Inligting

Is dit moontlik om die binding en katalise van 'n ensiem in twee stappe te skei?

Is dit moontlik om die binding en katalise van 'n ensiem in twee stappe te skei?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Is dit moontlik om die volgende te doen:

  1. Ensiem E bind aan sy substraat S sonder katalise;
  2. Voeg 'n beheerbare stimulus by, soos lig, byvoeging of verwydering van chemikalieë;
  3. Die ensiematiese reaksie word deur die stimulus veroorsaak.

Die woord beheerbaar beteken dat ek die stimulus kan byvoeg wanneer ek wil. Voordat ek die stimulus byvoeg, bly die ensiem spesifiek aan die substraat bind, maar geen reaksie vind plaas nie.

Dit is wat ek bedoel met binding en katalise in twee stappe te skei.

In die geval van allosteriese regulering, sal sommige chemikalieë die aktiwiteit van 'n ensiem inhibeer. Byvoorbeeld, ATP sal die aktiwiteit van fosfofruktokinase 1 (PFK1) inhibeer. Maar ek is nie seker of hierdie allosteriese inhibisie ook PFK1 se binding aan die substraat belemmer nie, wat nie aan my beskrywing hierbo voldoen nie.


4.1: Basiese Beginsels van Katalise

  • Bygedra deur Kevin Ahern, Indira Rajagopal en Taralyn Tan
  • Professor (Biochemie en Biofisika) aan die Oregon State University

'n Drukbare weergawe van hierdie afdeling is hier: BiochemFFA_4_1.pdf. Die hele handboek is gratis beskikbaar by die skrywers by http://biochem.science.oregonstate.edu/content/biochemistry-free-and-easy

As daar 'n magiese komponent in die lewe is, kan daar sekerlik 'n argument gemaak word dat dit katalise is. Danksy katalise vind reaksies wat honderde jare kan neem om te voltooi in die ongekataliseerde en werklike wêreld, binne sekondes in die teenwoordigheid van 'n katalisator plaas. Chemiese katalisators, soos platinum, kan reaksies versnel, maar ensieme (wat bloot super-katalisators is met 'n &ldquotwist,&rdquo soos ons sal sien) maak chemiese katalisators in die skande (Figuur 4.1). Om ensiematiese katalise te verstaan, is dit eers nodig om energie te verstaan. Chemiese reaksies volg die universele neiging om na laer energie te beweeg, maar hulle het dikwels 'n versperring in plek wat oorkom moet word. Die geheim van katalitiese aksie is om die omvang van daardie versperring te verminder.

Figuur 4.1 - Tempoverbetering vir verskeie ensieme Beeld deur Aleia Kim

Voordat ensieme bespreek word, is dit gepas om 'n belangrike konsep met betrekking tot chemiese/biochemiese reaksies te onderbreek en te bespreek. Daardie konsep is ewewig en dit word baie dikwels verkeerd verstaan. Die &ldquoequi" deel van die woord hou verband met gelyke, soos mens sou verwag, maar dit hou nie verband met absolute konsentrasies nie. Wat gebeur wanneer 'n biochemiese reaksie in ewewig is, is dat die konsentrasies van reaktante en produkte nie oor tyd verander nie. Dit beteken nie dat die reaksies opgehou het nie. Onthou dat reaksies omkeerbaar is, so daar is 'n voorwaartse reaksie en 'n terugwaartse reaksie: as jy 8 molekules van A gehad het, en 4 van B aan die begin, en 2 molekules van A na B omgeskakel is, terwyl 2 molekules van B gelyktydig was teruggeskakel na A, bly die aantal molekules van A en B onveranderd, dit wil sê die reaksie is in ewewig. Jy sal egter agterkom dat dit nie beteken dat daar gelyke getalle A- en B-molekules is nie.


Wat is katalisators?

Katalisators het geen effek op die ewewigskonstante en dus op die ewewigsamestelling nie. Katalisators is stowwe wat 'n reaksie versnel, maar wat nie daardeur verbruik word nie en nie in die netto reaksievergelyking voorkom nie. Ook &mdash en dit is baie belangrik &mdash katalisators beïnvloed die voorwaartse en terugwaartse koerse ewe veel dit beteken dat katalisators geen effek op die ewewigskonstante en dus op die samestelling van die ewewigstoestand het nie. Dus kan 'n katalisator (in hierdie geval, swaelsuur) gebruik word om 'n omkeerbare reaksie soos estervorming of die omgekeerde, esterhidrolise daarvan te bespoedig:

Figuur (PageIndex<1>): 'n Suurgekataliseerde reaksies

Die katalisator het geen effek op die ewewigskonstante of die rigting van die reaksie nie. Die rigting kan beheer word deur water by te voeg of te verwyder (Le Chatelier-beginsel).

