Inligting

2.6: Die lac Operon CAP-terrein DNA-voetspoor - Biologie

2.6: Die lac Operon CAP-terrein DNA-voetspoor - Biologie


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Die E coli lac operon

Figuur 2.6.1: lac Operon

  • lac Z kodes vir b-galaktosidase, wat 'n ensiem is wat b-galaktosiede (bv. laktose) klief.
  • lac Y kodes vir deurdring, wat betrokke is by die vervoer van b-galaktosiede na die sel.
  • lac A kodes vir b-galaktosied transasetilase, wat b-galaktosiede asetileer.
  • 'n Mutasie in beide lac Z of lac Y kan lei tot a lac- genotipe, d.w.s. selle wat nie b-galaktosiede as 'n voedingstof kan benut nie.
  • A lac A-mutant, wat nie transasetilase-aktiwiteit het nie, kan steeds b-galaktosiede gebruik (dit is steeds lac+ genotipe). Die rol daarvan in die metabolisme van bgalaktosiede is nie duidelik nie.

Promotor

'n DNS-gebied betrokke by binding van RNA-polimerase om transkripsie te begin.

Terminator

'n volgorde van DNA wat veroorsaak dat RNA-polimerase transkripsie beëindig.

  • Die groep van drie gene, lac ZYA, word getranskribeer in 'n enkele mRNA (polisistronies boodskap) van a promotor net stroomop van die lac Z geen.
  • In die afwesigheid van 'n induseerder die geengroepering is nie getranskribeer.
  • Wanneer 'n induseerder word bygevoeg (bv. laktose, of die nie-hidroliseerbare analoog isopropyltiogalaktosied - IPTG) transkripsie begin by 'n enkele promotor (lac P) en gaan deur die lac ZYA-gene na 'n terminatorvolgorde wat stroomaf van die lac A geen.

Let wel

Die lac ZYA mRNA het 'n halfleeftyd van ~3 minute, wat toelaat dat induksie relatief vinnig omgekeer word (m.a.w. selle hou vinnig op om ensieme te produseer nadat induksie gestaak is).

Oefening 2.6.1

Met watter molekule tree die induseerder (laktose) in wisselwerking om transkripsionele regulering (m.a.w. induksie van die lac-operon) te beïnvloed?

Antwoord

Dit is nie b-galaktosidase, permase of transasetilase nie, dit is eerder 'n aparte proteïen wat 'n onderdrukkerproteïen genoem word.

  • Die lac-gene word beheer deur 'n meganisme genoem negatiewe regulering.
    • Dit beteken dat hulle word getranskribeer tensy hulle deur die reguleerderproteïen afgeskakel word.
    • 'n Mutasie wat deaktiveer die reguleerderproteïen veroorsaak die lacZYA gene te wees voortdurend uitgedruk.
Aangesien die funksie van die reguleerderproteïen is om uitdrukking te voorkom, word dit a genoem onderdrukker proteïen.

Daar is twee tipes gene in die lac operon:

  1. Strukturele gene - hulle kodeer vir ensieme wat benodig word vir een of ander biochemiese pad (bv. lac Z, Y en A).
  2. Reguleerder gene - hulle kodeer vir proteïene betrokke by regulering van strukturele gene.
Mutasies in strukturele gene beïnvloed tipies die funksie van slegs daardie strukturele geen.
Mutasies in reguleerder gene kan die uitdrukking van alle strukturele gene in 'n operon beïnvloed.

lac I is die reguleerder geen van die lac operon.

  • Hierdie geen is net stroomop van die promotorgebied vir die lac strukturele gene geleë.
  • Die lac Ek geen het sy eie promotor (konstitutief) en terminator.
  • Dit maak 'n monocistroniese boodskap, en kodeer vir een proteïen - die lac onderdrukker proteïen.
Die deurslaggewende kenmerk van die lac "beheerkring" is geleë in die dubbele kenmerk van die lac I-onderdrukkerproteïen:
  1. Dit kan transkripsie voorkom
  2. Dit kan die kleinmolekule-induseerder (laktose of IPTG) herken en bind.

Voorkoming van transkripsie deur die lac-onderdrukker

  • lac-onderdrukker (aktief as 'n tetrameer proteïen) bind aan 'n reeks DNA wat die operateur (lac O streek).
    • Die operateurstreek lê tussen die lac promotorstreek (plek van RNA-polimerasebinding en transkripsie-inisiasie) en die lac Z geen.
    • Die eerste 26 basispare van die lac Z-geen bestaan ​​uit die operateurstreek.
Wanneer die onderdrukker aan die operateurgebied bind, verhoed die teenwoordigheid daarvan dat RNA-polimerase transkripsie by die promotor begin.
  • Dit is nie dat die onderdrukker proteïen "blokkeer" die beweging van RNA polimerase deur die lac Z geen.
  • Onderdrukkerbinding en RNA-polimerasebinding (aan die promotor) is wedersyds eksklusiewe by die lac promotor/operateur (lac PO) streek.

Hoe verander die onderdrukker/operateur-interaksie in die teenwoordigheid van die induseerdermolekule?

  • Die induseerder kan aan die onderdrukker bind om 'n te vorm onderdrukker/inducer kompleks wat nie meer met die operateur assosieer nie.
    • Die belangrikste kenmerk van hierdie interaksie is dat die onderdrukkerproteïen het twee bindingsplekke, een vir die induktor en een vir die operateur.
    • Wanneer die induseerder by sy plek bind, verander dit die konformasie van die onderdrukkerproteïen sodanig dat die operateurbindingsplek 'n baie verminderde affiniteit vir die DNS-operateurstreek het.
    • Hierdie tipe beheer word genoem allosteriese beheer.
    • Die gevolg is dat wanneer die induseerder bygevoeg word, word die onderdrukker omgeskakel na 'n vorm wat van die operateur vrygestel word.

Figuur 2.6.2: Inducer

Positiewe beheer van die lac operon word uitgeoefen deur cAMP-CAP kompleks

  • E coli verkies glukose oor ander koolstofbronne.
Wanneer glukose 'n E. coli-sel binnedring, word dit direk benut sonder induksie van enige nuwe ensieme.
  • Wanneer E coli word op glukose gekweek, as 'n ander suiker (bv. laktose) bygevoeg word die induksie van ensieme om die ander suiker te benut vind nie plaas totdat die glukose opgebruik is nie.
  • Wanneer E. coli uitgehonger word vir glukose, sintetiseer dit 'n ongewone nukleotied: sikliese 3'5' adenosienmonofosfaat (sikliese AMP, of KAMP):

Figuur 2.6.3: KAMP

  1. By bakterieë blyk 'n toename in die cAMP-vlak 'n "waarskuwing" sein te wees wat 'n lae glukosevlak aandui:

Figuur 2.6.4: Interaksie van cAMP vlak en lac operon

Dibutyryl cAMP

  • an analoog van cAMP wat deur die E coli membraan en in die sel.
  • As dit by media gevoeg word wat glukose en laktose bevat, sal dit lei tot die induksie van die lac operon.
  • Dit boots dus die chemiese boodskap na wat die mislei E coli om te reageer asof glukosevlakke was laag.
  • Mutante van E coli is geïsoleer wat nie geïnduseer kan word om te metaboliseer nie enige ander suiker as glukose. Daar was twee algemene kategorieë mutante:
  1. Klas I. Gebrek aan die ensiem adenilaat siklase. Hierdie mutante is nie in staat om cAMP te maak nie, selfs al is die glukosekonsentrasie laag.
  2. Klas II. Ontbreek 'n spesifieke proteïen bekend as cAMP reseptor proteïen (CRP) of, ook bekend as katabolietreseptorproteïen (CRP).
  • Maksimum transkripsie van die lac operon vereis die teenwoordigheid van 'n cAMP/CRP kompleks.
    • cAMP/CRP-kompleks bind aan 'n spesifieke volgorde in die lac-beheergebied wat die "CAP" werf.
    • Die CAP-werf is net stroomop vanaf die RNA-polimerase-bindingsplek.
    • Mutasies in die CAP-plek wat cAMP-CRP-binding voorkom, voorkom ook hoë vlakke van uitdrukking van die lac operon.
  • Dus, gebonde cAMP/CRP kompleks aktiveer transkripsie (positiewe beheer), terwyl gebind lac onderdrukker inhibeer transkripsie (negatiewe beheer).
    • cAMP/CRP-kompleks het affiniteit vir DNA, en RNA pol.
    • Verhoog komplekse vorming van RNA pol met die DNA-promotorstreek.

Induksie van die lac operon met laktose-analoë

  • Die lac operon kan geïnduseer word met laktose
    • b-galaktosidase (lacZ-geenproduk) metaboliseer die laktose
    • Wanneer vlakke van laktose verminder word, word die lac operon word weer onderdruk deur die lac onderdrukker (lacI geen produk)
  • Nie-gemetaboliseerde laktose-analoë voortdurend kan veroorsaak (d.w.s. de-onderdruk) die lac operon
    • isopropyl b-tiogalaktosied, of IPTG, is 'n nie-gemetaboliseerde laktose-analoog

DNA "voetspoor" eksperimente

  • As 'n proteïen aan 'n gebied van DNA bind, dit kan daardie streek van DNS teen vertering deur dnase beskerm (DNAse I: 'n endonuklease by plekke aangrensend aan pirimidiennukleotiede).
    • 'n Fragment van DNA kan by die 5'-punte gemerk word met 32P en dan kan die etiket by voorkeur van een kant (d.w.s. die 3'-kant van 'n geen) verwyder word deur 'n toepaslike restriksie-endonuklease.
    • As hierdie DNS-fragment, met 'n etiket aan een spesifieke punt, 'n kompleks met 'n DNS-bindende proteïen vorm, sal die proteïen die DNS-gebied waaraan dit bind teen DNAse I-vertering beskerm.
    • Die vertering word so gedoen dat dit onvolledig is, vir die doeleindes van hierdie bespreking, stel jou voor dat elke DNA-molekule net een keer geklief word. Verder word die plek van splitsing ewekansig uit die beskikbare plekke gekies.
    • Fragmente van die DNA, geskei en ontleed volgens grootte (met behulp van gelelektroforese) na vertering sal die beskermde gebied aandui:

Figuur 2.6.5: DNA-voetspoor

Resultate van voetspoor-eksperimente

lac DNA geïnkubeer met óf cAMP/CAP-proteïen, óf RNA-polimerase, of lac I-onderdrukkerproteïen:

Figuur 2.6.6: lac onderdrukker met cAMP

RNA-polimerase tree in wisselwerking met spesifieke promotorvolgordes en produseer 'n "voetspoor" oor 'n gebied van ~70 basispare.

  • Daar is waargeneem dat hierdie beskerming duideliker was op een string as die ander (d.w.s. as die ander string gemerk is, het die resultate nie soveel beskerming getoon nie).
  • Hierdie gebied van DNAse-beskerming het plekke in die DNA ingesluit waarvandaan mutagenese-eksperimente óf "op" regulering of "af" regulering van promotorsterkte geproduseer het.
  • Hierdie mutageniese "warm" kolle wat promotorsterkte beïnvloed, was geleë op posisies óf -10 óf -30 stroomop van die transkripsiebeginplek (posisie +1 in die bostaande diagram):

Figuur 2.6.7: Promotor Sterkte Mutasies

  • Promotors kan geklassifiseer word volgens hul "sterkte".
  • Dit verwys na die familielid frekwensie van transkripsie-inisiasie (transkripsie-inisiasiegebeure per minuut), en hou verband met die affiniteit van RNA-polimerase vir die promotorgebied.
  • Baie promotors in E coli is gekarakteriseer en 'n "konsensus" promotorvolgorde is geïdentifiseer:

Figuur 2.6.8: Konsensus Promotor Sterkte

Let wel

Die lac-promotor is 'n relatief swak promotor

RNA Polimerase

  • E coli RNA-polimerase is 'n holoënsiem wat bestaan ​​uit subeenhede b', b, a (dimeer) en s70.
    • Die s70 subeenheid is die subeenheid wat aan die promotorgebied bind, maar nie in staat is om RNA-sintese te inisieer nie.
    • Na die s70 subeenheid subeenheid bind, die ander subeenhede bind en vorm 'n funksie RNA polimerase.
    • Nadat ongeveer 10 basispare getranskribeer is, is die s70 subeenheid blare en die kern polimerase gaan voort.

