing kan waarneem. 2, 7, 8 Hierin rapporteer ons 'n benadering om proteïen-waargeneemde ligand-sifting deur KMR direk in die sitosol van lewende menslike selle uit te voer. Die benadering laat die assessering van membraanpermeabiliteit en intrasellulêre bindingspesifisiteit van kandidaatgeneesmiddels toe, wat nie uit in vitro-analise afgelei kan word nie, en kan interessante en opvallend verskillende gedrag openbaar vir verbindings wat soortgelyke eienskappe in vitro het.

Ons het die metode toegepas op die sifting van inhibeerders van die tweede isovorm van menslike koolstofanhidrase (CA2). By mense is daar 15 CA isovorme, waarvan 9 baie relevante geneesmiddelteikens is wat by verskeie patologieë betrokke is. 10-14 Tot op datum word verskeie CA inhibeerders gereeld toegedien in die behandeling van gloukoom, epilepsie, of as diuretika, 15, 16 met sommige van hulle in kliniese ontwikkeling as antitumormiddels, 17, 18 Ten einde CA2 deur KMR op te spoor, die proteïen is direk uitgedruk en gemerk in die sitosol van menslike selle (sien die Eksperimentele Metodes afdeling van die Ondersteunende Inligting). 19, 20 KMR-seine wat voortspruit uit [15N]-CA2 is duidelik opgespoor in die 1H-15N korrelasiespektra (Ondersteunende Inligting, Figuur S1), wat aandui dat die intrasellulêre proteïen oplosbaar en vry is van interaksies met stadig-tuimelende sellulêre komponente , wat andersins transversale ontspanning sou verhoog en seinverbreding buite opsporing sou veroorsaak. 21 Seine van stadig-uitruilende histidien-syketting-amiedprotone wat in die aktiewe plek geleë is, is duidelik opgespoor in 'n agtergrondvrye gebied van die 1D 1H KMR-spektrum tussen 11 en 16 dpm, wat toelaat dat proteïen-ligand-interaksies gemonitor word sonder die behoefte aan isotopiese etikettering (Ondersteunende Inligting, Figuur S2).

Die interaksie tussen intrasellulêre CA2 en twee goedgekeurde middels, asetasoolamied (AAZ) en metasoolamied (MZA), is gemonitor deur 1H-15N KMR. Spektra van selle wat [15N]-CA2 uitdruk wat behandel is met 'n oormaat van AAZ of MZA het duidelike verskille in vergelyking met onbehandelde selle getoon, wat aandui dat beide middels die intrasellulêre proteïen gebind het (Figuur 1 a,b). Inhibisie van intrasellulêre CA2 is bevestig deur totale CO2 hidrasie-aktiwiteit gemeet deur gestopte vloei, wat grootliks verminder is in lysate van selle wat CA2 uitdruk wat met inhibeerder behandel is met betrekking tot onbehandelde selle (Ondersteunende Inligting, Figuur S3). In vitro, titrasie van CA2 met een ekwivalent van AAZ of MZA het gelei tot kwantitatiewe binding (ondersteunende inligting, figuur S4), in ooreenstemming met nanomolêre dissosiasiekonstantes (Kd AAZ =12.5±1.0 nm Kd MZA =14±0.9 nm, sien die Eksperimentele Metodes afdeling in die Ondersteunende Inligting). Die proteïen-ligand interaksie kan gekarteer word op die enkel-residu vlak deur chemiese verskuiwing versteuring (CSP) analise. Die hoë ooreenkoms tussen in-sel en in vitro CSP plotte het aan die lig gebring dat beide ligande op 'n byna identiese wyse aan intrasellulêre CA2 bind as in vitro (Ondersteunende Inligting, Figuur S5), wat ook ooreenstem met die atoomstruktuur van die proteïen-geneesmiddel-addukte voorheen gerapporteer (Figuur 1 d). 22

Oorleg van 1 H- 15 N KMR-spektra van selle wat [15 N]-CA2 uitdruk in die afwesigheid van ligande (swart) en vir 1 uur behandel met a) 100 μm AAZ (rooi) b) 100 μ m MZA (magenta). Sommige pieke wat verskuif na ligandbinding word gemerk. c) Imino-gebied van die 1D 1H KMR-spektra van ongemerkte intrasellulêre CA2 in die afwesigheid van ligande (swart) en gebind aan AAZ (rooi) of MZA (magenta). Pieke wat gebruik word om binding geboë te verkry, word met pyle gemerk. d) Aktiewe werfaansig van CA2/AAZ kompleks (PDB 3HS4): die katalitiese sinkioon (oranje sfeer) is geleë aan die einde van 'n groot, koniese holte naby die proteïensentrum en vertoon 'n tetraëdriese koördinasie met drie bewaarde histidienreste en, in die aktiewe vorm, 'n watermolekule /hidroksiedioon as vierde ligand. 9 Laasgenoemde word vervang deur die gedeprotoneerde sulfonamiedstikstof in die ensiem/inhibeerderaddukt. Die SO2NH-deel is addisioneel H-gebind as skenker aan die OH-deel en as aanvaarder vir die amidiese NH van residu Thr199.