Katalisators funksioneer deur toe te laat dat die reaksie plaasvind deur 'n alternatiewe meganisme wat 'n kleiner aktiveringsenergie vereis. Hierdie verandering word teweeggebring deur 'n spesifieke interaksie tussen die katalisator en die reaksiekomponente. Jy sal onthou dat die tempokonstante van 'n reaksie 'n eksponensiële funksie van die aktiveringsenergie is, so selfs 'n beskeie vermindering van (E_a) kan 'n indrukwekkende toename in die tempo lewer.

Katalisators verskaf alternatiewe reaksieweë

Katalisators word konvensioneel in twee kategorieë verdeel: homogeen en heterogeen. Ensieme, natuurlike biologiese katalisators, word dikwels by eersgenoemde groep ingesluit, maar omdat hulle 'n paar eienskappe van albei deel, maar 'n paar baie spesiale eienskappe van hul eie vertoon, sal ons hulle hier as 'n derde kategorie behandel.


Hoogtepunte

Sitochrome P450 is alomteenwoordige ensieme wat 'n geweldige aantal substrate aanvaar en 'n wye reeks reaksies kataliseer met potensiële toepassings in biotegnologie en sintetiese biologie.

P450's is ontwerp om abiotiese reaksies soos karbeen- of nitreenoordragte te kataliseer, wat heeltemal nuwe perspektiewe in sintetiese chemie oopmaak.

Die afgelope tyd is P450's suksesvol in kunsmatige multi-ensiem-kaskenades bekendgestel, beide in vitro en in vivo, die verskaffing van alternatiewe roetes vir retro-sintetiese produksie van hoëwaarde oksifunksionaliseerde verbindings.

Die benutting van die sintetiese potensiaal van P450's in chemo-ensiematiese prosesse of as deel van hersaamgestelde biosintetiese weë in mikrobiese gashere bied belowende strategieë vir De novo sintese van sintone en komplekse natuurlike produkte, al is daar nog 'n paar struikelblokke om te oorkom.

Sitochrome P450 (P450 of CYP) is heem-bevattende ensieme wat die invoering van een atoom molekulêre suurstof in nie-geaktiveerde C-H-bindings kataliseer, dikwels op 'n regio- en stereoselektiewe wyse. Hierdie vermoë, gekombineer met 'n geweldige aantal aanvaarde substrate, maak P450s kragtige biokatalisators. Sestig jaar na hul ontdekking word P450-stelsels erken as noodsaaklike bio-stene in sintetiese biologie-benaderings om die produksie van hoëwaarde komplekse molekules in rekombinante gashere moontlik te maak. Onlangse indrukwekkende resultate in proteïen-ingenieurswese het gelei tot P450's met pasgemaakte eienskappe wat selfs in staat is om abiotiese reaksies te kataliseer. Die bekendstelling van P450's in kunsmatige multi-ensiematiese kaskadesreaksies en chemo-ensiematiese prosesse bied opwindende toekomsperspektiewe om toegang tot nuwe verbindings te verkry wat nie deur die natuur of deur chemiese roetes gesintetiseer kan word nie.


Struktuur en funksie van ensieme

Wat is ensieme en wat doen hulle in ons liggame? Ensieme is basies proteïene wat deur lewende organismes geproduseer word om sekere metaboliese en biochemiese reaksies in die liggaam teweeg te bring. Hulle is biologiese katalisators wat reaksies binne die liggaam versnel.

Wat is die struktuur van 'n ensiem?

Ensieme, soos hierbo genoem, is biologiese katalisators. Terwyl hulle 'n proses verhaas of bespoedig, bied hulle eintlik 'n alternatiewe pad vir die proses. Maar, in die proses, die struktuur of samestelling van die ensieme onveranderd bly.

Ensieme bestaan ​​eintlik uit duisende aminosure wat op 'n spesifieke manier gekoppel is om verskillende ensieme te vorm. Die ensiemkettings vou om om unieke vorms te vorm en dit is hierdie vorms wat die ensiem van sy kenmerkende chemiese potensiaal voorsien. Die meeste ensieme bevat ook 'n nie-proteïen komponent bekend as die ko-faktor.