Die lac Operateursstreek

  • Die lac operateurstreek bestaan ​​uit 'n (onvolmaakte) omgekeerde herhaling streek.
  • Dit is nie verbasend dat aktiewe onderdrukkermolekules uit 'n homodimeer bestaan ​​nie.
    • In die homodimeerstruktuur is daar 'n paar a-heliksstreke wat in aangrensende hoofgroewe van die DNA invoeg.
    • Die skeiding is ongeveer 34 Angstrom uitmekaar.

Hersiene antwoordopsomming

My oorspronklike antwoord het bewys gelewer dat die trp-onderdrukker 'n dimeer is, en daardie gevolgtrekking bly staan, veral wat die funksionele vorm daarvan betref. Ek beskou steeds die stelling in Wikipedia dat dit 'n tetrameer is as verkeerd, alhoewel ek nou sien hoe dit kon ontstaan ​​het. Dit blyk 'n waninterpretasie van resultate in vitro te wees wat toon dat 'n ewewig tussen dimeer en tetrameer kan bestaan ​​(nie net tetrameer nie). Ek het in 'n bykomende afdeling hieroor uitgebrei.

'n Funksionele dimeer

Die funksionele vorm van die is beslis 'n dimeer, soos oorspronklik gerapporteer deur Schievitz et al. (1985). Die opsomming van hierdie vraestel sluit die stelling in:

“Die kristalstruktuur van die Escherichia coli trp-onderdrukker is tot atoomresolusie opgelos. Die dimeriese proteïen het ’n merkwaardige subeenheid-koppelvlak waarin vyf van elke subeenheid se ses helikse met mekaar verbind is.”

Dit is in kombinasie met die operateur-DNS gekristalliseer, en die struktuur is in die Proteïendatabasis (PDB) gedeponeer as 1TRO. Ek reproduseer 'n beeld van die PDB-inskrywing hieronder. Baie ander DNA-bindende proteïene het ook dimeriese strukture.

'n Dimeer-tetrameer-ewewig waargeneem in oplossing

Die stelling in Wikipedia spruit waarskynlik voort uit 'n verslag deur Fernando en Royer (1992) - wat later bevestig is - dat daar in oplossing 'n ewewig is tussen die dimeer en hoër oligomere (die tetrameer oorheers). Daar is gevind dat triptofaan die ewewig na die dimeer verskuif. Die skrywers beweer dat dit fisiologiese relevansie het, hoewel dit steeds 'n betwiste punt lyk.


2.6: Die lac Operon CAP-terrein DNA-voetspoor - Biologie

BioBuilder&rsquos iTunes-toestel aktiwiteit beklemtoon die &ldquotest&rdquo-fase van die ontwerp-bou-toets-siklus. Jy sal met verskeie variante van 'n ensiem-genererende genetiese stroombaan werk. Die stroombane het klein verskille in hul DNA-volgordes, wat na verwagting die hoeveelheid ensiem wat die selle produseer, sal verander. Jy sal 'n ensiematiese toets gebruik om die stroombane en uitsette kwantitatief te meet. Jy sal dan jou resultate vergelyk met wat jy sou voorspel op grond van die bekende gedrag van die effens verskillende DNS-volgordes.

Vir die meeste ontwerpte stelsels, beduidende verskille tussen waargenome en voorspelde gedrag is onaanvaarbaar. Soos uitgewys word in Figuur 7-1, wat sou 'n lugvaartingenieur dink van 'n nuwe vlerkvorm wat, wanneer dit by die liggaam van 'n vliegtuig gevoeg is, die vliegtuig op onverwagte maniere laat vlieg het? Om te ontwerp en te bou in die lig van sulke onsekerheid sal groot uitgawes skep en lewens moontlik in gevaar stel. Ingenieurs sal dit byna onmoontlik vind om vorentoe te beweeg met hul ontwerpe as die kombinasies van eenvoudige onderdele en moere en boute of weerstande en versterkers aanleiding gee tot onverwagte gedrag.

Figuur 7-1. Onbedoelde gedrag. Wanneer die standaardstert van 'n vliegtuig (links) na 'n nuwe vorm (regs) verander word, moet die ingenieur bekommerd wees oor onbedoelde gedrag, byvoorbeeld verskille wat beïnvloed hoe die vliegtuig veilig kan land.

Meer gevestigde ingenieursdissiplines maak staat op modulêre komponente wat op 'n verskeidenheid maniere funksioneel saamgestel kan word, wat dit maklik maak om kombinasies aan te pas volgens 'n individu se behoeftes. Die stukke moet nie net fisies verbind word nie, maar, wanneer dit verbind is, moet hulle ook volgens spesifikasie optree. Om dit eenvoudig te stel, die onderdele moet soos verwag funksioneer wanneer hulle saamgestel word.

Op hierdie stadium in die veld van sintetiese biologie werk biologiese ingenieurs steeds aan so 'n funksionele samestelling van genetiese dele. Selfs al het navorsers baie sellulêre gedrag op molekulêre vlak gekarakteriseer en in baie gevalle is dit moontlik om die genetiese elemente wat nodig en voldoende is om 'n biologiese funksie uit te voer, te katalogiseer.die kombinasie van hierdie genetiese komponente op nuwe maniere genereer dikwels onverwagte resultate. Sintetiese bioloë sal dalk binnekort in staat wees om die genetiese materiaal fisies saam te stel om enige gewenste volgorde relatief maklik saam te stel, maar om daardie volgorde in 'n nuwe sellulêre konteks te plaas kan die funksie daarvan op onsekere en veranderende maniere beïnvloed, selfs al is die volgorde deeglik bestudeer en goed gekarakteriseer. in isolasie of in ander kontekste.

Modulariteit, isolasie, en meting van onderdele is deurslaggewende komponente om sulke funksionele samestelling moontlik te maak, benewens standaardisering (sien die Grondbeginsels van DNA-ingenieurswese hoofstuk vir verdere bespreking). In hierdie hoofstuk ondersoek ons ​​hoe hierdie bykomende beginsels toegepas word in standaardingenieurswese in die algemeen en sintetiese biologie in die besonder. Dan beskryf ons die iTune-toestel-eksperiment om 'n verskeidenheid genetiese stroombane in selle te toets om hul verwagte en hul gemete gedrag te vergelyk.

Modulariteit verwys na die idee dat ingenieurs stelsels kan ontwerp en genereer deur funksionele eenhede, of &ldquomodules, te kombineer.&rdquo So intuïtief soos hierdie idee vir ingenieurswese is, is die idee van modulariteit eers onlangs op genetiese dele toegepas. Modulariteit is sinvol om op biologie toe te pas, want ons kan diskrete funksies toeskryf aan spesifieke brokkies DNS&mdash, alhoewel ons hierdie beginsel nou as vanselfsprekend aanvaar, was aansienlike navorsing nodig om dit te bevestig (sien die volgende sybalk).

GENE AS MODULES

Sintetiese biologie veronderstel 'n stel genetiese &ldquodele&rdquo wat gekombineer en gemanipuleer kan word om presiese gedrag te genereer. Die idee onderliggend aan hierdie uitgangspunt dat eienskappe voortspruit uit diskrete funksionele stukkies DNS&mdash is in werklikheid relatief nuut. Dit was eers toe die resultate van Gregor Mendel&rsquos-eksperimente met ertjieplante in die vroeë 1900's herontdek is dat wetenskaplikes begin verstaan ​​het dat eienskappe onderskei kan bly, wat die weg baan vir ons huidige begrip van genetika.

Vir 'n lang tyd is gedink dat die nageslag die genetiese eienskappe van ouers meng. Mendel&rsquo se noukeurige werk met die teel van ertjieplante het getoon dat vermenging nie altyd plaasgevind het nie, en dat 'n eienskap soms getrou van 'n ouerplant na 'n nageslagplant oorgedra kan word. Mendel het hierdie oorerwingstudies uitgevoer deur 'n paar sleutelkenmerke van sy ertjieplante, soos blomkleur en peulvorm, noukeurig te tel en te meet. Sy data het getoon dat eienskappe duidelik kan bly en onafhanklik oorgedra is in voorspelbare verhoudings. Sy resultate het voorgestel dat oorerwing oorweeg moet word in terme van diskrete entiteite, wat hy faktore genoem het, maar wat later gene genoem is. Sy werk het gewys hoe hierdie faktore op voorspelbare maniere tussen generasies oorgedra het. Hierdie idee word vandag as vanselfsprekend aanvaar, maar dit was baanbreker in sy tyd, wat gelei het tot die stigting van die veld van klassieke genetika.

Dit het meer as 50 jaar geneem om 'n molekulêre verklaring te verskaf vir die oorerwingspatrone wat Mendel waargeneem het. Ons moderne begrip berus grootliks op DNA se dubbelheliese struktuur, soos beskryf deur Watson en Crick, en op die klassieke studies van geenuitdrukking in die lac operon van Jacob en Monod. Danksy hierdie wetenskaplike vooruitgang en ander, verstaan ​​ons nou grondliggende idees in biologie, soos die vloei van genetiese inligting van DNS deur RNS na proteïene en die hervorming van eienskappe as DNS-volgordes wat 'n funksie kodeer. Die idee van DNA-dele in sintetiese biologie is 'n produk van hierdie klassieke prestasies.

Veranderinge in die opgeneemde musiekbedryf bied 'n ordentlike (maar nie perfekte) voorbeeld van die voordele verkry uit verhoogde modulariteit. Vir 'n groot deel van die twintigste eeu was die mees algemene en winsgewende manier om musiek te versprei as plate en later as kassetbande en CD's. In al hierdie formate is musiek hoofsaaklik as vollengte-albums verkoop. Enkelliedjies was beskikbaar, maar was aansienlik duurder, so selfs al het mense net van 'n paar van die liedjies op 'n album gehou, het hulle gewoonlik die album gekoop.Die album was die standaard &ldquounit&rdquo vir die musiekbedryf en sy kunstenaars. Hierdie eenheid het heeltemal verander in die vroeë een-en-twintigste eeu, toe musiek gedigitaliseer is. Met hierdie voorskot het dit maklik geword om musiek af te laai in plaas daarvan om die fisiese album te koop. Liedjies van 'n album is maklik ontbondel, wat liedjies onafhanklike modules gemaak het wat luisteraars kon meng en pas soos verlang en nodig was. Die wydverspreide geleentheid om pasgemaakte snitlyste van hierdie modulêre liedjies te maak, het die manier verander waarop mense oor hul musiekversameling dink en het die standaard &ldquounit&rdquo vir die bedryf verander.

Die verbeterde modulariteit en aanpassing wat ons in kommersiële musiek sien, hersien ons veranderende idees van 'n geenuitdrukking eenheid, wat die weg gebaan het vir die gebruik van die term genetiese &ldquoparts&rdquo in sintetiese biologie. Mendel se vroeë werk het getoon dat eienskappe diskrete entiteite was. In die analogie met opgeneemde musiek, dan kan die organisme wat die eienskap vertoon analoog aan die volledige album beskou word&mdash die eienskap bestaan ​​slegs in die konteks van die organisme, net soos die liedjie slegs in die konteks van die volle album bestaan. Dr. Francois Jacob en dr. Jacques Monod, wie se werk later in hierdie hoofstuk uiteengesit word, herskep hierdie prentjie dramaties met hul beskrywing van laktosemetabolisme, en herraam eienskappe in terme van dinamiese genetiese elemente eerder as hele organismes met eienskappe. Spesifieke stukke DNA is geïdentifiseer wat saamgewerk het om 'n sel se gedrag te beheer, maar die genetiese elemente binne daardie stukke was ondeelbaar en nie maklik aangepas om 'n nuwe doel te bereik nie. Hierdie landmerk kan iewers tussen die &ldquoalbum&rdquo en &ldquosingle&rdquo fases van die musiekbedryf beskou word. Nou, in die era van genetiese ingenieurswese en uitruilbare genetiese dele, is baie genetiese volgordes wat spesifieke funksies kodeer bekend en kan presies gemanipuleer word. Ons kan 'n &ldquoplaylist&rdquo van hierdie genetiese elemente aanpas deur hulle op gespesialiseerde maniere te herkombineer om aan ons behoeftes te voldoen. Die tegnieke vir hierdie manipulasie word meer volledig beskryf in die Grondbeginsels van DNA-ingenieurswese hoofstuk. Hier sal ons die ingenieursgeleenthede ondersoek wat ontstaan ​​omdat ons genetiese dele kan meng-en-pas.