Binding van AAZ en MZA tot ongemerkte CA2 in die stadige uitruilregime is duidelik waargeneem in die imino-gebied van die 1D 1H KMR-spektra, beide in selle en in vitro, as gevolg van die nabyheid van die waargenome kerne aan die ligandbindingsplek (Figuur 1 c,d en Ondersteunende inligting, Figuur S6 a,b). Ten spyte van hul bekende pH-afhanklikheid, was hierdie kerne uitstekende verslaggewers van die vrye en gebonde toestande van CA2 (Ondersteunende Inligting, Figuur S6 c). Die verbasend goeie seinskeiding tussen vrye en gebonde toestande, ten spyte van die breër spektrale lyne van in-sel KMR-spektra, het toegelaat dat die area onder elke piek deur dekonvolusie-analise herwin word (Ondersteunende Inligting, Figuur S7). Eenvoudige 1D 1 H KMR-spektra kan dus 'n kwantitatiewe maatstaf van die vrye en ligandgebonde fraksies van intrasellulêre CA2 verskaf, wat 'n minder tyd- en koste-intensiewe strategie bied in vergelyking met 2D 1 H- 15 N KMR.

1H-in-sel KMR en dekonvolusie-analise is daarna toegepas om 'n groter stel CA-inhibeerders te sif, gekies uit onlangs gerapporteerde sulfonamied-derivate, waarvoor die bindingsaffiniteit vir CA2 voorheen in vitro gekarakteriseer is en gewissel het van lae-nanomolêr tot hoog -mikromolêr (Figuur 2). 23-25 ​​Om vas te stel of hierdie benadering ligande kan onderskei op grond van hul selpermeabiliteit, 'n CA-inhibeerder (C18) wat nie deur die plasmamembraan kan diffundeer nie, is ook ingesluit. Opvallend genoeg het twee kategorieë ligande na vore gekom wat nie met die verskille in bindingsaffiniteit gekorreleer het nie: dié wat intrasellulêre CA2 kwantitatief bind, soortgelyk aan AAZ en MZA (1, 3, en 4, Figuur 3), en dié waarvoor binding weglaatbaar is, soortgelyk aan C18 (2, 5, 6, 7, en 8, Ondersteunende inligting, Figuur S8). In vergelyking is ligandbinding duidelik in vitro waargeneem, beide in die 1 H- 15 N en in die 1 H KMR-spektra (Ondersteunende Inligting, Figuur S9).

Sulfonamied-afgeleide CA inhibeerders wat in hierdie studie ontleed is. Kek gemeet in vitro vir CA2 word gerapporteer (sien die Eksperimentele Metodes afdeling van die Ondersteunende Inligting).

Imino-gebied van die 1D 1H KMR-spektra van selle wat CA2 uitdruk in die afwesigheid van ligande (swart) en behandel is met 100 μm van elke ligand vir 1 uur, wat volledige binding aan intrasellulêre CA2 toon: AAZ (rooi), MZA (magenta) en ligande 1, 3, 4 (blou). Pieke wat gebruik word om bindkurwes te verkry, word met pyle gemerk.

