Inligting

Vind 'n maklike en goedkoop metode om dNTP te kleur

Vind 'n maklike en goedkoop metode om dNTP te kleur


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek wil OD meet om die konsentrasie van dNTP te weet. Enige idee om dNTP te kleur teen die goedkoopste prys en maklikste manier?


Daar is dalk so 'n kleurstof, maar ek is nie bewus daarvan nie. Die standaard manier om dNTP's en nukleïensure in die algemeen te meet, is deur absorpsie by 260 nm. Hierdie artikel het 'n tabel van molêre uitsterwingskoëffisiënte vir dNTP's (Tabel 10.2). Hulle is

golflengte molêre uitsterwingskoëffisiënt dATP 259 nm 15 200 dCTP 280 nm 13 100 dGTP 253 nm 13 700 dTTP 267 nm 9 600

In die praktyk vir roetinewerk met DNA kan jy 260 nm gebruik en aanvaar dat 'n absorpsie van 1 ooreenstem met [DNA] = 50 µg ml-1. Deur 'n gemiddelde van die waardes in die Tabel te gebruik, en die feit dat dit eintlik op verskillende golflengtes is, te verontagsaam en 'n benaderde gemiddelde dNTP MW van 500 te gebruik, bereken ek 'n absorpsie vir 'n 50 µg ml-1 oplossing van al 4 dNTP's as 1.3, so dit is 'n redelike ooreenkoms gegewe al die aannames wat ek gemaak het.

Daar is fluoresserende kleurstowwe wat gebruik kan word om DNA te meet, maar dit maak staat op die teenwoordigheid van gestapelde basisse, en is dus nie nuttig vir gratis dNTP's nie.

So, slegte nuus as jy nie 'n UV-spektrofotometer het nie. Daar is planne beskikbaar vir die konstruksie van eenvoudige spektrofotometers wat Lego en 'n paar opto-elektroniese komponente gebruik. Hierdie is geneig om LED's as 'n ligbron te gebruik, maar ek weet nie of UV-LED's beskikbaar is nie.


Dit sal moeilik wees om die vlak van golflengte-resolusie te bereik wat nodig is om dNTP's te onderskei, aangesien jy 'n DIY-eksperiment doen. Slegs baie presiese spektrofotometers kan dit bereik en hulle is duur.

Nog 'n tegniek wat jy kan probeer is dunlaagchromatografie (TLC). Dit is goedkoop en jy kan maklik 'n DIY doen. Maar jy het standaarde nodig om NTP, NDP en NMP te onderskei; laasgenoemde twee kan ontstaan ​​as gevolg van agteruitgang tydens die eksperiment. Mense gebruik gewoonlik 'n skemerkelkie van anti-oksidante en beskermende middels om die afbraak van nukleotiede te verminder.

'n Strategie om hieraan te werk, is om die fosfaat met behulp van fosfatase te verwyder en dan 'n TLC te doen met Nukleosiede (wat redelik stabiel is).

U kan hierdie resensie op nukleïensuur TLC nagaan.


Praktiese Inleiding tot Elektroforese vir Biologie

Die laboratorium waar ek werk stel belang in die meganika van basiese biologiese prosesse, deur gis as 'n modelorganisme te gebruik.

'n Goeie vriend, 'n fisikus en tegnologiebemarkingsbestuurder van opleiding en beroep, sal hopelik by my in die laboratorium aansluit. Dit is my informele notas aan hom om hom op 'n praktiese manier vir ons laboratorium op hoogte te bring, met die fokus op goue-oues klassieke metodes om mee te begin. My hoop is dat hy, en ander wat belangstel om so 'n loopbaanoorgang na 'n bio-laboratorium te maak, hierdie praktiese inleiding ook nuttig sal vind.