Soos modulêre materiale gemeng en gepas word, ontstaan ​​nuwe komplikasies, insluitend die groter kans dat die modules op ongewenste maniere met mekaar kan interaksie. Een instrument om onverwagte interaksies tussen modules te verminder, is om die gedrag van die dele te isoleer. Oorweeg die modulêre opsies wat beskikbaar is wanneer jy 'n motor koop. Jy kan die basiese model op baie maniere opgradeer: verbeterde luidsprekerstelsels, 'n kragtiger enjin, verhitte agtersitplekke, en meer. Hierdie byvoegings is beskikbaar, deels (ha!), aan die modulêre ontwerpbenadering wat die motor&rsquos-ingenieurs gebruik het. Sonder hierdie benadering sal die koste van die opgradering na 'n spoggerige luidsprekerstelsel buitensporig wees omdat die voorste konsole heeltemal herontwerp moet word om elke handelsmerk luidsprekers te akkommodeer. In plaas daarvan is buigsaamheid vir snap-in opgraderings ingesluit in die vroeë ontwerpstadiums, en gevolglik vereis veranderinge ten tyde van aankoop aansienlike herontwerppogings. Aanpassing vir elkeen van die motor&rsquos-modules is verwag, en ontwerpers het aan die begin die harde werk ingesit om die onderdele diskreet te maak.

Benewens die skep van fisies diskrete onderdele wat op baie maniere gekombineer kan word, vereis funksionele samestelling dat die onderdele vertoon gedrag wat skeibaar is van die ander elemente rondom hulle. Byvoorbeeld, as Figuur 7-2 illustreer, die werking van die stereo moet nie die werking van die bestuurder & rsquos stuurwiel beïnvloed. Dit sal 'n ware bestuur-uitdaging wees as die draai van die knop op die radio ook die stuurwiel draai. Sulke gedragsskeiding tussen die werking van dele word na verwys as isolasie.

Figuur 7-2. Isolasie in motorontwerp. ’n Moderne motor bestaan ​​uit veelvuldige komponente, insluitend die sitplekke, wiele, stuurwiel en stereo. Komponente werk onafhanklik, sodat die gebruik van een komponent nie inmeng met die werking van ander komponente in die motor nie.

Soortgelyke antisiperende ontwerp en isolasie van genetiese dele is moeilik om te bereik wanneer met genetiese dele gebou word. Die sel is 'n vloeibare omgewing waar molekules, proteïene en sellulêre strukture voortdurend meng. Hoe is dit moontlik om hul gedrag te isoleer wanneer hulle heeltyd nuwe vennote en bure teëkom? Daarbenewens kan &ldquoupgrades&rdquo na 'n sel optree soos verwag in sommige sellulêre instellings en nie soos verwag in ander nie. Die aktiwiteit in die Wat 'n kleurvolle wêreld hoofstuk illustreer hierdie uitdaging. Selfs al lyk dit of die opgraderings aanvanklik werk, is die sel se plaaslike omgewing dinamies, wat vereis dat sellulêre ontwerpe onder baie omgewings- en groeitoestande werk. Ten slotte, anders as enige ander ingenieurssubstraat, kan en sal lewende materiale met verloop van tyd muteer, soos ons in die Goue Brood hoofstuk. Evolusie van die vervaardigde produk maak die ontwerpuitdaging soveel groter.

Om al die kompleksiteit van biologiese ontwerp te bestuur, kan ons die kragtige ingenieursinstrument van gebruik abstraksie, soos beskryf in die Grondbeginsels van bioontwerp hoofstuk, dus kan besluite oor een ontwerpelement onafhanklik geneem word van die besluite wat vir ander elemente geneem word. 'n Motor & rsquos stereo kan omgeruil word sonder om die stuur te beïnvloed. Verder, modulariteit, isolasie en abstraksie behoort besluite oor toestelle te laat neem sonder om 'n impak op die stelselontwerp te hê. Met verwysing na die motoranalogie, hoef jy nie 'n vragmotor in plaas van 'n motor te koop net omdat jy voorwielaandrywing wil hê nie.

Maar hoe goed werk so 'n benadering vir sintetiese biologie in die praktyk? Sintetiese bioloë wil graag 'n punt bereik waar hulle dele met bekende identiteite en relatiewe sterkpunte voorspelbaar en rasioneel in nuwe sintetiese stroombane kan kombineer. Deur die werklike werkverrigting van sintetiese stelsels, saamgestel uit goed-gekarakteriseerde dele, te meet en die metings te vergelyk met wat voorspel is, kan biobouers hul ontwerpe assesseer en nader beweeg om die sukses of mislukking van toekomstige ontwerpe korrek te voorspel.

Beginsels van meting

Sommige dinge is moeilik om te meet. Geluk het byvoorbeeld geen skaal of eenheid waaroor ons almal kan saamstem nie, en daar is geen instrumente om dit betroubaar op te spoor nie. Ander dinge word heeltyd gemeet: ons kan 'n numeriese waarde assosieer aan kaarte in 'n dek, graadpuntgemiddeld of spanstandpunte in 'n sportliga. Of jy nou 'n maaltyd wil kook of klere van die rak af koop, jy maak staat op afmetings om getal, grootte, tyd of dinge te tel. Metings rapporteer oor die toestand van die items, en hul gedrag, verhoudings of kenmerke.

Wanneer iets gemeet kan word, gee eenhede ons 'n algemene manier om items te vergelyk. Die standaardisering van die eenhede vir elke meting is nie triviaal nie, soos ons beskryf in die Grondbeginsels van DNA-ingenieurswese hoofstuk, maar vir baie items is daar eenhede waaroor ons ooreengekom het. Om die hoogte van 'n perd in &ldquohands&rdquo te meet, is 'n goeie voorbeeld. Danksy Henry VIII, wat 'n hand tot 4 duim gestandaardiseer het, het selfs hierdie verouderde eenheid steeds betekenisvolle metingsinligting. Enigiemand wat vertroud is met die handmeting weet dat 'n perd wat 16 hande hoog staan ​​64 (16 x 4) duim by die skof (naby die skouer) is en dat 'n ander perd wat 16,3 hande meet, 67 (16 x 4 + 3) duim is, nie 65,2 (16,3 x 4) duim nie.

Betekenisvolle metings, ongeag die eenheid, is 'n kenmerk van moderne wetenskaplike benaderings. Soos Mendel ons gewys het, kan ons patrone sien wanneer ons dinge tel. Kwalitatiewe data kan ook hoogs insiggewend wees, soos ondersoek in die Eau Daai Reuk hoofstuk. Hier belig ons egter hoe wiskundige metings ons kragtig in staat stel om inligting te manipuleer en om te skakel na ander voorstellings. Getalle maak dit ook vir ons moontlik om vergelykings en voorspellings te maak.

As voorbeeld, probeer om jou stap skool toe te vergelyk met dié van jou vriend wanneer kwalitatiewe metings al is wat jy het. In so 'n geval is jy beperk om dinge te sê soos: &ldquoskool is baie ver van my huis af, baie verder as van joune, maar ek stap vinniger as jy.&rdquo Maar deur die myl, tye en spoed te meet, is dit skielik moontlik om bepaal hoe vroeg julle elkeen die huis moet verlaat om om 08:00 by die skool te ontmoet As jy die afstande en jou stapkoerse ken, kan jy verwag hoe lank die reis sal neem. Pas hierdie les toe op ingenieurswese: meting gee ons die vermoë om te voorspel, wat baie nuttig kan wees&mdashmaar slegs as ons relevante metings kan maak. Wat 'n meting relevant maak, word vervolgens beskryf.

Wat & rsquos Normaalweg gemeet

Ingenieurs gebruik meting nie net om te beskryf nie, maar ook om die voorwerpe wat gemeet word te beheer, saam te stel en te verbeter. Die samestelling van modulêre dele illustreer die belangrikheid van metings. Om een ​​deel betroubaar met 'n ander saam te stel, moet die relevante kenmerke van elke deel bekend wees en moet voldoen aan een of ander ooreengekome standaard. Andersins het ratte gewen&rsquot gedraai, moere gewen&rsquot op skroefdrade gepas, en Lego-stene kan in modelle van beide die Death Star en die Eiffeltoring saamgestel word. Deur aan bepaalde metingstandaarde te voldoen, het modulêre onderdele die grondslag geword vir moderne fabrieke en doeltreffende monteerlynvervaardiging. Sommige van die vergelykings en metings waarop ingenieurs staatmaak, word in besonderhede uiteengesit Tabel 7-1.

Meting

Beskrywing

Statiese prestasie

Karteer 'n reeks beheerde insette na 'n deel & rsquos meetbare finale uitset(s)

Nuttig om te verseker dat een deel se uitset voldoende sal wees om die volgende deel in 'n stroombaan te aktiveer

Dinamiese prestasie

'N Deel & rsquos uitset oor tyd in reaksie op 'n verandering in die insetsein

Toon hoe 'n sisteem sal optree by aanvanklike stimulasie, wat kan verskil van gestabiliseerde langtermyngedrag

Invoerversoenbaarheid

Hoe 'n onderdeel op verskeie insette reageer

Illustreer die deel se buigsaamheid vir komposisie met verskeie stroomop dele/insette

Betroubaarheid

Gemeet as gemiddelde tyd tot mislukking (MTF)

Word gebruik om te bepaal hoe lank daar van die stelsel verwag kan word om op te tree soos oorspronklik gespesifiseer

Verbruik van materiaal of hulpbronne

Bepaal die keuse van kragtoevoer of hulpbronpoel

Beïnvloed onder meer onderstelbesluite

Tabel 7-1. Tipiese metings vir ingenieursdissiplines

Maak en rapporteer metings vir Sintetiese Biologie

Wat jy meet, sal jou verskillende dinge vertel oor hoe sintetiese DNS-kringe in 'n sel werk. Die mees direkte meting van 'n stroombaanaktiwiteit sou gemaak word as ons tot mikroskopiese grootte kon krimp, net soos Me. Frizzle in die Magic School Bus boekreeks, en sit dan magies op die DNA om die aantal RNA-polimerases te tel wat elke sekonde langs die DNA beweeg. In elektroniese terme sal dit wees soos om elektrone te tel terwyl hulle in 'n stroom vloei. Meer eksperimenteel redelik is egter om die produkte van transkripsie en vertaling te meet. Hoeveel mRNA's word per sekonde gemaak of hoe versamel die proteïen met verloop van tyd? Hierdie RNA- en proteïenmetings is moontlik maar intensief in terme van die toerusting, tyd en kundigheid wat benodig word. Om dinge 'n bietjie makliker te maak in BioBuilder & rsquos iTunes laboratorium aktiwiteit, & beta-galactosidase (&beta-gal) aktiwiteit word gemeet, wat 'n indirekte maar goeie weerspieëling is van die werkverrigting van elke stroombaan.

Ervaring het getoon dat wanneer DNS-kringe van een biologiese konteks na 'n ander verskuif word, dit kan moeilik wees om te voorspel hoe die genetiese dele sal werk. Die aktiwiteit van 'n deel word veranderlik op baie vlakke beïnvloed, insluitend die tempo van transkripsie, translasie en proteïenaktiwiteit in sy nuwe sellulêre omgewing. Wat bydra tot die uitdaging van betroubare samestelling is die feit dat, wanneer lewende stelsels saamgestel word wat uit veelvuldige genetiese dele bestaan, dit moeilik is om te voorspel hoe die dele met mekaar sal kommunikeer. Byvoorbeeld, 'n sterk &ldquoon&rdquo-sein wat deur een deel gegenereer word, is dalk nie sterk genoeg om 'n stroomaf-deel te aktiveer waarmee dit bedoel is om te werk nie.

Sintetiese biologie is egter nie die eerste ingenieurspoging om hierdie samestelling-uitdagings teë te kom nie. Een benadering wat meer gevestigde ingenieursdissiplines gebruik het, is om te ontwikkel datablaaie wat beskryf hoe enige gegewe onderdeel sal werk as 'n funksie van spesifieke parameters. Om sulke datablaaie te maak, moet ingenieurs genoegsame data versamel om hul deel volledig te beskryf, dit met spesifieke insette en onder baie verskillende toestande en omgewings te toets.

Sintetiese bioloë kan soortgelyke datablaaie vir hul dele skep. Byvoorbeeld, een datablad wat gepubliseer is vir 'n transkripsiefaktor in die Register van Standaard Biologiese Onderdele, rapporteer die statiese werkverrigting, dinamiese werkverrigting, invoerversoenbaarheid en betroubaarheid van die deel. Dit is dieselfde parameters wat vroeër in Tabel 7-1. Ideaal gesproke sal hierdie metings en beskrywings van die deel se gedrag geld wanneer dit ook al gebruik word. Egter selfs as die gedrag daarvan verskil na gelang van konteks, kan die instruksies en inligting op die deel se datablad 'n biobouer toelaat om hierdie veranderlikheid in ag te neem. Hierdie &ldquodatablad&rdquo-benadering werk net vir dele wat op betroubare en voorspelbare maniere verskil, wat nie altyd die geval is nie, maar dit is 'n belangrike eerste stap in die rigting van funksionele standaardisering.