Daarom kan 'n eenvoudige hoë-dosis ligand sifting deur 1 H in-sel KMR onderskei tussen "suksesvolle" en "onsuksesvolle" inhibeerders sonder om terug te keer na enige sel-gebaseerde aktiwiteit toets, deur direk waar te neem intrasellulêre binding. Geen insigte is egter verskaf oor die redes waarom sommige ligande, selfs dié met hoë in vitro affiniteit, glad nie intrasellulêre CA2 bind nie. Alhoewel verskeie verskynsels kan verhoed dat 'n ligand 'n intrasellulêre teiken bind, is die mees waarskynlike redes 'n lae deurlaatbaarheid van die plasmamembraan en 'n lae bindingspesifisiteit aan die teiken, dit wil sê die teenwoordigheid van ander intrasellulêre molekules met 'n relatief hoë affiniteit vir dieselfde ligand. Om 'n meganistiese hipotese te verskaf oor die gedrag van die "onsuksesvolle" ligande, is die "suksesvolle" ligande ontleed deur in-sel KMR in 'n dosis- en op 'n tyd-afhanklike wyse. Eerstens is selle wat CA2 uitdruk en vir 1 uur behandel is met toenemende konsentrasies van elke ligand ontleed deur 1H in-sel KMR en spektrale dekonvolusie. Behalwe AAZ, het al die ligande 'n algemene neiging gevolg, wat onvolledige binding teen lae dosisse getoon het en volledige binding op ongeveer 5-15 μm bereik het (Figuur 4 a-e). By die laagste ligandkonsentrasies kan die onvolledige binding te wyte wees aan 'n laer-as-een ligand tot CA2 molêre verhouding. Verbasend genoeg, AAZ het gelei tot 'n baie vlakker dosis-afhanklike bindingskurwe, wat geen binding onder 10 μm toon nie en volledige binding slegs rondom ongeveer 75 μm. Onvolledige binding van AAZ by hoër molêre verhoudings dui daarop dat dit óf stadig deur die plasmamembraan diffundeer óf sterk aan ander intrasellulêre molekules bind. Terwyl mededingingsbinding 'n ewewigseffek is, moet stadige diffusiekinetika waargeneem word in tydafhanklike bindingseksperimente by vaste ligandkonsentrasie. Inderdaad, die behandeling van die selle met óf 27 μm AAZ of 2 μm MZA vir toenemende tydperke tot duidelike tydafhanklike bindingskurwes gelei (Figuur 5). Dosis- en tydafhanklike kurwes kan dan toegerus word met 'n kinetiese model om membraanpermeabiliteitskoëffisiënte te verkry, wat onthul dat AAZ versprei ongeveer 12 keer stadiger as MZA (Figuur 4 f). Aangesien beide molekules passief deur die plasmamembraan diffundeer en nie op aktiewe vervoer staatmaak nie, behoort sulke opvallend verskillende gedrag uiteindelik geneesmiddeldeurlaatbaarheid in menslike weefsels te beïnvloed. Die waargenome verskil word inderdaad weerspieël in die farmakokinetiese eienskappe van die twee middels, aangesien die aanbevole dosis vir AAZ in die behandeling van gloukoom is ongeveer 10 keer hoër as dié van MZA. 27 Daarom kan die kinetika van membraandiffusie die gedrag van verskillende ligande grootliks beïnvloed, ongeag hul bindingsaffiniteit vir die intrasellulêre teiken. Interessant genoeg deel al die "onsuksesvolle" ligande wat hier gekeur word 'n stikstofbasis, óf 'n uracil (2, 6, 7, en 8) of adenien (5) as 'n algemene kenmerk, en het 'n baie laer voorspelde velpermeabiliteit as die "suksesvolle" ligande (Figuur 4 f), wat dus daarop dui dat die gebrek aan binding van eersgenoemde waarskynlik die gevolg is van 'n uiters stadige diffusie deur die plasmamembraan.

a–e) Dosisafhanklike bindingskrommes waargeneem in selle wat CA2 uitdruk, behandel vir 1 uur met verskillende ligande teen toenemende konsentrasies, toegerus met 'n tydafhanklike bindingsewewig (Sien die Eksperimentele Metodes afdeling van die Ondersteunende Inligting). Elke punt verteenwoordig die area onder 'n enkele piek in die imino-gebied van die 1D 1 H in-sel KMR-spektra, genormaliseer tot die totale spektrale area. f) Dissosiasiekonstante gemeet in vitro (Kd), deurlaatbaarheidskoëffisiënt × membraanoppervlakte (Kbl A) verkry uit krommepassing en voorspelde velpermeabiliteitskoëffisiënt (log Kbl) vir elke molekule. "Onsuksesvolle" molekules korreleer met laer veldeurlaatbaarheid (in vetdruk getoon).

Tydsafhanklike bindingskurwes waargeneem in selle wat CA2 uitdruk wat met óf 27 μm behandel is AAZ (a) of 2 μm MZA (b) vir toenemende tydperke. Binding van AAZ was toegerus met 'n tyd-afhanklike binding ewewig binding van MZA was toegerus met 'n tydafhanklike diffusie in tekort aan eksterne ligand met betrekking tot die proteïen (Sien die Eksperimentele Metodes afdeling van die Ondersteunende Inligting). Elke punt verteenwoordig die area onder 'n enkele piek in die imino-gebied van die 1D 1 H in-sel KMR-spektra, genormaliseer tot die totale spektrale area.