'n Ensiem se funksie is intrinsiek gekoppel aan sy driedimensionele struktuur, wat bepaal hoe dit substraatbinding, katalise en regulering verrig. X-straalkristallografie was die belangrikste tegniek in die ontwikkeling van ons begrip van ensiemstruktuur en -funksie. Kernmagnetiese resonansie (KMR) is ook suksesvol gebruik om baie strukture te bestudeer, maar kristallografie bly die hooftegniek vir struktuuropheldering. Die eerste ensiem wat gekristalliseer is en die struktuur daarvan suksesvol opgelos is, was hoendereierlisosiem in 1965. Belangrik, sowel as die struktuur van die vrye ensiem, was dit moontlik om lisosiem te kristalliseer met 'n substraatanaloog wat in die aktiewe plek gebind is. Hierdie struktuur het die voorstel van 'n chemiese meganisme vir die ensiem moontlik gemaak, gebaseer op die posisionering van groepe rondom die plek van substraatsplyting. Die gebruik van kristalstrukture met gebonde substraat- en oorgangstoestandanaloë het sedertdien gehelp om die katalitiese meganismes van ontelbare ensieme te openbaar.

Domeine

Groter proteïene is geneig om in 'n reeks kleiner domeine te vou, wat elkeen 'n selfstandige strukturele eenheid vorm. Hierdie domeine word dikwels beskryf as die eenhede van evolusie omdat hulle dikwels tussen proteïene omgeruil kan word sonder om die vou van ander dele van die proteïen te versteur en dus kan nuwe funksies geskep word deur nuwe kombinasies van domeine binne 'n enkele proteïen. In ensieme word sekere funksies dikwels binne 'n domein vervat. Byvoorbeeld, die nukleotiedbindende Rossmann-domein word gekombineer met 'n diverse reeks afsonderlike katalitiese domeine, wat elke ensiem toelaat om soortgelyke nukleotiedkofaktore soos nikotinamied-adenien-dinukleotied (NADH), nikotinamied-adenien-dinukleotiedfosfaat (NADPH) en flavienmono-nukleotied te bind. (FMN), maar voer heel ander chemie uit. Figuur 1.9 toon twee verskillende Rossmann-domeinbevattende ensieme: gliseraldehied-3-fosfaatdehidrogenase (GAPDH) en 1-deoksie-d-xilulose-5-fosfaatreduktoisomerase (DXR). Albei ensieme bevat die Rossmann-domein met 'n gemeenskaplike 3-parallelle string β-vel omring deur α-helikse. Hierdie blad bind aan die kofaktor NAD in die geval van GAPDH en NADP in die geval van DXR. Die res van die ensiemstruktuur en -funksie is heeltemal onverwant en bevat heel verskillende katalitiese residue wat hulle in staat stel om hul verskillende reaksies te kataliseer.

Aktiewe werwe en klowe

Alhoewel ensieme dikwels groot molekules is wat baie honderde aminosure bevat, is die funksionele streke van 'n ensiem oor die algemeen beperk tot splete op die oppervlak wat slegs 'n klein deel van die ensiem se totale volume uitmaak. Die belangrikste van hierdie streke is die aktiewe plek – die sak of spleet waarin die ensiem die substraat bind en waarin die katalitiese chemie van die ensiem uitgevoer word. Ontleding van ensiemstruktuur en -funksie het getoon dat aktiewe plekke geneig is om gevorm te word vanaf die grootste spleet op die oppervlak van die proteïen.

Fosfofruktokinase kataliseer die fosforilering van Dfruktose 6-fosfaat, wat ATP in die proses omskakel na ADP. Dit word gereguleer deur binding van ATP aan 'n allosteriese plek, heeltemal anders as die aktiewe plek, wat die ensiem inhibeer. Hierdie regulatoriese splete sowel as om regulatoriese molekules te bind, vereis ook die vermoë om bindingsinligting van hulself na die aktiewe plek oor te dra, sodat katalitiese aktiwiteit gereguleer kan word.

Hoe werk ensieme?

Vir enige reaksie om in die heelal plaas te vind, is daar 'n energievereiste. In gevalle waar daar geen aktiveringsenergie verskaf word nie, speel 'n katalisator 'n belangrike rol om die aktiveringsenergie te verminder en die reaksie voort te voer. Dit werk ook in diere en plante. Ensieme help om die aktiveringsenergie van die komplekse molekules in die reaksie te verminder. Die volgende stappe vereenvoudig hoe 'n ensiem werk om 'n reaksie te versnel:

Stap 1: Elke ensiem het 'n 'aktiewe plek' waarby een van die substraatmolekules kan bind. Dus word 'n ensiem-substraat kompleks gevorm.

Stap 2: Hierdie ensiem-substraat molekule reageer nou met die tweede substraat om die produk te vorm en die ensiem word as die tweede produk vrygestel.

Daar is baie teorieë wat verduidelik hoe ensieme werk. Maar daar is twee belangrike teorieë wat ons hier sal bespreek.

Teorie 1: Slot- en Sleutelhipotese

Dit is die mees aanvaarde van die teorieë van ensiemwerking.