Nog 'n faktor wat bydra tot 'n deel & rsquos waargenome robuustheid (of gebrek daaraan) is die normale laboratorium-tot-laboratorium veranderlikheid in meting tegnieke. Selfs twee mense in dieselfde laboratorium wat dieselfde ding meet, sal waarskynlik nie met identiese waardes vorendag kom nie weens subtiele variasies in tegniek, media, selgroeitoestand, en wie weet wat nog. Sintetiese bioloë is gretig om die onderliggende oorsake van hierdie variasies te identifiseer, maar besef dat dit 'n langtermyndoelwit is. Intussen, jy kan kalibrasieverwysings gebruik om metings wat op een plek gemaak is, te vergelyk met die metings wat op 'n ander gemaak is. BioBuider&rsquos iTunes Device lab maak gebruik van 'n verwysingstandaard om hierdie rede.

Grondliggende konsepte vir die iTunes Device Lab

In hierdie BioBuilder-aktiwiteit kan jy die biologiese aktiwiteit van genetiese dele ondersoek wat na verwagting in kombinasie sal werk om verskillende hoeveelhede van 'n ensiem te genereer. Elkeen van hierdie dele is onafhanklik gekarakteriseer as &ldquoswak,&rdquo &ldquomedium,&rdquo of &ldquostrong.&rdquo Hierdie aktiwiteit vra hoe goed jy die gedrag van hierdie individueel gekenmerkte dele kan antisipeer wanneer hulle op verskillende maniere gekombineer word. 'n Begrip van geenuitdrukking en die rol van promotor- en ribosoombindingsplekdele, soos hieronder beskryf, is noodsaaklik om te begin.

Promotors en RBS'e

Dikwels genoem die &ldquosentrale dogma&rdquo van geenuitdrukking, die mantra &ldquoDNA maak RNA maak proteïen&rdquo is 'n afkorting vir die beginsel dat proteïene saamgestel word deur translasie van RNA-volgordes, en RNA-volgordes word getranskribeer vanaf DNA-volgordes. Proteïene voer baie sleuteltake in 'n sel uit, so transkripsie en vertaling beheer baie van die sel se gedrag en eienskappe. Dit is dus nie verbasend nie, transkripsie en vertaling is omvattend bestudeer, en baie van die kernkomponente wat nodig en voldoende is vir beheerde geenuitdrukking is bekend (Figuur 7-3).

Figuur 7-3. Simboliese voorstelling van 'n geenuitdrukking-eenheid. Die promotorvolgorde, voorgestel deur die pyltjie aan die linkerkant, bind RNA-polimerase om transkripsie te inisieer. Die ribosoombindingsplek, afgekort as &ldquoRBS&rdquo en voorgestel deur 'n halfsirkel, is 'n DNS-volgorde wat die segment van mRNA kodeer waar die ribosoom bind om translasie te begin. Die oop leesraam, afgekort &ldquoORF&rdquo en voorgestel deur die pyltjie aan die regterkant verteenwoordig 'n DNS-volgorde wat 'n proteïen kodeer. Die rigting van die pyle vir die promotor en ORF dui die rigting aan waarin hulle gelees word.

Vir transkripsie, promotors is die DNA-volgordes wat RNA-polimerase, 'n komplekse multiproteïen-ensiem, bind om die vorming van RNA-kettings vanaf die DNA-sjabloon te inisieer. Vir vertaling word die inisiasieterrein dieribosoom bindingsplek (RBS) omdat die ribosoom hierdie volgorde herken om proteïensintese vanaf die RNA-sjabloon te begin. Hierdie reekse is grootliks verantwoordelik vir natuurlik voorkomende transkripsie- en translasieregulering, en sintetiese bioloë kan dit ook gebruik om hul eie reguleringskemas in te stel. Gebaseer op die vele bekende promotor- en RBS-volgordes, het navorsers 'n geïdentifiseer konsensus volgorde vir hierdie dele, soos gedemonstreer in Figuur 7-4. Die konsensus-promotorvolgorde, byvoorbeeld, is bepaal deur 'n vergelyking van die nukleotiede by elke posisie in baie promotorvolgordes. Die konsensus word gebou uit die patroon van nukleotiede wat die meeste in elke posisie voorkom.

Figuur 7-4. Definieer konsensusreekse. Veelvuldige &ldquosequences&rdquo vir 'n sin (links) en 'n geen (regs) word in lyn gebring om 'n konsensusvolgorde te genereer, wat in die onderste lyn in grys getoon word. Letters wat groen gekleur is, verteenwoordig die mees algemene letter by elke posisie, wat die konsensusvolgorde definieer. Letters in rooi is nie die mees algemene letters op daardie posisie nie en word dus nie in die konsensusvolgorde ingesluit nie.

Konsensusreekse is relevant vir sintetiese biologie omdat, oor die algemeen, 'n deel die beste funksioneer wanneer dit nou ooreenstem met die konsensusvolgorde. Omgekeerd, hoe meer nukleotiede wat van die konsensusvolgorde verskil, hoe minder bekwaam kan daardie deel sy werk doen. Dus is 'n konsensus-promotorvolgorde waarskynlik 'n "sterk promotor", wat beteken dat dit waarskynlik RNA-polimerase goed sal bind en transkripsie dikwels sal inisieer, terwyl 'n promotor of RBS-volgorde wat van konsensus afwyk, &ldquo-swak sal wees, en sy werk minder doeltreffend sal doen as 'n reeks met beter wedstryde. Sterk beteken egter nie noodwendig beter nie. Afhangende van die toepassing, sal 'n ingenieur dalk net 'n klein vlak van aktiwiteit wil hê, as, byvoorbeeld, 'n porie op die seloppervlak gemaak word of as 'n seldoodreaksie gereguleer word.

Die Lac Operon

'n Sel se vermoë om geenprodukte aan en af ​​te skakel soos nodig is van kritieke belang vir sy oorlewing. In die 1960's het dr. Francois Jacob en dr. Jacques Monod grondbeginsels van geenuitdrukking geïdentifiseer deur hul studies van laktosevervoer en -metabolisme in bakterieë. Die gene vir laktosemetabolisme is gegroepeer in die lac operon (Figuur 7-5), maar die bakterieë bespaar energie deur hierdie gene slegs aan te skakel wanneer glukose afwesig is.Bakterieë verkies glukose as voedselbron, en sal slegs die moeite doen om laktose te benut as die voorkeurvoedsel afwesig is. Die molekulêre besonderhede in Jacob en Monod se verduideliking vir die regulering daarvan is 'n klassieke model vir induseerbare geen. Hier bespreek ons ​​slegs die besonderhede wat relevant is vir die iTunes-toestellaboratorium.

Figuur 7-5. Simboliese voorstelling van die lac operon. Die lac-operon bestaan ​​uit 'n enkele promotor (pLac, groen pyl) wat drie stroomaf RBS&ndashORF-pare (onderskeidelik groen halfsirkels en blou pyle) beheer. Die operon produseer die ensieme wat nodig is om suikers te metaboliseer slegs wanneer glukose nie teenwoordig is nie.

Die sleutelproteïen vir laktosemetabolisme is 'n ensiem genaamd &beta-galaktosidase, dikwels afgekort &beta-gal, en dit word op die DNA gekodeer deur die ORF genaamd lacZ. Die &beta-gal ensiem klief laktose in glukose en galaktose, wat deur die sel gebruik kan word om sy ander funksies aan te dryf. Navorsers het ook gevind dat &beta-gal reageer met 'n verskeidenheid molekules soortgelyk aan laktose, insluitend sintetiese analoë soos ONPG, wat jy in die iTune-toestellaboratorium sal gebruik.

LacZ uitdrukking, en dié van die hele lac operon, word beide positief en negatief gereguleer op die transkripsievlak (Figuur 7-6). Positiewe regulering vind plaas wanneer 'n DNA-bindende proteïen die hoeveelheid transkripsie deur DNA-elemente stroomaf van sy DNA-bindingsplek verhoog. Omgekeerd, negatiewe regulering is die term wat gebruik word om die geval te beskryf waarin DNA-bindende proteïene die hoeveelheid transkripsie verlaag wanneer hulle die DNA bind. Vir die lac operon is die positiewe en negatiewe regulatoriese faktore sensitief vir die soort suiker in die bakterieë & rsquos omgewing. Wanneer glukose teenwoordig is, skakel die regulatoriese faktore transkripsie van die stroomafwaartse ORF's uit. As laktose teenwoordig is en glukose afwesig is, verander dieselfde transkripsie-regulerende faktore hul gedrag, en transkripsie van die operon lei tot vervoer en metabolisme van laktose.

Dieselfde positief en negatief gereguleerde promotor wat lacZ beheer, beheer ook die ander lac operon gene, insluitend die een wat die laktose vervoer proteïen kodeer. 'n Enkele mRNA word getranskribeer vanaf die lac operon&rsquos-promotor, wat aanleiding gee tot die veelvuldige proteïenprodukte wat nodig is vir laktosemetabolisme en vervoer. Translasie van elke produk kan vanaf die enkele mRNA plaasvind danksy die RBS'e wat met elke ORF geassosieer word. Dit is 'n kompakte en elegante genetiese argitektuur wat die natuur ingestel het om die nodige hoeveelhede van elke proteïen te produseer wanneer toepaslik.

Figuur 7-6. Lac operon regulasie. Die lacI ORF kodes vir 'n transkripsionele onderdrukker wat die Plac promotor en blokkeer dus die uitdrukking van die hele operon. Laktose, of sy analoog IPTG, inhibeer die LacI-onderdrukkerproteïen, wat die Plac promotor om te funksioneer en verlig inhibisie van die stroomaf-operon.

Bykomende leeswerk en hulpbronne

&sekte Canton, B., Labno, A., Endy, D. Verfyning en standaardisering van sintetiese biologiese dele en toestelle. Natuur Biotegnologie 2008 26:787-93.

&sekte Jacob F., Monod J. Genetiese reguleringsmeganismes in die sintese van proteïene. JMB. 19613:318-56.

& sekte Kelly, J.R. et al. Meting van die aktiwiteit van BioBrick-promotors deur gebruik te maak van 'n in vivo verwysingstandaard. Tydskrif vir Biologiese Ingenieurswese (2009)3:4.

&sekte McFarland, J. Nephelometer: 'n instrument vir die skatting van die aantal bakterieë in suspensies wat gebruik word vir die berekening van die opsoniese indeks en vir entstowwe. JAMA. 190714:1176-8.

&sekte Miller, J.H. Eksperimente in Molekulêre Genetika Cold Spring Harbor 1972 Cold Spring Harbor Laboratory Press.

&sekte Salis, H.M. Die ribosoombindingsplekrekenaar. Metodes Ensiemol. 2011498:19-42.

&sekte Webwerf: Register van Biologiese Onderdele (http://parts.igem.org/Main_Page).

iTunes-toestellaboratorium

Hierdie laboratorium fokus op die proteïene en DNA-volgordes wat nodig is om 'n geen uit te druk (promotors, ORF's, RNA-polimerase, ensovoorts) en dien ook as 'n inleiding tot basiese ensiemologie. Die ingenieurskonsepte van modulariteit, isolasie en meting word ondersoek deur nege geenregulerende ontwerpe te ontleed. Elke ontwerp het 'n unieke kombinasie van promotor en RBS wat die uitdrukking van 'n ensiem, beta-galaktosidase, beheer. Spektrofotometriese analise en ensiemkinetiese toetse is die belangrikste biotegnologievaardighede wat in hierdie laboratorium beklemtoon word.

Ontwerpkeuses

In teenstelling met die natuurlik voorkomende lac-operon, is die genetiese argitekture van die iTunes-toestel geenkringe eenvoudiger strukture, met een promotor en een RBS wat een ORF beheer (sien Figuur 7-7). Om enige impak van hierdie positiewe en negatiewe regulatoriese faktore op die iTunes-toestelmetings te verlig, word die selle in ryk media gegroei, maar sonder die sel se positiewe regulatoriese proteïen, en in die teenwoordigheid van IPTG, 'n molekule wat die negatiewe regulatoriese proteïen inhibeer. Ons kan die gedrag van die iTunes-kringe aanpas as gevolg van die modulêre gedrag van elke DNA-deel. Soos Jacob en Monod beskryf het vir E coli&rsquos natuurlike lac operon, die iTunes Device & rsquos dele het diskrete funksies en prestasie eienskappe, wat sintetiese bioloë gebruik tot hul voordeel vir bio-ontwerp.