Abstrak

In hierdie werk het ons 'n flitsfotolise-tegniek toegepas op die studie van die kinetiese gedrag van 'n sintetiese flavyliumsout in waterige oplossing. Die kinetiese prosesse wat deur die ligpuls van 'n algemene kameraflits veroorsaak word, word gevolg deur middel van 'n effens gewysigde, rekenaarbeheerde, spektrofotometer. Lig veroorsaak omkeerbare absorpsieveranderinge en twee verskillende verbygaande spesies word bewys voor die volle herstel van die stelsel. Die kinetiese gedrag en die spektra van die verbygaande spesies word gerapporteer. Die voorgestelde eksperiment is goedkoop en maklik en stel studente van alle vlakke in staat om vertroud te raak met die konsepte van verbygaande vervalkinetika en tydopgeloste spektra.


Heroorweging van die kleurproses met sintetiese biologie

20% van die aarde se waterbesoedeling word deur tekstielverwerking veroorsaak en 1 800 liter water word benodig om 'n enkele blou jeans te maak. Dit is 'n verbysterende hoeveelheid vars water wat nodig is om 'n enkele kledingstuk te maak – maar die bedryf is op die punt om te verander.

VK-gebaseerde Colorifix wil watervermorsing deur die kleurproses verminder deur die biologiese vermoëns van mikrobes te benut.

"As deel van 'n Universiteit van Cambridge-geleide arseen-biosensorprojek, het ons span met ons prototipe biosensor na Suid-Asië gegaan, aan mense verduidelik hoe dit werk, en toe mense gevra vir 'n lys van chemikalieë wat hulle gedink het die moeite werd is om te monitor," sê Dr. Orr Yarkoni, medestigter en HUB van Colorifix.

"Toe ons terugkom [na die Verenigde Koninkryk] en ons huiswerk gedoen het, het ons ontdek dat die meeste van hierdie chemikalieë van die tekstielbedryf afkomstig was, en verf was die groot boosdoener vir beide watergebruik en chemiese gebruik," sê Yarkoni, wat toe besluit het om sintetiese biologie te gebruik om die kleurstowwe te vervaardig en kontaminante te verminder, eerder as om dit bloot te monitor.

Na 'n paar jaar se navorsing saam met dr. James Ajioka en dr. David Nugent, is Colorifix in 2016 uitgespook. Wetenskaplike vordering was vinnig, en die span het vinnig gekyk na maniere om die omgewingskade wat deur die tekstielbedryf veroorsaak word te verminder, verder as net die produksie van kleurstowwe.

Drs. Nugent (links) en Ajioka (regs) in die Colorifix-laboratorium in Norwich, Engeland. Beeld met vergunning van Colorifix.

"Gewoonlik word [afsetting van 'n kleurstof op stof] gedoen met chemikalieë of biologies vervaardigde verbindings, maar sonder 'n biologiese middel. Ons gebruik die selle self om beide die pigment te produseer en in die vesel te deponeer, so ons gebruik biologie vir die hele proses. Deur dit te doen, kan ons op water en energie bespaar en chemikalieë verwyder. Ons gebruik biologie om daardie pigmente en kleurstowwe in die vesel oor te dra,” verduidelik Yarkoni.

Tot dusver het Colorifix 'n reeks kleure ontwikkel, elk afkomstig van natuurlike pigmente.

“Die meeste van ons pigmente vandag is van insekte, sommige mikrobiologiese, voëls, ensovoorts. So ja, ons soek nou oral vir pigmente. Ons het ook 'n paar pigmente van onderwater-organismes gemaak,” sê Yarkoni, wat vinnig daarop wys dat die werklike voordeel van Colorifix hul unieke kleurproses is, meer as die produksie van bio-gebaseerde pigmente.

In 'n vorige onderhoud met Vogue Australia het Yarkoni beklemtoon dat hul kleurproses 10 keer minder water gebruik en 20 persent minder energie verbruik, hoofsaaklik omdat die maatskappy melasse, 'n suiker neweproduk, gebruik om die pigmentproduserende mikrobes te voed, en vervanging van fiksering chemikalieë met biologie self. Die normale tekstielverfproses vind dikwels plaas by baie hoë temperature – heelwat meer as 100 grade Celsius – wat baie energie verbruik. Colorifix se mikrobes kan teen 37 grade kleur en dan teen ver onder 100 grade hitte-geïnaktiveer word, wat energie bespaar. Maar die maatskappy beplan nie om daar te stop nie.