Hierdie teorie stel dat die substraat presies in die aktiewe plek van die ensiem pas om 'n ensiem-substraat kompleks te vorm. Hierdie model beskryf ook hoekom ensieme so spesifiek in hul werking is omdat hulle spesifiek vir die substraatmolekules is.

Teorie 2: Geïnduseerde Pashipotese

Dit is soortgelyk aan die slot-en-sleutelhipotese. Dit sê dat die vorm van die ensiemmolekule verander soos dit nader aan die substraatmolekule kom op so 'n manier dat die substraatmolekule presies in die aktiewe plek van die ensiem pas.


Struktuur van Archaeal en Eukaryal RPRs

Alhoewel geen hoë-resolusie strukture vir argaeale en eukaryale RPR's beskikbaar is nie, het identifikasie van ten minste 50 rye van elke domein flilogenetiese volgorde-analise moontlik gemaak wat op sy beurt verfyning van sekondêre struktuurmodelle moontlik gemaak het (Harris et al. 2001 Li en Altman 2004a Marquez et al. al. 2005). Ten spyte van die merkbare vermindering in grootte van die argaeale en eukaryale RPRs (ten minste 10&ndash20% kleiner as tipiese bakteriese RPRs), word ten minste 13 nukleotiede universeel in identiteit en moontlik in ruimtelike ligging bewaar. Wat verskille betref, ontbreek die argaeale en eukaryale RPR's duidelik sekere volgorde/struktuurelemente teenwoordig in bakteriële RPR wat óf belangrik is vir tersiêre kontakte óf vir direkte interaksies met die substraat (Fig. 1). Byvoorbeeld, die tersiêre kontakte in die kleiner laag 2 van bakteriële RPR (tussen P8 en L14/L18) is nie moontlik in óf argeale óf eukaryale RPR nie omdat hulle hierdie elemente ontbreek en kompenserende strukturele motiewe is nie duidelik nie. Die L15-lus wat basis-pare met die CCA-volgorde aan die 3&prime einde van ptRNAs is ook afwesig in alle eukaryale en sommige argaeale RPRs.


Uitgebreide asiel-koënsiem spesifisiteit van GCN5

Onlangse vooruitgang in proteomika het aan die lig gebring dat lisienreste op histone en nie-histonproteïene ander vorme van asilering kan ondergaan, insluitend propionilering, butirilering, suksinilering, glutarilering, malonilering, krotonilering en β-hidroksibutirilering [57, [70], [71] , [72]]. Huidige data dui daarop dat die byvoeging van hierdie posttranslasie-modifikasies deur HAT's gekataliseer word en onderhewig is aan metaboliese regulering gebaseer op die sellulêre asiel-KoA-vlakke.


Aanvanklike snelheidsmeting van 'n chemiese reaksie (met diagram)

Om die snelheid van 'n reaksie te meet, is dit nodig om 'n sein te volg wat produkvorming of substraatuitputting oor tyd rapporteer.

Die tipe sein wat gevolg word, wissel van toets tot toets, maar maak gewoonlik staat op 'n unieke fisies-chemiese eienskap van die substraat of produk, en/of die ontleder se vermoë om die substraat van die produk te skei.

Oor die algemeen maak die meeste ensiemtoetse staat op een of meer van die volgende breë klasse van opsporing en skeidingsmetodes om die verloop van die reaksie te volg:

Chromatografiese skeiding en

Direkte toets:

Hierdie metodes kan gebruik word in direkte bepaling, die direkte meting van die substraat of produkkonsentrasie as 'n funksie van tyd. Byvoorbeeld, die ensiem sitochroom c-oksidase kataliseer die oksidasie van die heem-bevattende proteïen sitochroom c. In sy gereduseerde (ysterhoudende yster) vorm vertoon sitochroom c 'n sterk absorpsieband by 550 nm, wat aansienlik in intensiteit verminder word wanneer die heemyster deur die oksidase geoksideer word (ystervorm).

'n Mens kan dus die verandering in ligabsorpsie by 550 nm meet vir 'n oplossing van yster(II)-sitochroom c as 'n funksie van tyd na byvoeging van sitochroom c-oksidase die afname van absorpsie by 550 nm wat waargeneem word, is 'n direkte maatstaf van die verlies aan substraat ( ystersitochroom c) konsentrasie (Fig. 7.1).

In sommige gevalle verskaf die substraat en produk van 'n ensiematiese reaksie nie 'n duidelike sein vir gerieflike meting van hul konsentrasies nie. Dikwels kan produkgenerering egter gekoppel word aan 'n ander, nie-ensiematiese, reaksie wat wel 'n gerieflike sein produseer. So 'n strategie word na verwys as 'n indirekte toets.