Figuur 7-7. Wysiging van die lac operon. Genetiese konstrukte, soos dié wat in die iTunes-toestelaktiwiteit bestudeer word, se tweede en derde RBS-ORF-pare word verwyder. Die resulterende geenuitdrukking-eenheid dra 'n enkele promotor-RBS-ORF.

Eksperimentele Vraag

In die BioBuilder iTune-toestellaboratorium sal jy die aktiwiteit van die lacZ-geenproduk, &beta-gal, meet om die prestasie van verskillende promotor- en RBS-kombinasies te assesseer. Die promotor en RBS dele is gekarakteriseer as &ldquoswak,&rdquo &ldquomedium,&rdquo of &ldquostrong,&rdquo gebaseer op hul belyning tot konsensusvolgorde vir sulke dele. Hoe hulle in kombinasie sal werk, kan egter afhang van kultuurmedia, stamagtergrond en tegnieke om hulle te assesseer. As jy die tyd of belangstelling het, kan jy hierdie metings maak in verskillende bakteriese stamme, in stamme in verskillende stadiums van groei, of met bykomende DNS-kringe in die lewende stelsel. Enige van hierdie faktore kan verander hoe hierdie eenvoudige promotor:RBS:lacZ stroombane in die sel werk.

Wat kan jy voorspel oor die aktiwiteit van hierdie stroombane voordat jy die laboratorium bestuur om hulle te meet? Tabel 7-2 kan help om jou &ldquogueskattings&rdquo te organiseer, asook enige vooroordele in jou denke en leemtes in jou begrip openbaar. As ons arbitrêr raai dat die kombinasie van 'n swak promotor en 'n swak RBS aanleiding sal gee tot 10 eenhede, en die sterk/sterk kombinasie sal aanleiding gee tot 1 000 eenhede, hoe kan ons alles tussenin skat? Die beginwaardes in die grafiek is teoreties en weerspieël dalk nie die getalle wat jy vir hierdie stroombane kry wanneer jy hierdie eksperiment uitvoer nie. Die punt is om te vra wat dit sal neem om 'n goeie voorspelling te maak.


1*. transkripsie (aktiveer/onderdruk)2. RNA-verwerking (alternatiewe splitsing)3. mRNA vervoer (vas in kern = afgebreek)4*. mRNA-vertaling (tempo en her-inisiasie: 5'cap/polyA-stert)5. mRNA-afbraak (Lang polyA-stert = langer lewe)6. Proteïenaktiwiteit/degradasie (na-vertaalwysiging)

CIS-- VERBETERKER VOLGORDE OP DNS (regulatories)

TRANS- 'N AKTIVEREERDER PROTEÏEN BIND CIS VOLGORDE

CIS Elemente= Regulerende DNA volg. waar TF's bind
--- dws:(bevorderaars/versterkers)

TRANS-geen-regulerende proteïene wat cis-elemente herken.
----ie: (TFIID, Aktiveerders)


Suiwelbiotegnologie

Al die metaboliese funksies in 'n sel met betrekking tot beide degradatiewe en biosintetiese weë in prokariote en eukariote word uitgevoer deur die uitdrukking van spesifieke gene wat op hul DNA gekodeer is vir groei en ontwikkeling. Al die gene wat in 'n sel teenwoordig is, word egter nie heeltyd uitgedruk tensy hul funksies absoluut onontbeerlik is nie. Die meerderheid van die gene word slegs aangeskakel wanneer die produkte van sulke gene nodig is vir die groei in 'n gegewe omgewing (sein). Hul uitdrukking is afgeskakel wanneer hul produkte óf nie meer nodig is nie óf sel reeds voldoende hoeveelhede van hierdie produkte het. Hierdie aan- en afskakeling van die geenuitdrukking in 'n sel vorm 'n baie kragtige, streng gereguleerde stelsel vir die beheer van geenfunksionaliteit. Deur die uitdrukking van gene af te skakel wanneer hul produkte nie benodig word nie, kan 'n organisme onnodige vermorsing van energie vermy aangesien die energiebronne wat in 'n sel beskikbaar is, beperk is. Die sel moet die bewaarde energiebronne baie oordeelkundig benut om produkte te sintetiseer wat die sellulêre groeitempo maksimeer. Geenuitdrukking in 'n bakteriese populasie word hoofsaaklik gereguleer deur drie meganismes, naamlik konstitutiewe, induseerbare en onderdrukbare sisteme wat in hierdie organismes werk.

7.2 Konstitutiewe uitdrukking

Konstitutiewe geenuitdrukking word nie gereguleer nie, wat tipies is van gene waarvan die produkte onontbeerlik is vir sellulêre funksies. Hierdie gene bly altyd aangeskakel en hou voortdurend en stabiel die verlangde ensieme of proteïene produseer vir die groei en oorlewing van die sel. Sulke gene word huishoudelike of samestellende gene genoem wat vir RNA en proteïene kodeer met basale lewensfunksies soos rRNA, ribosomale proteïene en glikolitiese/respiratoriese ensieme.

7.3 Induseerbare en onderdrukbare gene

Induseerbare en onderdrukbare geenprodukte word slegs onder sekere omstandighede benodig. Induseerbare gene word 'aangeskakel' in reaksie op die teenwoordigheid van 'n substraat (induseerder) in die omgewing bv. laktose in lac operon.

Onderdrukbare gene word 'afgeskakel' in reaksie op 'n omgewingsein bv. die gelyktydige teenwoordigheid van laktose/glukose of xilose/glukose wat die gene wat benodig word vir die benutting van laktose of xilose sal onderdruk.

7.4 Negatiewe en positiewe regulering van geenuitdrukking

Bakterieë verander die geenuitdrukking deur positiewe of negatiewe regulering te gebruik. Fundamentele verskil tussen positiewe en negatiewe regulering is wanneer die regulatoriese molekule dws onderdrukker alleen (lac operon) of onderdrukker saam met induseerder/eindproduk ('trp operon') bindend is aan die promotor en ook of die molekule toeneem (inducer) of daal (onderdrukker) die geenuitdrukking.

Prokariotiese geenuitdrukking word streng gereguleer op die vlak van transkripsie, translasie en ensiemfunksies. Aangesien transkripsie en translasie in prokariote gekoppel word, is die vlak van beheer in geenuitdrukking relatief hoër op transkripsievlak.


'n Operon vorm 'n genetiese skakelaar wat slegs in prokariote werk om 'n groep gene betrokke by metaboliese weë (degradatief en biosinteties) vir hul funksionaliteit te koördineer. Hierdie gene word saam getranskribeer onder die beheer van dieselfde promotor in 'n enkele polisistroniese mRNA wat uiteindelik in hul individuele polipeptiede vertaal word. Operon bestaan ​​uit drie basiese elemente: Die strukturele gene, die regulatoriese volgordes nl. promotor- en operateurstreke en die regulerende geen. Die bekendste voorbeeld van die operonstelsel is die 'lac operon' in E. coli wat nou wyd gebruik word as 'n model om die meganisme van laktosebenutting in bakterieë te verstaan.


'n Operon is 'n funksionele eenheid van geenuitdrukking in bakterieë. Dit verteenwoordig die unieke geenregulerende stelsel wat slegs in prokariote werk. Die 'lac operon' model is voorgestel deur Jacob en Monod in 1961 om gekoördineerde regulering van gene te beskryf wat ensieme kodeer wat nodig is vir die benutting van laktose in E. coli.

7.6.1 Elemente van 'lac operon'

Die 'lac operon' bestaan ​​uit die volgende sleutelelemente soos in Fig.7.1 getoon.

7.6.1.1 Drie strukturele gene

'Lac operon' bestaan ​​uit drie strukturele gene nl. lacZ-, lacY- en lacA-koderende ensieme/proteïene wat funksioneel verwant is om die metabolisme van laktose in E. coli teweeg te bring. Al hierdie drie gene is onder die beheer van 'n enkele promotor en is betrokke by die afbreek van laktose.

i) LacZ kodeer vir β-galaktosidase wat laktose in glukose en galaktose afbreek.

ii) LacY-kodes vir laktosepermease benodig vir die vervoer van laktose na E. coli-selle.

iii) LacA kodeer vir tiogalaktosied transasetilase waarvan die presiese funksie nog nie bekend is nie.


7.6.1.2 Regulerende volgordes

Die regulatoriese volgordes van die 'lac operon' sluit die volgende in.

i) LacO - die operateurstreek (O) waarby die 'lac'-onderdrukker bind om die promotor vir RNA-polimerasebinding te blokkeer, waardeur die 'lac-operon' afgeskakel word.

ii) LacP - die promotorstreek (P) waarby RNA-polimerase bind om die transkripsie van die strukturele gene na polisistroniese mRNA te inisieer.

iii) LacI - die regulerende geen wat kodeer vir die trans-werkende 'lac'-onderdrukkerproteïen wat by die operateurgebied bind om die transkripsie te blokkeer in die afwesigheid van laktose - die induseerder van lac-operon. Trouens, die werklike induseerder van die lac operon is die allo-laktose 'n isomeer van laktose.

iv) LacI is nie binne die lac operon geleë nie maar stroomop verskeie nukleotiede weg van die lac operon saam met sy eie promotor om die 'lac' onderdrukker te sintetiseer

Afgesien hiervan is daar 'n paar effektormolekules wat die binding van die onderdrukker of RNA-polimerase aan hul onderskeie plekke by die promotor-operateur-streke van die lac-operon aktiveer of deaktiveer. Die organisasie van die 'lac operon' en sy funksionering in die regulering van die strukturele gene wat benodig word vir laktosemetabolisme in E. coli word skematies hieronder geïllustreer.

Die lac-operon word verskillend gereguleer in die teenwoordigheid of afwesigheid van die induseerder, dit wil sê laktose (allolaktose) soos hieronder beskryf.

7.7.1 In afwesigheid van laktose

Wanneer laktose afwesig is van die groeimedium wat met E. coli ingeënt is, word lac-onderdrukker gesintetiseer deur lacI vanaf sy promotor uit te druk met behulp van RNA-polimerase in aktiewe vorm en in die medium gediffundeer om die operateurplek in die operon te bereik. Die binding van die onderdrukker by die operateur blokkeer die binding van RNA-polimerase by die promotor en dus word die strukturele gene afgeskakel en dus word die polisistroniese mRNA nie deur die operon gesintetiseer nie. Die regulering van 'lac operon' in afwesigheid van induseerder dws laktose word in Fig. 7.2 getoon.

7.7.2 In teenwoordigheid van laktose

Wanneer laktose in die groeimedium beskikbaar is, sal dit met die onderdrukker by sy induseerderbindingsplek bind en die konformasie van die onderdrukker verander wat nie meer met die operateurplek op die lac operon kan bind nie. Gevolglik is daar geen belemmering in die binding van die RNA-polimerase by die promotor nie en daarom word al die drie strukturele gene getranskribeer na 'n polisistroniese mRNA waaruit al die drie ensieme wat nodig is vir laktosemetabolisme onafhanklik vertaal word om hul spesifieke funksies te verrig. Die regulering van 'lac operon' in die teenwoordigheid van induseerder dws laktose word in Fig. 7.3 getoon.

Trouens, die werklike induseerder van lac operon is nie laktose nie, maar sy isomeer allolaktose wat uit laktose geproduseer word met behulp van β-galaktosidase. Die grootste beperking van laktose (Allolaktose) wat egter as die induseerder dien wanneer dit in die medium gevoeg word, is die konstante gebruik daarvan deur E. coli tydens groei en moet dus voortdurend aangevul word om die induksie van lac operon aan die gang te hou. Hierdie probleem is grootliks opgelos met die sintese van IPTG (Iso Propyl Thio Galactoside), 'n strukturele analoog van laktose - 'n gratis induseerder van die lac operon wat as 'n doeltreffende kunsmatige induseerder optree sonder om deur die bakterie gemetaboliseer te word en dus daar bly. onbepaald in die groeimedium. IPTG word wyd gebruik in die laboratorium in die indusering van die uitdrukking van heteroloë gene in E. coli vir grootskaalse produksie van hoëwaarde rekombinante proteïene.