'n Voorbeeld van gekleurde tekstiele van Colorifix se bio-gebaseerde kleurproses. Beeld met vergunning van Colorifix.

"Met betrekking tot water, is ons opgewonde om te sê dat ons nou beide fermentasie en kleuring suksesvol geloods het deur uitsluitlik soutwater te gebruik, so ons hoef nou nie vars water in die proses aan te raak nie," het Yarkoni aangekondig.

Dit is 'n groot sprong vir die tekstielbedryf en kan duisende liter varswater deur die kleurproses bespaar. Die beste deel is dat, ten spyte van hierdie energie- en waterbesparings, die proses vir die kleur van 'n tekstiel grootliks onveranderd bly.

"Ons kleurdrank gaan in wese in hul bestaande kleurmasjien – hulle is almal versoenbaar – so al wat hulle hoef te doen is om die kleurdrank wat in hul masjien gaan verander," sê Yarkoni, met verwysing na die waterige oplossing van chemikalieë wat gebruik word om 'n kledingstuk. "Die enigste verskil is dat [die verffasiliteit] van al hul ander chemikalieë ontslae kan raak, aangesien die organisme die kleurstof regmaak en die stof vlek sonder daardie chemikalieë."

Van denim tot kleurstowwe en alles tussenin, sintetiese biologie-maatskappye beantwoord die oproepe van 'n verkwistende bedryf. Maatskappye soos Tinctorium, PILI en Colorifix vind alternatiewe maniere om dieselfde lewendige kleure te produseer wat by verbruikers aantreklik is sonder die bykomende toksisiteit, chemikalieë en besoedeling.

Ons betree 'n deurslaggewende oomblik in die modebedryf, waar bio-gebaseerde, volhoubare alternatiewe die nuwe mode sal wees.

Niko McCarty

Niko is 'n Bio-ingenieurswese PhD-student aan die California Institute of Technology. Hy het voorheen sy meestersgraad in sisteme en sintetiese biologie aan die Imperial College in Londen as 'n Fulbright-geleerde voltooi.


RESULTATE

Oorsig en optimalisering van DocMF-stelsel

Die nuwe DocMF-stelsel meet proteïen-DNA-interaksies deur die fluoressensie-seinverandering te ondersoek via sekwensiële beeldvorming op die skyfie voor en na proteïeninteraksie met DNB's wat DNA-teikens bevat (Fig. 1 en film S1). Die DNB'e is saamgestel uit volgordebepalingsadapters en invoegings van ewekansige rye om die volle reeks proteïenbindingsplekke te dek. Honderde miljoene DNB's word eers op die BGISEQ500-skyfies gelaai in 'n patroon-skikking, en die invoegstreke word op 'n vaste lengte gerangskik deur gebruik te maak van die DNBSeq-werkvloei (16). Nadat ons die unieke volgorde-inligting vir elke DNB verkry het, hervorm ons enkelstring-DNB's (ssDNB's) deur die kleurstof-gemerkte string wat in volgordebepaling gesintetiseer is, af te stroop. Vervolgens word 'n inheemse komplementêre string hersinteteer om dsDNA te vorm en gemerk met fluoresserende kleurstowwe. Vir DNA-splitsende proteïene word 'n eerste beeld verkry om die ligging en die seinintensiteit van individuele DNB's aan te teken, d.w.s. lees. Die proteïen van belang bind aan sy dsDNA-teikens en klief ooreenstemmende DNB's, wat lei tot seinvermindering of uitskakeling van hierdie DNB's tydens 'n tweede rondte van beeldvorming (Fig. 1A). Spesifieke motiewe kan geïdentifiseer word uit die volgordes van geselekteerde DNBs met sein eliminasie of vermindering groter as 'n drempel (Fig. 1B) en geverifieer in daaropvolgende molekulêre toetse. 'n Effens gewysigde DocMF-werkvloei word gebruik om proteïen-DNA-bindingsvoorkeure te karakteriseer. In hierdie protokol word DNB's eers afgebeeld na die inkubasie van eindgemerkte dsDNA met DNA-bindende proteïene vir aanvanklike seinintensiteit. In die volgende stap word 'n bykomende polimerase-reaksie genaamd MDA uitgevoer om die gemerkte string te vervang. MDA lei tot seinverlies tydens die tweede beeldstap soos geïllustreer in fig. S1. As 'n proteïen van belang egter aan sy DNA-teikens bind en MDA inhibeer, sal die sein van die DNB's wat proteïenbindingsplekke bevat onveranderd bly of minder geaffekteer word as dié van die kontrolebaan, wat nie proteïeninkubasie insluit nie, maar die ander stappe behou .