Sodra die selle onder bestendige toestande ontleed is, dit wil sê nadat die ligand genoeg tyd gehad het om die intrasellulêre teiken te bereik, kan die in-sel bindingskurwe gepas word om 'n oënskynlike Kd. Vergelyking met die Kd wat in vitro bepaal word, sal die omvang van mededingende binding openbaar, en sodoende 'n mate van intrasellulêre bindingspesifisiteit verskaf. Om 'n betekenisvolle skyn te verkry Kd, moet die molêre verhouding van ligand tot proteïen hoër as een wees. Vir hierdie doel kan bruikbare bindingskurwes verkry word vanaf selle wat die teikenproteïen op laer vlakke uitdruk. Inderdaad, selle wat 'n ongeveer 3-voudige laer vlak van CA2 uitdruk en vir 2 uur behandel word met konsentrasies van MZA wat wissel van 0.1 tot 2 μm het gelei tot 'n steiler bindingskurwe in vergelyking met selle met hoë vlakke van CA2, wat 'n oënskynlike Kd soortgelyk, binne die fout, aan dié wat in vitro gemeet is (Ondersteunende Inligting, Figuur S10 a,b). Interessant genoeg, behandeling met 4 onder dieselfde omstandighede het gelei tot 'n oënskynlike Kd≈20 keer hoër as in vitro, wat dus daarop dui dat ander molekules om binding kan meeding 4 binne die sel (Ondersteunende Inligting, Figuur S10 c,d). Daarom kan kwantitatiewe bindingskurwes wat deur KMR verkry word, betekenisvolle inligting verskaf om die kinetika en termodinamika van intrasellulêre ligandbinding te beskryf.

Ten slotte, om te bepaal tot watter mate die "intrasellulêre proteïen-waargeneem" benadering na ander intrasellulêre teikens veralgemeen kan word, is ligandbinding op intrasellulêre CA1 getoets. Terwyl CA1 laer uitdrukkingsvlakke as CA2 bereik het, is histidienamiedprotone steeds in die 1D 1H KMR-spektra opgespoor, en vry en gebonde spesies kon duidelik geskei word (Ondersteunende Inligting, Figuur S11). Daarom behoort die benadering van toepassing te wees op ander intrasellulêre CA isovorme, wat gekonserveerde sinkbindende histidiene bevat, en in beginsel op enige ander proteïen wat aanleiding gee tot 1 H seine veldaf van ongeveer 11 dpm 19 of in enige agtergrondvrye spektrale gebied. Meer in die algemeen, deur herhaling na selektiewe isotopiese etiketteringstrategieë, soos aminosuurtipe-selektiewe [13C]-metiel of [15N]-etikettering, kan hierdie benadering toegepas word op enige oplosbare intrasellulêre proteïen, mits ten minste een sein is waarneembaar deur in-sel KMR en is sensitief vir ligandbinding.

Hierin wys ons dat ligand sifting uitgevoer kan word in menslike selle na 'n spesifieke proteïen deur "intrasellulêre proteïen-waargeneem" KMR. Sedert die eerste bewys-van-beginsel in menslike selle, is 2-in-sel KMR-toediening op proteïen-waargenome ligand-sifting beperk tot bakterieë. 28 Die benadering wat hier getoon word, laat doeltreffende in-diepte geneesmiddelsifting in menslike selle toe vir die assessering van intrasellulêre teikenbindende vermoëns, en bied ook 'n manier om hulle in meer kwantitatiewe terme te karakteriseer, sonder om terug te keer na chemiese merking van die proteïen. 29 Die huidige lae deurset van die benadering kan aansienlik verbeter word deur outomatisering te verhoog (byvoorbeeld deur die gebruik van 'n temperatuurbeheerde KMR-monsterwisselaar) en deur verskeie ligande gelyktydig te sift (byvoorbeeld deur matriksmetodes 28 ). Dit is belangrik dat hierdie metode nie op ensiematiese aktiwiteitsmetings staatmaak nie. Daarom bied dit 'n unieke nuwe manier om die doeltreffendheid van geneesmiddels ook teen nie-ensiematiese teikens te evalueer, elkeen van hulle vereis andersins dat indirekte sel-gebaseerde toetse gevestig moet word, soos selproliferasie, indringing en lewensvatbaarheid/apoptose toetse. Uiteindelik, sodra dit binne die moderne geneesmiddelontwikkelingspyplyn geraam is, kan hierdie metode die beoordeling van die sterkte van 'n kandidaatgeneesmiddel moontlik maak, dit wil sê die hoeveelheid geneesmiddel wat benodig word om 'n effek van gegewe intensiteit uit te oefen, in 'n klinies relevante konsentrasiereeks (0.1– 100 μm). Sulke voorspellende vermoë sal die optimering van sterkte op 'n vroeër stadium van die pyplyn moontlik maak in vergelyking met sel- en dier-gebaseerde toetse.