7.7.3 Lac-operon is onder beide negatiewe en positiewe regulering

Lac operon is 'n klassieke voorbeeld van 'n operon wat onderhewig is aan beide negatiewe en positiewe regulering. Die negatiewe regulering soos reeds genoem word bemiddel deur die onderdrukkermolekule wat die operateur sal bind in die afwesigheid van die induseerder en dus die strukturele gene sal afskakel deur hul transkripsie te inhibeer. Die positiewe regulering van lac operon word veroorsaak deur 'n seinmolekule genaamd cAMP (Sikliese Adenosienmonofosfaat) wat die uitputting van glukosekonsentrasie in die medium waarneem (Wanneer E.coli-selle onder hongertoestande verkeer). Onder hoë glukosekonsentrasies in die medium, daal die vlak van cAMP in die sel en omgekeerd, by lae glukosekonsentrasies, verhoog die cAMP-vlak in die sel. cAMP aktiveer 'n ander proteïen genaamd CRP (cAMP Receptor Protein) ook aangewys as CAP (Catabolite Activator Protein) wat slegs by die CRP-plek in die lac-operon naby die lac-promotor sal bind wanneer dit met cAMP gekomplekseer is. Die binding van die aktiewe CRP sal die binding van RNA-polimerase by die promotor versterk en daardeur die uitdrukking van lac operon aansienlik verhoog. Die werking van positiewe regulering van 'lac operon' is in Fig. 7.4 gedemonstreer.

Verdere leeswerk

Fundamental Bacterial Genetics, Nancy Trun, Janine Trempy (Eds), Wiley-Blackwell, 2003, ISBN: 978-0-632-04448-1

Van gene tot genome: konsepte en toepassings van DNA-tegnologie, 3de uitgawe, Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nicholas Plant (Eds), Wiley-Blackwell, 2011, ISBN: 978-0-470-68386-6

Mikrobiese Genetika, 2de uitgawe, Stanly R Maloy, John Cronan, David Freifelder, Narosa, ISBN: 8173196974

Molecular Biology of the Gene, Sesde Uitgawe, James D. Watson (Redakteur) Cold Spring Harbor Press en Benjamin Cummings, ISBN 978-080539592-1


SUIWELBIOTEGNOLOGIE

Al die metaboliese funksies in 'n sel met betrekking tot beide degradatiewe en biosintetiese weë in prokariote en eukariote word uitgevoer deur die uitdrukking van spesifieke gene wat op hul DNA gekodeer is vir groei en ontwikkeling. Al die gene wat in 'n sel teenwoordig is, word egter nie heeltyd uitgedruk tensy hul funksies absoluut onontbeerlik is nie. Die meerderheid van die gene word slegs aangeskakel wanneer die produkte van sulke gene nodig is vir die groei in 'n gegewe omgewing (sein). Hul uitdrukking is afgeskakel wanneer hul produkte óf nie meer nodig is nie óf sel reeds voldoende hoeveelhede van hierdie produkte het. Hierdie aan- en afskakeling van die geenuitdrukking in 'n sel vorm 'n baie kragtige, streng gereguleerde stelsel vir die beheer van geenfunksionaliteit. Deur die uitdrukking van gene af te skakel wanneer hul produkte nie benodig word nie, kan 'n organisme onnodige vermorsing van energie vermy aangesien die energiebronne wat in 'n sel beskikbaar is, beperk is. Die sel moet die bewaarde energiebronne baie oordeelkundig benut om produkte te sintetiseer wat die sellulêre groeitempo maksimeer. Geenuitdrukking in 'n bakteriese populasie word hoofsaaklik deur drie meganismes gereguleer m.a.w.konstitutiewe, induseerbare en onderdrukbare sisteme wat in hierdie organismes werk.

7.2 Konstitutiewe uitdrukking

Konstitutiewe geenuitdrukking word nie gereguleer nie, wat tipies is van gene waarvan die produkte onontbeerlik is vir sellulêre funksies. Hierdie gene bly altyd aangeskakel en hou voortdurend en stabiel die verlangde ensieme of proteïene produseer vir die groei en oorlewing van die sel. Sulke gene word huishoudelike of samestellende gene genoem wat vir RNA en proteïene kodeer met basale lewensfunksies soos rRNA, ribosomale proteïene en glikolitiese/respiratoriese ensieme.

7.3 Induseerbare en onderdrukbare gene

Induseerbare en onderdrukbare geenprodukte word slegs onder sekere omstandighede benodig. Induseerbare gene word 'aangeskakel' in reaksie op die teenwoordigheid van 'n substraat (induseerder) in die omgewing bv. laktose in lac operon.

Onderdrukbare gene word 'afgeskakel' in reaksie op 'n omgewingsein bv. die gelyktydige teenwoordigheid van laktose/glukose of xilose/glukose wat die gene wat benodig word vir die benutting van laktose of xilose sal onderdruk.

7.4 Negatiewe en positiewe regulering van geenuitdrukking

Bakterieë verander die geenuitdrukking deur positiewe of negatiewe regulering te gebruik. Fundamentele verskil tussen positiewe en negatiewe regulering is wanneer die regulatoriese molekule dws onderdrukker alleen (lac operon) of onderdrukker saam met induseerder/eindproduk ('trp operon') bindend is aan die promotor en ook of die molekule toeneem (inducer) of daal (onderdrukker) die geenuitdrukking.

Prokariotiese geenuitdrukking word streng gereguleer op die vlak van transkripsie, translasie en ensiemfunksies. Aangesien transkripsie en translasie in prokariote gekoppel word, is die vlak van beheer in geenuitdrukking relatief hoër op transkripsievlak.


'n Operon vorm 'n genetiese skakelaar wat slegs in prokariote werk om 'n groep gene betrokke by metaboliese weë (degradatief en biosinteties) vir hul funksionaliteit te koördineer. Hierdie gene word saam getranskribeer onder die beheer van dieselfde promotor in 'n enkele polisistroniese mRNA wat uiteindelik in hul individuele polipeptiede vertaal word. Operon bestaan ​​uit drie basiese elemente: Die strukturele gene, die regulatoriese volgordes nl. promotor- en operateurstreke en die regulerende geen. Die bekendste voorbeeld van die operonstelsel is die 'lac operon' in E. coli wat nou wyd gebruik word as 'n model om die meganisme van laktosebenutting in bakterieë te verstaan.


'n Operon is 'n funksionele eenheid van geenuitdrukking in bakterieë. Dit verteenwoordig die unieke geenregulerende stelsel wat slegs in prokariote werk. Die 'lac operon' model is voorgestel deur Jacob en Monod in 1961 om gekoördineerde regulering van gene te beskryf wat ensieme kodeer wat nodig is vir die benutting van laktose in E. coli.

7.6.1 Elemente van 'lac operon'

Die 'lac operon' bestaan ​​uit die volgende sleutelelemente soos in Fig.7.1 getoon.

7.6.1.1 Drie strukturele gene

'Lac operon' bestaan ​​uit drie strukturele gene nl. lacZ-, lacY- en lacA-koderende ensieme/proteïene wat funksioneel verwant is om die metabolisme van laktose in E. coli teweeg te bring. Al hierdie drie gene is onder die beheer van 'n enkele promotor en is betrokke by die afbreek van laktose.

i) LacZ kodeer vir β-galaktosidase wat laktose in glukose en galaktose afbreek.

ii) LacY-kodes vir laktosepermease benodig vir die vervoer van laktose na E. coli-selle.

iii) LacA kodeer vir tiogalaktosied transasetilase waarvan die presiese funksie nog nie bekend is nie.


7.6.1.2 Regulerende volgordes

Die regulatoriese volgordes van die 'lac operon' sluit die volgende in.

i) LacO - die operateurstreek (O) waarby die 'lac'-onderdrukker bind om die promotor vir RNA-polimerasebinding te blokkeer, waardeur die 'lac-operon' afgeskakel word.

ii) LacP - die promotorstreek (P) waarby RNA-polimerase bind om die transkripsie van die strukturele gene na polisistroniese mRNA te inisieer.

iii) LacI - die regulerende geen wat kodeer vir die trans-werkende 'lac'-onderdrukkerproteïen wat by die operateurgebied bind om die transkripsie te blokkeer in die afwesigheid van laktose - die induseerder van lac-operon. Trouens, die werklike induseerder van die lac operon is die allo-laktose 'n isomeer van laktose.

iv) LacI is nie binne die lac operon geleë nie maar stroomop verskeie nukleotiede weg van die lac operon saam met sy eie promotor om die 'lac' onderdrukker te sintetiseer

Afgesien hiervan is daar 'n paar effektormolekules wat die binding van die onderdrukker of RNA-polimerase aan hul onderskeie plekke by die promotor-operateur-streke van die lac-operon aktiveer of deaktiveer. Die organisasie van die 'lac operon' en sy funksionering in die regulering van die strukturele gene wat benodig word vir laktosemetabolisme in E. coli word skematies hieronder geïllustreer.

Die lac-operon word verskillend gereguleer in die teenwoordigheid of afwesigheid van die induseerder, dit wil sê laktose (allolaktose) soos hieronder beskryf.

7.7.1 In afwesigheid van laktose

Wanneer laktose afwesig is van die groeimedium wat met E. coli ingeënt is, word lac-onderdrukker gesintetiseer deur lacI vanaf sy promotor uit te druk met behulp van RNA-polimerase in aktiewe vorm en in die medium gediffundeer om die operateurplek in die operon te bereik. Die binding van die onderdrukker by die operateur blokkeer die binding van RNA-polimerase by die promotor en dus word die strukturele gene afgeskakel en dus word die polisistroniese mRNA nie deur die operon gesintetiseer nie. Die regulering van 'lac operon' in afwesigheid van induseerder dws laktose word in Fig. 7.2 getoon.

7.7.2 In teenwoordigheid van laktose

Wanneer laktose in die groeimedium beskikbaar is, sal dit met die onderdrukker by sy induseerderbindingsplek bind en die konformasie van die onderdrukker verander wat nie meer met die operateurplek op die lac operon kan bind nie. Gevolglik is daar geen belemmering in die binding van die RNA-polimerase by die promotor nie en daarom word al die drie strukturele gene getranskribeer na 'n polisistroniese mRNA waaruit al die drie ensieme wat nodig is vir laktosemetabolisme onafhanklik vertaal word om hul spesifieke funksies te verrig. Die regulering van 'lac operon' in die teenwoordigheid van induseerder dws laktose word in Fig. 7.3 getoon.

Trouens, die werklike induseerder van lac operon is nie laktose nie, maar sy isomeer allolaktose wat uit laktose geproduseer word met behulp van β-galaktosidase. Die grootste beperking van laktose (Allolaktose) wat egter as die induseerder dien wanneer dit in die medium gevoeg word, is die konstante gebruik daarvan deur E. coli tydens groei en moet dus voortdurend aangevul word om die induksie van lac operon aan die gang te hou. Hierdie probleem is grootliks opgelos met die sintese van IPTG (Iso Propyl Thio Galactoside), 'n strukturele analoog van laktose - 'n gratis induseerder van die lac operon wat as 'n doeltreffende kunsmatige induseerder optree sonder om deur die bakterie gemetaboliseer te word en dus daar bly. onbepaald in die groeimedium. IPTG word wyd gebruik in die laboratorium in die indusering van die uitdrukking van heteroloë gene in E. coli vir grootskaalse produksie van hoëwaarde rekombinante proteïene.

7.7.3 Lac-operon is onder beide negatiewe en positiewe regulering

Lac operon is 'n klassieke voorbeeld van 'n operon wat onderhewig is aan beide negatiewe en positiewe regulering. Die negatiewe regulering soos reeds genoem word bemiddel deur die onderdrukkermolekule wat die operateur sal bind in die afwesigheid van die induseerder en dus die strukturele gene sal afskakel deur hul transkripsie te inhibeer. Die positiewe regulering van lac operon word veroorsaak deur 'n seinmolekule genaamd cAMP (Sikliese Adenosienmonofosfaat) wat die uitputting van glukosekonsentrasie in die medium waarneem (Wanneer E.coli-selle onder hongertoestande verkeer). Onder hoë glukosekonsentrasies in die medium, daal die vlak van cAMP in die sel en omgekeerd, by lae glukosekonsentrasies, verhoog die cAMP-vlak in die sel. cAMP aktiveer 'n ander proteïen genaamd CRP (cAMP Receptor Protein) ook aangewys as CAP (Catabolite Activator Protein) wat slegs by die CRP-plek in die lac-operon naby die lac-promotor sal bind wanneer dit met cAMP gekomplekseer is. Die binding van die aktiewe CRP sal die binding van RNA-polimerase by die promotor versterk en daardeur die uitdrukking van lac operon aansienlik verhoog. Die werking van positiewe regulering van 'lac operon' is in Fig. 7.4 gedemonstreer.