Indirekte toetse:

Dihidrorotaatdehidrogenase (DHODase) verskaf 'n voorbeeld van die gebruik van indirekte toetse. Hierdie ensiem kataliseer die omskakeling van dihidrorotaat na orotiese suur in die teenwoordigheid van die eksogene kofaktor ubiquinone. Tydens ensiemomset word elektrone wat gegenereer word deur die omskakeling van dihidrorotaat na orotiese suur deur die ensiem na 'n ubiquinoon-kofaktor oorgedra om ubiquinol te vorm.

Dit is moeilik om hierdie reaksie direk te meet, maar die vermindering van ubiquinone kan gekoppel word aan ander nie-ensiematiese redoksreaksies. Dit is bekend dat verskeie redoksaktiewe kleurstowwe van kleur verander na oksidasie of reduksie. Onder hierdie is 2,6-dichlorofenolindophenol (DCIP) 'n gerieflike kleurstof waarmee die DHODase-reaksie gevolg kan word. In sy geoksideerde vorm DCIPs helderblou, absorbeer lig sterk by 610 nm.

By vermindering gaan hierdie absorpsieband egter heeltemal verlore. DCIP word stoïgiometries verminder deur ubiquinol, wat tydens DHODase-omset gevorm word. Dit is dus moontlik om ensiematiese omset te meet deur 'n oormaat DCIP teenwoordig te hê in 'n oplossing van substraat (dihidrorotaat) en kofaktor (ubiquinone), dan volg die verlies van 610 nm absorpsie met tyd na toevoeging van ensiem om die reaksie te begin.

'n Derde manier om die verloop van 'n ensiem-gekataliseerde reaksie te volg, word na verwys as die gekoppelde toetsmetode. Hier word die ensiematiese reaksie van belang gepaard met 'n tweede ensiematiese reaksie, wat gerieflik gemeet kan word. In 'n tipiese gekoppelde toets is die produk van die ensiemreaksie van belang die substraat vir die ensiemreaksie waaraan dit gekoppel word vir gerieflike meting.

'n Voorbeeld van hierdie strategie is die meting van aktiwiteit vir heksokinase, die ensiem wat die vorming van glukose 6-fosfaat en ADP uit glukose en ATP kataliseer. Nie een van hierdie produkte of substrate bied 'n besonder gerieflike manier om ensiematiese aktiwiteit te meet nie.

Die produk glukose 6-fosfaat is egter die substraat vir die ensiem glukose 6-fosfaat dehidrogenase, wat, in die teenwoordigheid van NADP, hierdie molekule omskakel na 6-fosfoglukonolaktoon. In die loop van die tweede ensiematiese reaksie word NADP tot NADPH gereduseer, en hierdie kofaktorvermindering kan maklik gemonitor word deur ligabsorpsie by 340 nm.

Hierdie voorbeeld kan veralgemeen word na die volgende skema:

waar A die substraat vir die reaksie van belang is, v1 is die snelheid vir hierdie reaksie, B is die produk van die reaksie van belang en ook die substraat vir die koppelingsreaksie, v2 is die snelheid vir die koppelingsreaksie, en C is die produk van die koppelingsreaksie wat gemeet word. Alhoewel ons C in hierdie skema meet, is dit die bestendige toestand snelheid v1 wat ons wil studeer.

Om dit te bereik moet ons 'n situasie bereik waarin v1 is koersbeperkend (d.w.s. v1 ˃˃ v2) en B het 'n bestendige konsentrasie bereik. Onder hierdie toestande word B amper oombliklik na C omgeskakel, en die tempo van C-produksie is 'n weerspieëling van v1. Die gemete koers sal minder wees as die bestendige toestand koers v1, egter totdat [B] opbou tot sy bestendige toestand vlak.

Dus, in enige gekoppelde toets sal daar 'n vertragingsfase wees voor bestendige toestand produksie van C (Fig. 7.2), wat kan inmeng met die meting van die aanvanklike snelheid. Om dus die ware aanvanklike snelheid van die reaksie van belang te meet, moet toestande gesoek word om die vertragingsfase wat bestendige toestand produk vorming voorafgaan te minimaliseer, en sorg moet gedra word om te verseker dat die snelheid gemeet word tydens die bestendige toestand fase.