Om te verseker dat opeenvolgende beelding haalbaar is, is dit van kardinale belang dat die stroopstap nie ruimtelike inligting beïnvloed of die DNB-struktuur beskadig nie. Die BGISEQ500-skyfies wat in hierdie eksperiment gebruik word, is patroonskikkings. Daarom beïnvloed die opeenvolgende beeldvorming nie die registrasie van DNB-liggings in dieselfde mate as wat die CHAMP-metode wat Miseq-skyfies gebruik, beïnvloed word nie (11). Daarbenewens het ons 'n verskeidenheid stropingsbuffers getoets en gevind dat die formamiedbuffer die minste impak op DNB-integriteit gehad het, en slegs die waterstofbindings tussen dsDNA verbreek sonder om DNB-stabiliteit te beïnvloed of DNB's van die oppervlak los te maak. Figuur S2 toon dat die volgordebepaling kwaliteit tellings, insluitend Q30 (92.83 teenoor 90.32), Lag (0.15 teenoor 0.15) en RunOn (0.15 versus 0.12), onaangeraak gebly het na stroping met formamied buffer. In vergelyking het die stropingsbuffer met NaOH die Q30 van meer as 90% tot byna 0 aansienlik verlaag.

Nadat ons twee beelde voor en na proteïen-DNA-interaksie verkry het, het ons die rou seinintensiteitsvouverandering van elke DNB direk vergelyk. As die proteïen DNA klief, kan die DNB's wat beduidende seinvermindering het, herwin word (Fig. 1B), en die ooreenstemmende rye word ontleed vir motief-identifikasie (Materiale en Metodes). Om proteïen-DNA-bindingsinteraksies te meet, het ons die bindingsvolgorde-inligting van hierdie DNB's verkry met minimale seinvouverandering in vergelyking met die kontrole.

DocMF kan 'n wye reeks endonuklease-beperkingsplekke (RS'e) karakteriseer

Nadat die stelsel gevestig is, het ons ses beperking-endonukleases (Eco RI, Bpu 10I, Age I, Nme AIII, Mlu I en Bgl I) met verskillende RS-kenmerke getoets. Die tipe II-restrictie-ensieme klief DNA langs of binne hul herkenningsplekke (21), wat omvattend bestudeer is. Die geselekteerde ensieme bevat beperkingsplekke (RS'e) wat wissel van 6 tot 11 bp en bestaan ​​uit normale palindromiese volgordes, nie-palindromiese volgordes en gedegenereerde basisse. Die DNB-biblioteek bevat 'n poel sintetiese ewekansige DNS-fragmente met 'n lengte van 50 nt. Veertig van die 50 nukleotiede van hierdie ewekansige rye is gelees deur gebruik te maak van die BGISEQ-500RS Hoë-deurset-volgordebepaling (SE100). Beelde is geneem voor en na die inkubasie van hierdie ensieme op die skyfie vir 2 uur of oornag. DNB'e met FFI > 2-drempel (positiewe lees) is geïdentifiseer om vir motiewe te skerm (sien Materiale en Metodes).