Verdere leeswerk

Fundamental Bacterial Genetics, Nancy Trun, Janine Trempy (Eds), Wiley-Blackwell, 2003, ISBN: 978-0-632-04448-1

Van gene tot genome: konsepte en toepassings van DNA-tegnologie, 3de uitgawe, Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz, Nicholas Plant (Eds), Wiley-Blackwell, 2011, ISBN: 978-0-470-68386-6

Mikrobiese Genetika, 2de uitgawe, Stanly R Maloy, John Cronan, David Freifelder, Narosa, ISBN: 8173196974

Molecular Biology of the Gene, Sesde Uitgawe, James D. Watson (Redakteur) Cold Spring Harbor Press en Benjamin Cummings, ISBN 978-080539592-1


Eksamen 2 Weefselbesering en gasheerverdediging

1) Groeikromme sal anders wees:
Lagfase -> eksponensieel -> stilstaan ​​-> WEER EKSPONENSIEEL (teenoor as net enkele koolstofbron gegee word, bv. glukose, sal na stilstaande die bakteriese groeikurwe daal bc die voedingstof raak op. Dit is normaal).
- Lagfase = tussen gebruik van glukose en "" van laktose, bc proteïene wat die laktose moet verteer, moet "transkribeer"/geskep word.
- PLATEAU in laktose omdat dit 'n geruime tyd neem vir die laktose om in te bring en induksie van ensieme

E.Coli gebruik eers Glukose, dan laktose (wanneer albei teenwoordig is):
1) Wanneer glukose teenwoordig is, word laktose vervoer na sel geïnhibeer!
ENSIEM II (vir glukose) is ONGEFOSFORILEER.
Lac Permease is NIE funksioneel nie
2) Wanneer glukose teenwoordig is, word transkripsie van " laktose metaboliserende ensieme" " onderdruk"!
Ensiem II (vir glukose) ongefosforileer.
GEEN Allolaktose (kan nie in sel geïnduseer word nie - "Inducer Exclusion"), dus bly "Lac repressor" op operateur en GEEN transkripsie van laktosemetaboliserende ensieme nie. [normaalweg, wanneer laktose teenwoordig is, sal allolaktose aan Repressor (Lac I geen) bind/dit verplaas, sodat RNA kan kom waar dit was en transkripsie van laktose metaboliserende gene kan doen].
3) Wanneer glukose teenwoordig is, is Positiewe Regulering (aktivering van transkripsie) deur CAP van "lac operon" GEINAKTIVEER! (inaktivering van positiewe reguleerder)!
Ensiem II (vir glukose) ongefosforileer.
kan nie interaksie hê en adenilaatsiklase aktiveer nie -> geen sikliese-AMP produksie -> geen CAP-cAMP kompleks = CAP proteïen NIE AKTIEF nie en KAN NIE (positiewe reguleerders bind stroomop van promotor aan baie gene/plekke) aan die DNA om die lac operon transkripsie te aktiveer . [let wel: CAP moet met sikliese versterker wees om aan die DNA te bind, kan dit nie alleen doen nie en cAMP word gemaak van ATP (weet dit) via adenielaat siklase ensiem wat in membraan gevind word].

2) Lac Permease = onaktief [INDUSEERUITSLUITING] (albei teenwoordig), aktief (slegs laktose).

3) Lac Repressor = Aktief [NEGATIEWE REGULASIE] (albei teenwoordig) Onaktief (slegs laktose).

4) Adenilate Cyclase, cAMP Produksie = Onaktief/laag (albei teenwoordig) aktief/hoog (slegs laktose)

5) CAP-cAMP kompleks = Onaktief (albei teenwoordig) aktief [POSITIEWE REGULASIE] (slegs laktose)

6) Lac Operon Uitdrukking = Af (albei teenwoordig) Aan (slegs laktose).

1. Aktiewe Lac Repressor <--allolaktose--> onaktief "".
2. Aktiewe CAP-aktiveerder <----cAMP---> onaktief.
3. Aktiewe CcpA-onderdrukker <---Fruktose-1,6-BP----> onaktief.

1) Aërobiese groei, e-ontvanger = suurstof =
sitochroomoksidase produseer H2O

2) Anaërobiese groei, organiese e-akseptor = fumaraat of nitraat = fumaraat reduktase produseer suksinaat, nitraat reduktase produseer ammoniak.

FNR = is die sleutelreguleerder van asemhaling. Funksioneer anaërobies as beide aktiveerder en onderdrukker

P
D. Adenilaatsiklase-aktiwiteit word deur oksidasie gereguleer
E. Al die bogenoemde

Fagosiet = gedefinieer deur sy funksie aka
deeltjies inneem [Rits-agtige mode] = struktuur het 'n klomp reseptore op die oppervlak daarvan, en dit het interne organelle.

Makrofage:
- Lank gelewe
- Aanwesig in weefsels (wanneer volwasse is)
- O2-afhanklike doodmaak nie kragtig nie
- Toestande vatbaar vir
intrasellulêre groei van patogene
- Patogeen taktiek in geveg =
a) Omseil respiratoriese uitbarsting
b) Breek uit fagosoom
c) Voorkom fagolisosoomsamesmelting
d) Weerstaan ​​korrelinhoud

Reseptortipes betrokke by fagositose:
1) FAGOSITIESE RESEPTORS definieer wat fagosietsel is
1a) " KOMPLEMENT RESEPTORS" wat serum KOMPLEMENT KOMPONENT positiewe proteïene op die oppervlak van patogene herken.
- 3 ROLLE VIR KOMPLANTE KOMPONENTE = Bakterielise, Fagosiet Chemotaxis, Bakterie Opsonisering [belangrik vir hierdie klas]
1b) Fc-reseptore - op fagosiete, bind konstante area van teenliggaampies.
1c) Lektiene = direkte herkenning van spesifieke koolhidrate. 'n spesifieke reseptor. ADV: verworwe immuniteit en aktivering van komplementkaskade word nie vereis nie, maar .. DISADV: Gogga moet korrekte koolhidrate op die oppervlak hê. DECTINS is die hoofklas fagosiet-lektiene, is betrokke by die herkenning van swampatogene. Het dubbele gebruik: betrokke by aangebore, immuun sein ook.

2) ADHESIE ONTVANGERS: mobiliseer in weefsel wanneer beweeg van sirkulasie na inflammasie plek of beweeg ook.

3) AKTIVERING RESEPTORS: verander die aard van die fagositiese sel (maak hulle meer in staat om mikroörganismes dood te maak = Tolagtige reseptore, Il-1 reseptor, TNF reseptor, iFN gamma reseptor =
3a) Vroeë-"M1-makrofage" = "KLASSIESE AKTIVERING (rooi) = (1) inflammasie, (2) bakteriële en virussiektes. [KLASSIEKE AKTIVERING -> TANDHEELKUNDIGE PROFESSIONELE].
- Eienskappe van klassiek geaktiveerde fagosiet (ken dit):
1. Verhoogde tempo van fagositose
2. Verbeterde produksie van giftige reaktiewe suurstof
tussenprodukte (antimikrobies)
3. Verbeterde produksie van NO (stikstofoksied
antimikrobiese)
4. Verbeterde fagosoom-lisosoom samesmelting.
5. Verhoogde aantal MHC klas II molekules
6. Sekresie van IL-12: differensiasie van CD4 T-selle.
3b) Later - "M2 Makrofage" = "ALTERNATIEWE AKTIVERING (rooi)" = (1) Nie-inflammatories, (2) verwyder weefselskade, (3) Dikwels minder beperkend vir patogene.

Wat lei tot ("oorsake") opsonisering? OF:

(1) Alternatiewe Weg laat toe dat patogene (oppervlak) herken word in afwesigheid van teenliggaampies => komplementaktivering => werwing van inflammatoriese selle + opsonisering van patogene + doodmaak van patogene.
- Die Alternatiewe Pad begin opsonisering deur C3-fragment op patogeenoppervlak te splyt en neer te sit: opsonien -> C3b-opsonisering word deur 'n ensiem versterk.

(2) Opsonisering deur komplementkomponent: Komplementkomponente (herken deur komplementreseptore, 'n tipe fagositiese reseptor) het drie rolle = (a) Bakterielise, (b) Fagosietchemotaksis, (c) Bakterieopsonisering.
- VOORDELE VAN KOMPLEMENT = Benodig nie teenliggaampies nie & Kan groot verskeidenheid patogene herken.

2) Selfmoord deur NADPH-oksidase stel antimikrobiese "NETS" vry - DNA-histonkomplekse wat mikroörganisme doodmaak (valletjies binne) - "histone wat met NETS geassosieer word, is antimikrobies"

3) Suurstof-afhanklike meganismes vind plaas VOOR die verswelging (sien ander fc)

2) Inhibeer opsonisering of deaktiveer fagositose
1. Kapsule: S. pneumoniae
2. M proteïen: S. pyogenes
3. Ontwrig sein: RhoGAP-proteïene
" Bv. Fagosiet kan nie Streptococcus inneem nie
pnuemoniae wat 'n kapsule dra"

Waarvoor is skade goed?(Waarom veroorsaak patogene siektes?) =
1. Skep nuwe kolonisasiewebwerwe,
2. Fasiliteer verspreiding in gasheer of persoon-tot-persoon
3. Genereer voedingstowwe
4. Stel gasheerverdediging teë.
[bv.: Streptococcus pneumoniae skei ensieme af om die nasofarinks-epiteelversperring binne te dring. Skei ook faktore af wat fagositose (bv. pneumolisien) en teenliggaamfunksie inhibeer. Streptococcus pneumoniae = Normale bestanddeel van die nasofarinks, Siekte wat veroorsaak word deur verspreiding na distale plekke. bv. Strep pneumonae meningitis - geïnduseerde breininfarksie (van nasofarynks tot brein)]

- PATOGENE VEROORSAAK SKADE AAN HUL LEERHOUERS OM GROEI TE BEVORDERING (VERMY IMMUUNSISTEEM, SKEP NUWE KOLONISASIE-WERWE, GENEREER VOEDINGSVOEDINGE, VERSTREDING FASILITEER).

- PATOGENE VEROORSAAK OF DIREK (BV. GIFTIGINGS) OF INDIREK DEUR DIE GASTER OM SKADE TE VEROORSIG (BV. INFLAMMASIE, OUTO-IMMUNITEIT)

Endotoksien: lipied-suiker komponent van Gram-negatiewe bakterieë sel omhulsel wat baie immunostimulerend kan wees

Eksotoksien: 'n toksien wat in die ekstrasellulêre milieu afgeskei word (teenoor sekresiestelsel-geïnspuitte toksien)
bv. AB-toksiene, afbrekende ensieme

Enterotoksien: toksien wat in die SVK optree
bv. cholera toksien

Neurotoksien: toksien wat in die neurale sisteem optree
bv. tetanus en botulinumtoksien

Molekulêre nabootsing: antigene ooreenkoms tussen antigene gemaak deur patogene en gasheer (self-) antigene. Teenliggaampies of T-selle wat geïnduseer word om die patogeen-spesifieke antigeen te herken kruisreageer met self-antigeen (outo-immuniteit).

DRIE SOORTE GIFTIGHEDE:
(1) membraanaktief (ekstrasellulêr) = SUPERANTIGENS porievormende toksiene.
(1a) dié wat met selsein inmeng:
SUPERANTIGENS =: TCR (T SEL) SIGNALERING. & CHOLERA TOXIN = kampsein.
(1b) KLOSTRIDIAL NEUROTOKSIENE =
TETANUS GIFTIG (inhibeer sellulêre handel)
BOTULINUM TOKSIEN

= MEMBRAAN-AKTIEWE GIFTIGHEDE (TSST-1) afgeskei deur subset van S. aureus WERK EKSTRASELLULêr op wat GIFTIGE SKOKSINDROOM veroorsaak.