Die snelheid van die gekoppelde reaksie, v2, volg eenvoudige Michaelis-Menten kinetika soos volg:

waar K 2 m verwys na die Michaelis-konstante vir ensiem E2, nie die vierkant van die K niem. Vroeg in die reaksie, v1 is konstant vir 'n vaste konsentrasie van E1. Gevolglik word die tempo van B-vorming gegee deur:

Hierdie vergelyking is geëvalueer deur integrasie deur Storer en Cornish-Bowden (1974), wat getoon het dat die tyd wat nodig is vir [B] om 'n persentasie van sy bestendige toestand te bereik [B]ss kan deur die volgende vergelyking gedefinieer word:

waar t99% is die tyd wat nodig is vir [B] om 99% te bereik [B]ss en Ф is 'n dimensielose waarde wat afhang van die verhouding v1/V2 en v2/v1. Dit is bekend dat maksimum snelheid V2 is die produk van kkat vir die koppelingsensiem en die konsentrasie van koppelingsensiem [E2]. Die waardes van kkat en Km want die koppelingsensiem is konstantes wat nie eksperimenteel aangepas kan word sonder veranderinge in reaksietoestande nie.

Die maksimum snelheid V2kan egter deur die navorser beheer word deur die konsentrasie aan te pas [E2]. Dus deur te wissel [E2] mens kan V verstel2, vandaar die verhouding v1/V2, en ook die vertragingstyd vir die gekoppelde reaksie.

Kom ons sê dat ons die ware bestendige toestand snelheid v kan meet1 nadat [B] 99% van [B] bereik hetss. Hoeveel tyd is nodig om hierdie vlak van [B] te bereikss? Ons kan dit bereken as ons die waardes van v ken1 en Ф. Storer en Cornish-Bowden het die verhoudings v1/V2 wat verskillende waardes van Ф oplewer om verskillende persentasies van [B] te bereikss. Tabel 7.1 lys die waardes vir [B]=99% [B]ss.

Hierdie persentasie word gewoonlik as optimaal beskou vir die meting van v1 in 'n gekoppelde toets. In sekere gevalle kan hierdie vereiste verslap word. Byvoorbeeld, [B] = 90% [B]ss sal voldoende wees vir die gebruik van 'n gekoppelde toets om kolomfraksies te sift vir die teenwoordigheid van die ensiem van belang.

In hierdie situasie poog ons nie om kinetiese parameters te definieer nie, maar wil ons bloot 'n relatiewe maatstaf van primêre ensiemkonsentrasie onder verskillende monsters hê. Die leser moet die oorspronklike referaat deur Storer en Cornish-Bowden (1974) raadpleeg vir bykomende tabelle van Ф vir verskillende persentasies van [B]ss.

Easterby (1973) en Cleland (1979) het 'n effens ander metode aangebied om die duur van die vertragingsfase vir 'n gekoppelde reaksie te bepaal. Uit hul behandelings vind ons dat solank die koppelingsensiem(e) onder eerste-orde toestande werk (d.w.s. [B]ss << K 2 m), kan ons skryf:

waar τ die vertragingstyd is. Die tyd wat nodig is vir [B] om [B] te naderss is eksponensieel verwant aan τ sodat [B] 92% is [B]ss by 2.5τ, 95% [B]ss by 3τ, en 99% [B]ss by 4.6τ (Easterby, 1973). Produk (C) vorming as 'n funksie van tyd (t) is afhanklik van die aanvanklike snelheid en die vertragingstyd (τ) soos volg:

Indien meer as een ensiem in die koppelingstappe gebruik word, kan die algehele vertragingstyd bereken word as ∑(K i m/Vi). Byvoorbeeld, as 'n mens twee opeenvolgende koppelensieme, A en B gebruik om die reaksie van die primêre ensiem van belang te volg, sal die algehele vertragingstyd gegee word deur:

Omdat gekoppelde reaksies veelvuldige ensieme behels, bied hierdie toetse 'n aantal potensiële probleme wat nie met direkte of indirekte toetse teëgekom word nie. Byvoorbeeld, om betekenisvolle data oor die ensiem van belang in gekoppelde toetse te verkry, is dit noodsaaklik dat die reaksie van belang tempo beperkend bly onder alle reaksietoestande.

Andersins kan enige snelheidsveranderinge wat veranderinge in reaksietoestande vergesel, moontlik nie effekte op die teikenensiem akkuraat weerspieël nie. Byvoorbeeld, om 'n gekoppelde reaksieskema te gebruik om k te bepaalkat en Km vir die primêre ensiem van belang is dit nodig om te verseker dat v1 is steeds tempo beperkend by die hoogste waardes van [A] (d.w.s. substraat vir die primêre ensiem van belang).

Gekoppelde toets:

Die gebruik van 'n gekoppelde toets om inhibisie van die primêre ensiem te bestudeer kan ook problematies lyk. Die teenwoordigheid van veelvuldige ensieme kan onduidelikhede in die interpretasie van die resultate van sulke eksperimente veroorsaak: byvoorbeeld, watter ensieme(s) word werklik geïnhibeer? Easterby (1973) wys egter daarop dat die gebruik van gekoppelde toetse om vir inhibeerders te skerm, dit relatief maklik maak om te onderskei tussen inhibeerders van die primêre ensiem en die koppelensiem(e).