Erkennings

Hierdie werk is ondersteun deur iNEXT, toekenning nommer 653706, befonds deur die Horizon 2020-program van die Europese Kommissie, en deur Instruct-ULTRA, toekenning nommer 731005, 'n EU H2020-projek om die dienste van Instruct-ERIC verder te ontwikkel. Die skrywers erken die ondersteuning en die gebruik van hulpbronne van Instruct-ERIC, 'n Landmark ESFRI-projek, en spesifiek die CERM/CIRMMP Italië-sentrum.

Konflik van belange

Die skrywers verklaar geen botsing van belange nie.

As 'n diens aan ons skrywers en lesers, verskaf hierdie tydskrif ondersteunende inligting wat deur die skrywers verskaf word. Sulke materiaal word eweknie-geëvalueer en kan herorganiseer word vir aanlyn aflewering, maar word nie kopie-geredigeer of getipeer nie. Tegniese ondersteuningskwessies wat voortspruit uit ondersteunende inligting (behalwe ontbrekende lêers) moet aan die outeurs gerig word.

Lêernaam Beskrywing
anie201913436-sup-0001-misc_information.pdf33.7 MB Aanvullend

Neem asseblief kennis: Die uitgewer is nie verantwoordelik vir die inhoud of funksionaliteit van enige ondersteunende inligting wat deur die skrywers verskaf word nie. Enige navrae (behalwe ontbrekende inhoud) moet aan die ooreenstemmende outeur vir die artikel gerig word.


Waarom is stikstofisotopiese etikettering nodig vir proteïen-KMR? - Biologie

Die webmateriaal vir hierdie lesing kan gevind word by http://www.cryst.bbk.ac.uk/

KMR vir Kristallograwe

Ph.D. Tegniekeklas 28 Oktober 2003.

  1. Om die basis van KMR-spektroskopie te skets
  2. Om KMR en X-straalkristallografie te vergelyk as 'n manier van struktuurbepaling
  3. Om ander gebruike vir KMR in biochemie en strukturele biologie bekend te stel

Aan die einde van die sessie behoort studente te weet waarvoor KMR gebruik kan word en hoe om 'n monster vir 'n aanvanklike KMR-spektrum voor te berei

'n Goeie handboek vir makromolekulêre KMR met 'n mengsel van teorie en resultate

Jeremy N.S. Evans Biomolecular KMR Spectroscopy Oxford University Press 1995 ISBN 0 19 854766 8

'n Eenvoudiger praktiese inleiding tot makromolekulêre KMR word gevind in

KMR van makromolekules: 'n Praktiese benadering ed GCK Roberts Oxford 1993

'n Veel meer wiskundige behandeling van teorie word in

Proteïen KMR-spektroskopie J. Cavanagh, WJ Fairbrother, AG Palmer III, NJ Shelton. Akademiese Pers 1996

Inleiding tot KMR-spektroskopie

Nuclear magnetic resonance depends on the quantum mechanical property of nuclear spin. This is quantised spin angular momentum, which confers a magnetic moment on a nucleus in a magnetic field. The nuclear spin (I) can have a value of 0, 1/2, 1, 3/2, 2 etc. Each nuclear spin I has 2I+1 states given by the quantum number m -I, -I+1 . I-1, I. So for I=1/2 nuclei like 1 H the states are m=-1/2 and m=+1/2. This kind of nucleus can be thought of as a bar magnet, which can be aligned with or against the magnetic field. At this point the text books resort to classical mechanics to derive the following equation

γ is an intrinsic property of the nucleus (the quadropole moment), ω is the Larmor frequency and is the absorption frequency of an isolated atom. NMR spectrometers are normally described in terms of the Larmor frequency of 1 H in their magnetic field. These are say 200 or 300 MHz for organic chemists routine spectra, 500, 600 Hz and increasingly 750 and 800 MHz are the work horses of macromolecular work and 900 MHz are the virility symbols of the big macromolecular research groups at present and 1GHz machines are being planned. 800 MHz corresponds to 18.8 Tesla, which is an extremely expensive magnet (several hundred thousand pounds), but the NMR people would argue is peanuts compared to a synchrotron beam lines used by the X-ray crystallographers. There is a Boltzmann energy distribution between the parallel and anti-parallel states given by

Energy is put into the system by radio waves from the spectrometer, which displaces the distribution of the system away from equilibrium and then the decay back to equilibrium is monitored by the emitted radio waves.

Figure 1 (above) shows a schematic of a NMR spectrometer. The main components are the magnet, which is normally a liquid nitrogen cooled electromagnet, the probes (three or even four probes which are coils surrounding the sample are common), the electronics to transmit and receive the radio waves and finally a computer via an analogue to digital convertor.
 