Die presiese lengte van beperkingswerwe (RS'e) (L) is verkry via 'n "saadsamestelling"-metode (Materials and Methods). Ons het toe die werftariewe van almal bereken L-mers onder positiewe lees (Materiale en Metodes). Deur hierdie metode te gebruik, vir elk van hierdie ses beperking-endonukleases, het ons die terreinkoerse van almal verkry L-mers (L is die voorspelde lengte van 'n RS) en het 'n boxplot geteken vir die L-mers met die top 50 grootste terrein tariewe (Fig. 2A). Die motiewe (oranje gekleur in Fig. 2A) wat ooreenstem met die uitskieters in die boxplot, met die som van terreinfrekwensie van hierdie uitskieters (groen gekleur in Fig. 2A) >80%, is beskou as die DocMF-voorspelde beperkingsplekke (RS'e) . Dus, vir Eco RI, Bpu 10I, Age I, Nme AIII en Mlu I, het ons hul beperkingsterreine (RS'e) verkry vanaf die uitskieters wat in Fig. 2A getoon word, omdat die terreinkoerssomme van hierdie uitskieters almal groter as 80% was . Vir Bgl I was die terreinkoerssom van die uitskieters egter slegs 7.65%, wat te klein is om as beperkingsterreine (RS'e) met behulp van DocMF voorspel te word. Dus, vir Bgl I, het ons die 11-mere gebruik (omdat 11 die voorspelde lengte van die RS is) met die top 372 grootste terreinkoerse om die beperkingsterreine (RS'e) te voorspel, die terreinkoerssom van hierdie 372 motiewe was groter as 80 % (Fig. 2B). 'n reeks (19) voorstelling (Fig. 2C) van hierdie 372 rye het aan die lig gebring dat die RS vir Bgl I GCCNNNNNGC was, wat ooreengestem het met die gerapporteerde RS. Hierdie resultate het getoon dat ons stelsel tesame met 'n geoptimaliseerde bioinformatika-metode die DNA-herkenningsplek vir verskillende tipes beperkingsensieme betroubaar kan identifiseer.

(A) Boksplotte vir die motiewe met die top 50 log10(perseeltariewe). Uitskieters se DNS-volgordes (oranje) en die som van uitskieters se terreintempo (groen) word getoon. (B) Kumulatiewe terreintariewe vir Bgl I. (C) ’n Volgorde-logo-voorstelling van die 372 motiewe vir Bgl I.

DocMF kan die 5′-NGG-3′ PAM van SpCas9 akkuraat identifiseer

CRISPR-Cas effektors is RNA-geleide endonukleases wat 'n PAM as 'n DNA-bindingsein gebruik. Die PAM is 'n kort DNS-volgorde, gewoonlik minder as 7 bp, wat naby die teiken DNS (bekend as protospacer) van die CRISPR-Cas-stelsel (22, 23). Een algemeen gebruikte PAM-identifikasiebenadering transformeer plasmiede wat ewekansige PAM-volgorde dra in E coli in die teenwoordigheid of afwesigheid van die CRISPR-Cas lokus. Die frekwensie van 'n funksionele PAM-volgorde is aansienlik laer wanneer die Cas-proteïen teenwoordig is (24). Dus, hierdie PAM-uitputtingstoets (24) vereis twee stelle biblioteke vir óf 5′ óf 3′ PAM-identifikasie en ooreenstemmende negatiewe kontroles. Die biblioteekgrootte moet ook groot wees om die meeste, indien nie alle, PAM-reekse te dek. Daarbenewens het die plasmied-uitputtingstoets (24) is tydrowend en lae deurset. Daarteenoor kan die DocMF-stelsel gelyktydig beide 5′- en 3′-reekse vir PAM's in 'n enkele eksperiment skerm, wat dekking genereer wat verskeie grootteordes groter is as die tradisionele metode. Een van die twee PAM-streke wat nie deur die proteïen herken word nie, word as 'n interne negatiewe beheer gebruik.