Inhibeerders van die primêre ensiem sal die effek hê om die bestendige toestand snelheid v1 (Fig. 7.3A), terwyl inhibeerders van die koppelingsensiem(e) die vertragingsfase sal verleng sonder om v te beïnvloed1 (Fig. 7.3B). In die praktyk is hierdie onderskeid slegs duidelik wanneer 'n mens produkvorming oor 'n reeks tydpunte meet wat beduidende gedeeltes van beide die vertragingsfase en die bestendige toestandfase van die vorderingskurwes dek (Fig. 7.3). Rudolph et al. (1979), Cleland (1979) en Tipton (1992) verskaf meer gedetailleerde besprekings van gekoppelde ensiemtoetse.


Abstrak

Die eenvoudigste manier om die invloed van die relatiewe diffusie van die reaktante op die tydsverloop van bimolekulêre reaksies te beskryf, is om die fenomenologiese tempokonstantes wat in die tempovergelykings van konvensionele chemiese kinetika ingaan, te wysig of te hernormaliseer. Vir makromolekules met veelvuldige ongelykwaardige reaktiewe plekke is dit egter nie meer voldoende nie, selfs in die lae konsentrasielimiet. Die fisiese rede is dat 'n ensiem (of 'n ligand) wat sopas gemodifiseer is (of gedissosieer het van) een plek kan aan 'n naburige plek bind eerder as om weg te diffundeer. Hierdie proses word nie beskryf deur die konvensionele chemiese kinetika nie, wat slegs geldig is in die limiet dat diffusie vinnig is in vergelyking met reaksie. Deur 'n presies oplosbare baie-deeltjie reaksie-diffusie model te gebruik, wys ons dat die invloed van diffusie op die kinetika van multisite binding en katalise verreken kan word deur nie net die tempo's te skaal nie, maar ook deur nuwe verbindings in die kinetiese skema in te voer. Die tempokonstantes wat hierdie nuwe oorgange of reaksiekanale beskryf, blyk 'n deursigtige fisiese interpretasie te hê: Die chemiese tempo's word afgeskaal deur die toepaslike waarskynlikhede dat 'n paar reaktante, wat aanvanklik in kontak is, bind eerder as uitmekaar diffundeer. Die teorie word geïllustreer deur toepassing op fosforilering van 'n multisite substraat.

Vir bimolekulêre reaksies in oplossing is die formalisme van chemiese kinetika slegs geldig in die limiet dat die reaktante baie keer bymekaar kom voordat hulle reageer. Dit beteken dat die intrinsieke reaksietempo stadiger moet wees as die tempo waarteen die vennote saam diffundeer. Beginnend met die seminale werk van Smoluchowski (1), is dit getoon dat die relatiewe diffusie van die reaktante, selfs in 'n makroskopies homogene oplossing, kan lei tot afwykings van die voorspellings van konvensionele chemiese kinetika. Byvoorbeeld, vir omkeerbare reaksies verval die konsentrasies tot hul ewewigswaardes nie eksponensieel nie, maar eerder as 'n magswet (2, 3). Vir biochemies relevante konsentrasies is sulke effekte egter klein. Selfs in die oorvol omgewing van 'n sel, hoewel die totale konsentrasie van alle makromolekules natuurlik hoog is, is die konsentrasies van spesifieke molekules wat met mekaar kan reageer tipies laag. Alhoewel dit interessant en uitdagend is om 'n teorie van omkeerbare diffusie-beïnvloede reaksies te ontwikkel wat te alle tye en konsentrasies akkuraat is, is die konsentrasies in baie gevalle so laag dat al wat 'n mens hoef te doen is om die fenomenologiese tempokonstantes te vervang deur hul diffusie- waardes beïnvloed.