 

Simple FT NMR Spectra

A single short pulse is applied containing frequencies over the spectral width required. This is of the order of 10 -5 s. The nuclear spin then decays back to equilibrium and the decay is followed. Once it has decayed the process can be repeated and summed to improve the signal to noise. The decay is digitised and a Fourier transform applied to convert the so called Free Induction Decay (FID) to a frequency spectrum. The conventional representation of this is by a vector representation (see Figure 3 below).

Having summed several pulses and carried out a Fourier Transform you obtain a 1D spectrum. Each proton has a chemical shift (Measured in parts per million ppm) which is given by

Where ω o is the operating frequency of the spectrometer and ω TMS is the proton frequency from tetramethylsilane. The value of the chemical shift depends on the local magnetic field experienced by that proton, which is related to its chemical environment. Obviously if there are protons in the solvent the biggest peak comes from the solvent. Amide NH protons exchange with the solvent and so if a protein is left in D2O there will be no signal from the amide protons. Some spectra to look at the side chain atoms are best done in D2O but the NH proton is very important in determining the backbone of the protein and so most experiments are carried out in 90% H2O/10% D2O. The 10% D2O is required as a lock signal is obtained from the D2O which is monitored to keep the magnetic field homogeneous. Extra pulses are included to reduce the size of the water peak. (NMR spectroscopy is full of acronyms for pulse sequences. Solvent suppression sequences include WATERGATE and DANTE.) The water peak divides the spectrum into two regions above the water peak (4.7 ppm) are the aromatic and NH protons below the peak are the aliphatic protons. OH protons are usually too broad to be seen. A typical protein spectra is seen in Figure 4.

 Figure 4 600MHz spectrum of N terminal domain of p47phox

The major natural isotopes of carbon and oxygen 12 C and 16 O have I=0 and so are NMR inactive, 14 N has I=1, but this relaxes much faster than spin 1/2 nuclei and so does not have an observed effect in macromolecular NMR. However 13 C and 15 N have I=1/2. These can be incorporated at nearly 100% abundance by growing cells on isotope enriched media. For 15 N this is not too bad (㿞 a litre for E.coli minimal media), for 13 C it is � a litre (although prices are edging down as use increases). This means you need very good expression (the yield normally drops on going from a rich media like 2TY or TB to minimal media). There are isotopically enriched media available for Pichia and methyltrophic yeasts. In theory you should be able to record 13 C and 15 N spectra directly. In fact better spectra are obtained by detecting the signals indirectly via the much more sensitive 1 H spins. This is done by the so called INEPT pulse sequence. 2 H which is a quadropolar (I=1) nuclei can also be incorporated. Partial deuteration has advantages (which I will not attempt to explain) in pushing the size limits of NMR. As the isotope effect of deuterium has a significant effect on the metabolism of the bacteria, slow conditioning in increasing D2O concentrations are required. Incorporation of specifically labelled individual amino acids eg 15 N His or 13 C Ala can be done. There is not a need to use auxotrophs if it is done in the presence of the other amino acids in the anabolic pathway. These can produce simpler spectra for helping interpret fully labelled spectra or for probing particular amino acids (eg the protonation state of a His in an enzyme).

If all you could obtain were the chemical shifts of every C, H and N atom in the protein, there is a formal possibility that you could determine the structure by calculating the chemical shift of each nuclei from a model and altering the model to improve the fit. This is not yet possible, although some people are trying to use chemical shift calculations as part of a structure determination. However there is interaction between spins, which can be used and detected. There are basically two types of spin coupling through space (dipolar) and through bond. (scalar, correlation or J coupling). Through space coupling which is also known as the Nuclear Overhauser Effect (NOE) is dependent on r -6 , which means that signals can be got between protons that are less than 5Å apart. The simplest experiment produces a cross peak at the chemical shifts of pairs of protons that lie less than 5 Å apart. This is the basis of NMR structure determination, which consists of calculating a model compatible with most (if not all) the observed NOE's in the spectrum. However before this can be done each NOE has to be assigned to a pair of protons in the protein, so the chemical shift of each proton needs to be known. This is done by assembling 'spin systems' which are protons which are linked through bonds. These correspond to amino acids. Connections then need to be made to adjacent amino acids.

Figure 5 2D NOESY spectra.  Click here for close up of a region

NMR Structure determination

For proteins of less than 15kD the structure can be determined by proton experiments alone. One strategy is first to determine the spin systems in D2O using 2D through bond experiments (DQF-COSY and TOCSY). Then from experiments in H2O, the exchangeable protons are added to the spin systems. Sequential spin systems are identified by looking for NOE's between the NH proton and the previous residue (so called dNN, dαN,d βN ) links see Figure 6. The pattern of these links are indicative of certain types of secondary structure and the secondary structure is obtained sometime before the structure is fully solved. Secondary structure assignments are publishable and are the NMR equivalent of crystallisation notes, indicating that the structure is solvable.