Superantigene veroorsaak NIE-SPESIFIEKE (antigeen-onafhanklike) T-SELAKTIVERING (2-20%) = massiewe proliferasie
OORTUIGENDE INFLAMMASIE veroorsaak orgaanversaking (toksiese skok)

= Intrasellulêre teikens (binne selle)
Probleem: hoe kry hierdie gifstowwe toegang tot hierdie teikens?
HOE A-B-GIFTIGINGS DIE PROBLEEM OPLOS OM OOR GASTERMEMBRANE TE KOM:
1. A-B GIFTIGHEID WAT DEUR BAKTERIEë GESKEI WORD: A-SUBEENHEID AKTIWITEIT (ENSIMATIESE DOMEIN).
2. B-ONDEREENHEID: BINDING AAN SELRESEPTOR(S)
3. ENDOSITOSE VAN GIFTIGHEID
4. TRANSLOKASIE EN VRYSTELLING VAN A-SUBEENHEID.

1. B subeenheid: bind gangliosiede & bloedgroep antigene = B SUBEENHEID: BIND DERMS EPITELIESE SELLE.
2. 'n Subeenheid: ADP RIBOSYLTRANSFERASE aktiwiteit substraat = adenilaat siklase = 'N SUBEENHEID : ADP RIBOSYLTRANSFERASE AKTIWITEIT ONDERWORS VERVOERFUNKSIE WAT LEI TOT MASSIEWE AFSKEILING VAN VLOEISTOF IN DERMLUMEN.
3. Verhoogde sikliese-AMP (cAMP) vlakke
a) Massiewe uitvloei van Cl-ione in lumen
b) Na+ en Cl- absorpsie geïnhibeer

Botulinum Neurotoksien (BoNT) - wat is dit?

TETANUS- EN BOTULINUM-GIFTIGHEDE HET SOORTGELYKE _______, MAAR ___________ VERSKIL.

Neem Huis toe op Clostridiale Neurotoksiene = BOTULINUM EN TETANUS TOKSINE
- "A SUBUNIT" = KLEEF MEMBRAANFUSIEKOMPONENTE IN NEURONE EN VOORKOM DUS NEUROTRANSMISSIE.
-"B SUBEENHEID" = BAIE SOORTGELYK

BINDINGSSPESIFIKHEID (NEURONE) VIR ALBEI TIPPE GIFTIGHEID.
- VERSKIL: B&T-GIFTIGINGS HET "OPPOSITE EFFEKTE" [B = FLACCID PARALYSIS T = SPASTIC PARALYSIS] BC WET BY DIF. WERWE (PLAASLIK VERSUS SENTRALE SENTRALE SISTEEM).- TETANUS GIFTIG (inhibeer sellulêre handel)
BOTULINUM TOKSIEN

BOTULINUM NEUROTOKSIEN (BoNT) = SPIIER ONTSPANNENDE BOTULUS = WORS nota: asoc. w Botox = tx vir 'n tmd, tmj + migrane.

CD4+ T-selle = druk op membraan 'n molekule genaamd CD4 = HERKEN SLEGS vreemde peptiede aangebied deur MHC Klas 2 UITGEDRUK OP APC [CD4 bind aan MHC klas 2 (uitgedruk op APC)]
- werking: MHC klas 2 plus peptied uitgedruk op APC (dendritiese selle, makrofage en B-selle - let wel: dit druk ook MHC klas 1 uit. ) interaksie met CD4+ T-selle => SITOKIENSINTESE.
- weet wat aanleiding gee tot sitokiensintese.

CD8+ T-selle = het CD8 op hul membraan = herken slegs vreemde peptiede wat aangebied word deur MHC Klas 1 UITGEDRUK OP op ALLE kernselle. [CD8 bind MHC klas 1 (uitgedruk op alle kernselle].
- aksie: MHC Klas 1 plus peptied uitgedruk op enige kernsel, tree in wisselwerking met CD8+T sel => lei tot DOODGING van HOST sel.

MHC KLAS 2 = APC'S (DENDRITIESE SELLE, MAKROFAGE, B-SELLE) = HLA-DP, DQ, DR (3 van ma, 3 van pa) is die Menslike Klas 2 = verwerking van EKSOogene antigeen (buite die sel, wat ronddryf) = = het 'n PEPTIDE BINDENDE GROEF (kan peptied en mhc almal saam bind).

IMP - APC'S IS KERNGEVOERDE SELLE -> HET BEIDE MHC1 EN MHC2 (BEIDE MENSLIKE KLASSE OOK!).

1) Dendritiese selle (DC)
2) Makrofage (M0)
3) B-selle

2. INC. in die GROOTTE van 'n orgaan of weefsel veroorsaak deur 'n INC. in die AANTAL selle (Kom slegs voor in selle wat kan verdeel, bv. tandvleis- Neurone en hartspier kan nie verdeel nie)

3. DES. in die GROOTTE van 'n orgaan of weefsel wat voortspruit uit 'n AFNEEMING in die MASSA van voorafbestaande selle. (Resultate van: Ongebruik, Voedings- of suurstofdeprivasie, Verminderde endokriene stimulasie, Veroudering, Denervasie) - Kan veralgemeen of gelokaliseer word, patologies of fisiologies (algemeen tydens ontwikkeling) As gevolg van verminderde proteïensintese en verhoogde proteïenafbraak (Ubiquitin-weg verantwoordelik)

4. Fisiologiese DES. in die AANTAL selle na hul normale AANTAL, bv. Timusklier involuteer tydens adolessensie (kinderjare-> volwasse verskil), bv. Myometrium betrek tydens post partum. = Vorm van atrofie, Behels apoptose van selle.

5. Lipofuscin (Lipochrome) = SLYTAGE-PIGMENT (ophoop gewoonlik by bejaarde pasiënte, word meestal gevind met hepatosiete, miokardiale selle en brein), BRUIN ATROFIE (ophoping van lipofuscin en atrofie van ogans. geel tot ligbruin, vetoplosbare pigment mengsel van lipiede/fosfolipiede en proteïen teken van vrye radikale besering - bv. GEBOORDE SPIER EN LEWER.

6. Bilirubien = Kataboliese produk van die heem-deel van hemoglobien en mioglobien.
- patologiese toestand (Jauntice) = ophoping in bloed, sklera, mukosa, organe. Geel verkleuring. Bv. Hemolitiese Geelsug (vernietiging van RBC's), Obstruktiewe Geelsug (intra/ekstrahepatiese vernietiging van galweë), Hepatosellulêre Geelsug (parenchimale lewerskade).

LET WEL: Metastatiese verkalkings vind plaas in normale weefsels.

1. KONGESIE - VERHOOG BLOEDVLOEI BINNE VAATJES VAATJES VERWYD EN VERPAK MET ROOI BLOEDSELLE (ERITROSIETE).

2. OEDEM - VERHOOG INTERSTISIËLE VLOEISTOF MET VERGROTE SPASIE TUSSEN INTERSTISIËLE KOMPONENTE VEROORSAAK SWELLING BEHALWE IN BEEN

3. BLOEDING - AKKUMULERING VAN BLOED BUITE VAATJES UITDRUKKING VAN ROOI BLOEDSELLE IN WEEFSELS OF UITSTEKENDE OPPERVLAKTE

4. TROMBOSE - KLOON BINNE 'N BLOEDVAAT WAT TYDENS DIE LEWE GEvorm word.

5. EMBOLUS - LOSSTAANDE INTRAVASKULÊRE VASTE STOF-, VLOEISTOF- OF GASVORMIGE MASSA WAT IN BLOED GEVOER NA PLAATS VER AF VAN PUNT VAN OORSPRONG - EX. VET, BUBBEL LUG OF N₂, ATEROSCLEROTIESE PLAAK, TUMOR, BEENMURG, BUITELANDSE LIGGAME, TROMBUS.

- Veroorsaak selbesering deur (vrye radikale besering):
-- Lipiedperoksidasie van membrane- uitgebreide membraanskade.
- Verander proteïene - veroorsaak verkeerde vou en afbreek
-- Skade aan DNS - veroorsaak enkel- en dubbelstrengbreuke -> lei tot sellulêre veroudering -> kwaadaardige transformasie

D - DNA-afbraak deur endonukleases - nukleosomale chromatienfragmente -
DNA-leer voorkoms
Aktivering van transglutaminases (kruis-skakel apoptotiese sitoplasmiese proteïene)
Geen inflammatoriese reaksie apoptotiese liggame

GEMERKTE INFLAMMATIESE REAKSIE:
- LYSOSOMALE ENSIEME - VERTEER SELMEMBRANE, ONTSTEL SELLE
- MAKROFAGE NA VRYSTELLING VAN CHEMOTAKTIESE FAKTORE
- VERWYDERING VAN PULS DEUR FAGOSITIESE MAKROFAGE

Algemene en sellulêre kenmerke:
1. HETEROLISE - Sellulêre afbraak deur ensieme EKTRINSIEK tot sel (bv. bakterieë, leukosiete) - verhoogde pienk sitoplasma
2. Kernveranderinge - ligmikroskopie
Progressiewe kernkondensasie met uiteindelike verdwyning van kleurbare kerne. ken hierdie kernveranderinge sien foto.
2a. PYKNOSIS - "KRINKING" VAN KERN IN KLEIN, DIEP BASOFIELIESE/SWART KLOMPIES CHROMATIEN
2b. KARYORRHEXIS - "FRAGMENTASIE" KERN IN MEERVOUDIGE KLEIN SWART KOPPIES/STUKKE
2c. KARIOLISE - "FADING" VAN KERN MINDER EN MINDER BASOFIEL TOT VERDWYN.

TIPES:
1) KOAGULATIEWE NEKROSIS [[bv. akute miokardiale infarksie chemiese brandwonde (aspirien)]
= MEES ALGEMENE TIPE = SKIELIKE VERLIES VAN BLOEDVOORSIENING AAN ORGAAN (ISCHEMIE): HART EN NIER (ARTERIES MET BEPERKTE KOLATERALE SIRKULASIE), ADRENALE KLIERE, NIE GESIEN IN DIE BREIN = DENATURASIE VAN PROTEÏENE = VROEË SOEKERVESIE = VROEË SOEKERVASIE. w. ALGEMENE ARGITEKTUUR GOED GEBEWAAR, Progressiewe kernkondensasie met uiteindelike verdwyning van vlekbare kerne
Verhoogde pienk sitoplasma ('eosinofiele' 'glasagtige') "Spookagtige" strukture.
2) VLOEISTOFAKTIEWE NEKROSIS = VERTERING VAN WEEFSEL BRUTO = VLOEISTOFHISTOLOGIE: VERSAGTING EN VERvloeiing van WEEFSEL GEWOONLIK ISCHEMIESE BESERING AAN DIE SSS GEWOONLIK BAKTERIESE INFEKSIE OOK SUPPURATIEWE INFEKSIE WMMLA (INFEKSIE)
Vloeibare weefselpuin en intense inflammatoriese reaksie van neutrofiele = abses (fokusversameling van neutrofiele).

3) GEVALLE NEKROSE = MEES DIKWELS SIEN IN TUBERKULOSE
= KAASLIKE KONSISTENSIE = HISTOLOGIE: ARGITEKTUUR NIE GEBEWAARDEERD AMORFE PIENK NIE, KORRELIKE PAAR KERNE (GEEN SPOOKLIKE VOORKOMS NIE) = KOMBINEER KENMERKE VAN KOAGULATIEWE EN VLOEISTOFAKTIEWE NEKROSIS VAN KOAGULATIEWE EN VLOEIBLIKE NEKROSIS = OKKULASIE LIMFOSIETE, & MEERVOUDIGE KERN-REUSESELLE. bv. by long - foto.

4) GANGRENEE NECROSIS = UITGEBREIDE = ONDERBREKING VAN BLOEDVOORSIENING AAN ONDERSTE UITLEGGINGS OF DARM (SEKUNDÊR TOT VASKULÊRE OKKLUSIE) = MEEST Dikwels BAKTERIESE INFEKSIES = OF: (A) "WET OF GANGRENEQUERISF, " GANGERENEQUERISF, " GAANGERENEQUEISF. W. KOAGULATIEWE NEKROSE SONDER VLOEISTIKERING. (WEET VERSKIL TUSSEN NAT EN DROOG!) - bv. foto van NOMA.

5) FIBRINOID NEKROSIS = SLEGS GESIEN DEUR MIKROSKOPIESE ONDERSOEK = Dikwels GEassosieer met IMMUUN-GEDIDEERDE VASKULITIS = BINDWEEFSEL EN SPIERE VERVANG DEUR HOMOGENE PIENS MATERIAAL OORSOEK EXFIBRINE. AFSLAG VAN FIBRIENLIKE MATERIAAL IN DIE ARTERIELE WANDE


Kyk die video: Lac Operon (Oktober 2022).