In hierdie vraestel kyk ons ​​na 'n klas reaksies wat makromolekules met veelvuldige plekke insluit waar, selfs by lae konsentrasies, dit nie genoeg is om die tempokonstantes met diffusie-beïnvloed te vervang nie. Ons belangstelling in sulke probleme is gestimuleer deur die belangrike werk van Takahashi et al. (4) oor die rol van diffusie in 'n dubbele fosforilering-defosforilasie siklus wat ultrasensitiewe (5) en bistabiele gedrag kan vertoon (6). Gebaseer op baie-deeltjie stogastiese simulasies, is getoon dat die verlangsaming van diffusie reaksie kan bespoedig en lei tot die verlies van ultrasensitiwiteit en bistabiliteit (4). Hierdie resultate is toegeskryf aan "spatio-temporele korrelasies tussen die ensiem en die substraatmolekules." Die fisiese idee word geïllustreer in Fig. 1 vir dubbele fosforilering. Ter wille van eenvoud het ons aangeneem dat die bindings- en katalitiese terreine dieselfde is en het 'n verwysingsraamwerk aangeneem waar die substraat vasgemaak is. Nadat die eerste plek gewysig is, dissosieer die ensiem en (i) diffundeer weg en 'n ander ensiem bind en verander die tweede plek (onderste pad) of (ii) bind aan die tweede plek en wysig dit (boonste pad). Met ander woorde, in die boonste pad word beide plekke deur dieselfde ensiemmolekule gefosforileer, terwyl die plekke in die onderste pad deur verskillende molekules gefosforileer word. In die vinnige diffusielimiet is slegs die onderste pad in die spel. In die fosforileringsveld word die meganisme distributief genoem wanneer die ensiem en substraat dissosieer na elke modifikasie, terwyl in 'n prosessiewe meganisme alle terreine gefosforileer word voor dissosiasie (7, 8). Dus, wanneer die tempo van diffusie eindig is, bevat die meganisme noodwendig beide distribusie- en prosessiewe kenmerke (4, 9, 10).

'n Substraat S met twee plekke (geel) wat deur 'n ensiem verander (rooi) kan word E by konsentrasie [E]. Laer pad: Nadat een plek gemodifiseer is, diffundeer die ensiem weg en 'n ander ensiem bind en fosforileer die ongemodifiseerde plek. Boonste pad: Die ensiem wat pas een plek gemodifiseer het, dissosieer, bind aan die ongemodifiseerde plek en fosforileer dit dan.

Die doel van hierdie referaat is om 'n eenvoudige teorie te ontwikkel wat sulke verskynsels kwantitatief kan beskryf vir fisies relevante konsentrasiereekse sonder om na veeldeeltjie rekenaarsimulasies toe te vlug. In 'n neutedop, nie net moet 'n mens die bestaande fenomenologiese tempokonstantes vervang deur hul diffusie-beïnvloedde eweknieë nie, maar 'n mens moet ook nuwe oorgange in die kinetiese skema inbring. Die tempo van hierdie nuwe reaksiekanale word bepaal deur die waarskynlikheid dat 'n reaktant wat van een plek vrygestel word aan 'n ander bind eerder as om weg te diffundeer. Selfs vir komplekse geometrieë kan sulke vang- en ontsnapwaarskynlikhede gevind word deur slegs 'n tyd-onafhanklike, twee-deeltjie probleem numeries op te los of te simuleer.

Die uiteensetting van die vraestel is soos volg. Ons begin met waarskynlik die eenvoudigste model van multisite modifikasie wat presies op die veeldeeltjievlak opgelos kan word. In hierdie model word aanvaar dat die leeftyd van die ensiem-substraat-kompleks so kort is dat 'n plek gemodifiseer kan word wanneer die ensiem bloot met die substraat in aanraking kom. Wanneer die ensiemkonsentrasie laag genoeg is, word gevind dat die presiese tydsafhanklikheid van die konsentrasies goed beskryf word deur gewone tempovergelykings wat ooreenstem met die standaard kinetiese skema met die deurslaggewende verskil dat nuwe oorgange toegelaat is. Die ooreenstemmende tempokonstantes blyk so 'n eenvoudige fisiese interpretasie te hê dat die formalisme geredelik veralgemeen kan word om meer realistiese gevalle te behandel (bv. intermediêre gebonde komplekse, ensiemreaktivering en binding aan ongelykwaardige plekke). Die tempokonstantes in die gemodifiseerde kinetiese skemas kan uitgedruk word in terme van die vang- en ontsnappingswaarskynlikhede van 'n geïsoleerde paar reaktante. In eenvoudige gevalle kan dit gevind word deur 'n tydonafhanklike vergelyking op te los onderhewig aan die toepaslike randvoorwaardes en, vir realistiese geometrieë, deur die dinamika van 'n geïsoleerde paar reaktante te simuleer. Illustratiewe berekeninge vir dubbele fosforilering toon dat ons formalisme die versnelling van die reaksie wat ontdek is met behulp van stogastiese veeldeeltjie-simulasies weergee (4).


AFSLUITING

Science is difficult, but the satisfaction of reaching some new understanding of the extraordinary chemical and physical processes that are responsible for the functioning of a living organism, whether it be an amoeba or an Einstein, is a more than adequate incentive to pursue this understanding, which has undergone an extraordinary increase during my lifetime. The progress that has been made in increasing this understanding has gone far beyond what was thought possible in the 1960s, as is apparent from the reviews that are published in this volume.