Figure 6.  HH distances in an amino acid.  Taken from Evans Fig 4.1

For proteins of 15-30kD the 2D spectra are too crowded to interpret and the proton chemical shifts alone are ambiguous as to which proton in the protein they are. For proteins in this range isotopically labelled samples are required and 3 or 4D experiments are carried out which attach a 13 C or 15 N shift to each proton as well. A 3D experiment is a stack of 2D experiments but each peak only occurs once in the stack so there are many less peaks per 2D layer. Assignments are carried out by a series of experiments such as HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HCACO, HBHA(CO)NH. There are 3 and 4D versions of the NOE and TOCSY experiments as well. There are complications to many of these experiments, which mean that not all the expected appears appear or extra peaks appear. For example in the HNCA experiment the CA of the previous amino acid is often also visible. 4D experiments in theory would resolve all the protons in large proteins. However there are constraints on the relationship of line width and tumbling time that means that even with a number of recent improvements such as partial deuteration the limit is likely to be reached under 40kD. Solid state methods and a new method for determining bond dipoles in a protein partially orientated in the magnetic field offer possibilities for pushing the size limit.

What is obtained from in an NMR structure determination is a list of distance constraints (ie that certain protons are less than a certain distance apart). There is some correlation of distance with intensity but normally the uncertainty is several Å. These are combined with the stereochemical constraints (bond distances, bond angles etc) of proteins similar to those used in X-ray crystallography. The best solution to these restraints are found using distance geometry or molecular dynamics software (CNS, X-PLOR, DISMAN, DIANA). It is normal to carry out these calculations tens of times, collect together those that pass some quality test on satisfying the constraints and display them together (Figure 6). This gives a much clearer idea of which parts of the structure are well defined than normally given by X-ray. Sometimes an average structure is calculated, but this will normally have poor geometry and in that sense is less right than the individual solutions. The database OLDERADO at the University of Leicester analyses these clusters and among other information tells you which of the models is the most typical. This is perhaps the best model to then look at in display programmes.

There are also NMR experiments that allow constraints on certain bond angles to be added and hydrogen bonds can be detected and used as restraints. A method has been described (Tjandra, N. and Bax, A (1997). Science 278:1111-1114) that obtains the angles between a bond (or more precisely the interatom vector) and the principal axes of the molecule. This requires that a molecule is not perfectly spherical (they rarely are) and that there is some ordering of the molecules in the magnetic field. This is achieved with a low concentration of a liquid crystalline lipid phase.

Significant increase in the range of proteins that can be studied has recently been achieved by using deuteration of the protein. Deuterium is not NMR active. Normally the other hydrogens in a large protein are a major source of the rapid decay. E coli cells can be got to grow in D2O and perdeuterated glucose or acetate. The exchangeable (NH) hydrogens are changed to protons on transferring the sample to H2O and a structure can be determined based just on the backbone hydrogens. More detail can be obtained by adding amino acids such as valine with hydrogens on the methyl groups to the culture in D2O.
(For an example of a 280 amino acid protein done by Steve Matthews at Imperial see Nature Structural Biology, 1999, Vol.6, No.4, Pp.313-318)
 

In 2002 the pulse sequences proposed in the last couple of years have started to produce biological results. These include transverse relaxation-optimised spectroscopy (TROSY), which reduces the speed of decay of the spin caused by adjacent atoms and cross correlation relaxed-enhanced polarisation transfer (CRINEPT) (Riek, Pervushin and Wuthrich (2000) TIBS 25:462-467). Using these spectra of GroES a 10kD protein has been collected from within the 72kD homoheptamer or even the 900kD GroES/EL complex. (Fiaux et al., Nature 418:207-211) The p53 core domain has been shown to be unfolded when bound to the 200kD Hsp90 complex (Rüdiger et al., (2002) PNAS 99:11085-11090. Thus these techniques allow spectra to be collected from large protein complexes, particularly if only small parts can be labelled to reduce peak overlap.

Figure 7 Backbone of well-defined set of NMR structures. The SH3 domain of fyn (PDB 1NYG). (CJ Morton , DJ Pugh , EL Brown , JD Kahmann , DA Renzoni , ID Campbell "Solution structure and peptide binding of the SH3 domain from human Fyn." Structure, 4 (6), 1996, 705-714)
 
 
 
 

Figure 8. Backbone of a less well superimposed set of structures PDB 1CYP(Kilby PM, Van Eldik LJ, Roberts GC, Structure 1996 4(9):1041-52. The solution structure of the bovine S100B protein dimer in the calcium-free state.) It is worth noting that in this case there are more restraints (1773) than for the SH3 above (669). The greater spread of structures is due partly to the structure being of an apo (calcium free) form of a calcium binding protein, which is inherently more flexible. This structure is a dimer so there is a problem resolving those NOE's within and those between chains.
 
 


6 thoughts on &ldquo Peng-Jui (Ruby) Chen–Lipophilic Tunings of Small-Molecule Mediated Metal Mobilization &rdquo

Congratulations on such fantastic research! This was a great talk and so much impressive work done. I am curious about the binding of the iron to hinokitiol… you show in your slides that the iron is bound by the carbonyl and the alcohol. Do you plan to make any derivatives at those two positions to prove that the iron is binding there and to see if derivatives have increased/decreased activity?

Hi Shelby, thank you for your question!
We have proven that iron binds to the carbonyl and alcohol oxygens by obtaining a crystal structure of the hinokitiol-iron complex. In addition, we have previously synthesized a derivative of hinokitiol with the alcohol group replaced by a proton, and this derivative showed no iron mobilization activity.

Nice talk Ruby! I have a few questions about your liposome assay.
1. How did you quantify the concentration of iron outside of the liposome?
2. Did you verify that the liposome was intact? (ie, how do we know that the iron you’re detecting outside of the liposome isn’t just from liposomes that ruptured?)
3. Why do you think higher concentrations of the small molecule ultimately lead to a dropoff in iron transport? I would expect the iron transport to simply level off at higher concentrations rather than dropping. Do you think the small molecules are potentially aggregating in solution at higher concentrations?
4. Assuming I’m reading your data properly, there doesn’t appear to be very much iron transported out of the liposomes (15 mM inside to 0.3 mM outside). Is your assay performed under dilute conditions, or is only a small amount of iron being transported? And do you think that’s enough to be relevant in a biological system?
Again, really nice talk!

Hi Philip, thank you so much for these questions!
1. The concentration of iron was quantified using a dye ferrozine that binds to iron.
2. Liposomes are typically very stable. Also as you mentioned in your 4th question, the transported amount of iron is rather small compared to the total amount we put into the liposome. If the liposomes are ruptured, I would expect the amount of iron outside of the liposome to be more significant. Moreover, we know that liposomes can be broken by detergent. If the iron we see outside of the liposome results from the lipid being ruptured, I would expect the longer chain derivatives (more detergent-like) to have higher activity, which contradicts our observation. For these reasons I believe we are seeing actual iron mobilization and not liposome rupturing.
3. Yes, just like you mentioned, we currently think that aggregation of the small molecules lead to lower activity, and even the toxicity. We have obtained some preliminary results visualizing the Hino-iron aggregates using TEM that shows larger aggregates form at higher concentrations of the small molecules.
4. I believe this result indicates a rather small amount of iron is being transported, but I think it is relevant in a biological system. The iron transported will be uptaken by other parts of the cell that need the iron, which will drive more iron transport to reach equilibrium of the iron concentration on both sides of the membrane.

You have synthesized many compounds using a variety of synthetic reactions. What were the yields of your reactions (a range is fine or the yields of the most relevant reaction steps)
Also, what methods did you use to determine the identity of your synthetic products. Any special methods used for the isotopically labeled compounds (Deuterated and 13C labeled)

Hi Anton, thank you very much for the questions!
The yield to get from cyclohexadienes to the promo-tropolone building blocks, over 4 steps, is around 10%, and the yields for the coupling reactions followed by methyl group deprotections are around the range of 10%-30%, depending on the alkyl substituent we are attaching.
All the synthetic products have been characterized with 1H and 13C NMR, in addition to high and low resolution mass spectrometry.
For the 13C labeled compounds, we simply run 13C NMR on the sample, and the isotopic label can be identified as an enhanced peak in the spectrum as compared to other signals (natural abundance of 13C is only 1.1%). The identities of the intermediates in which a proton is directly attached to the 13C carbon were also confirmed through 1H NMR, where 13C-1H coupling can be observed. All the intermediates and products have also been characterized with mass spectrometry.
On the other hand, deuterated derivatives required more special characterization. To identify the deuterium peaks, we took deuterium NMR spectra for these compounds. In their 13C NMR spectra, the 13C peaks are split by the couplings with deuteriums, and the structure assignments can also be corresponded with these splitting patterns. In addition, to better resolve these 13C peaks, we were able to characterize all deuterated compounds with simultaneously proton and deuteron decoupled 13C NMR with the help of Dr. Zhu in the NMR lab.
Hoop dit beantwoord jou vrae!


Kyk die video: z bregov Protein. Pobijedi sebe! (Oktober 2022).