In 'n bewys-van-konsep-studie het ons die akkuraatheid van DocMF geëvalueer deur die PAM-vereistes van SpCas9, die mees gebruikte CRISPR-Cas-stelsel, van S. pyogenes. SpCas9 klief die dsDNA na binding aan ooreenstemmende RNA, en hierdie splitsing word vanaf PAM-uitputtingstoetse gerapporteer om afhanklik te wees van 'n 5'-NGG-3' PAM-volgorde (25). Die PAM DNB-biblioteek wat in DocMF gebruik word, word in Fig. 3A getoon. Die sintetiese oligo-gebied het 'n bekende 23-nt SpCas9 protospacer volgorde (gekleur oranje in Fig. 3A) omring deur 5' en 3' PAM streke met 15 ewekansige nukleotiede elk (gekleur groen in Fig. 3A). Die volgorde-inligting van beide PAM-streke is verkry deur 'n enkel-end volgordebepaling van 50 nt.

(A) PAM DNB biblioteek voorbereiding illustrasie. Die sintetiese oligo-gebied bevat 'n bekende 25-nt SpCas9 protospacer-volgorde (oranje) omring deur 5' en 3' PAM-streke met 15 ewekansige nukleotiede elk (groen). Honderde kopieë van elke ewekansige PAM-flankeer protospacer word ingesluit per DNB, en slegs kopie word gedemonstreer. (B) Die relatiewe leesfrekwensie aan beide die 5′-kant en die 3′-kant vir SpCas9. Die X as is alle kombinasies van 7-nt rye gesorteer volgens die verskil tussen twee ente in dalende volgorde. (C) PAM-volgorde vir SpCas9.

Die seinvouverandering is vergelyk voor en na SpCas9 on-chip inkubasie vir 4 uur. Van 494 866 059 lesings (DNB'e) het ons 366 913 DNB'e gekry wat 'n vouverandering groter as 3 vertoon het en moontlik deur SpCas9 geklief kan word. Die 7-nt-volgordes by beide 5'- en 3'-PAM-streke is van hierdie DNB's herwin vir verdere analise. Die frekwensie van al 16,384 (4 7) PAM kombinasies vir beide 5' en 3' PAMs is bereken en geplot teen die individuele volgorde in Fig. 3B. Daar is gerapporteer dat SpCas9 endonuklease slegs aan die 3'-kant van die teikenvolgorde bind. Daarom is 5′-gerandomiseerde 7-nt-reekse as die interne negatiewe kontrole gebruik. Ons het die drie sigma-reël toegepas (26) na die 5′-reekse om die afsnypunt vir positiewe PAM-seine te definieer. Met ander woorde, by die afsnypunt van 0.11, het ongeveer 99.7% van data van die 5′ PAM-streek in agtergrondgeraas geval. Hierdie statistiese afsnypunt het gelei tot 944 3′ PAM-reekse wat verkieslik deur SpCas9 gesny is. 'n Volgorde-logo (19) voorstelling van die rye het aan die lig gebring dat SpCas9 'n 5'-NGG-3'-motief verkies het, hoewel ongeveer 5.8% (55 van 944) van 5'-NAG-3' en 1.6% (15 van 944) van 5'-NGA- 3′ kon ook herken word (Fig. 3C), wat in lyn is met vorige bevindings (2729).

DocMF maak sensitiewe in vitro-opsporing van PAM's in verskillende CRISPR-Cas-stelsels moontlik

Om die nut van DocMF verder te demonstreer om PAM-reekse te vind, het ons ons studie uitgebrei na twee voorheen ongekarakteriseerde CRISPR-Cas-stelsels, VeCas9 vanaf Veillonella genus en BvCas12 van Butyricimonas virosa (24). VeCas9 het 'n Cas9-effektorproteïen van 1064 aminosure, en BvCas12-proteïen is 1245 aminosure lank. Beide proteïene is uitgedruk en gesuiwer soos beskryf in die Aanvullende Materiale en Metodes. Die crRNA en tracrRNA van VeCas9 is geïdentifiseer deur klein RNA-volgordebepaling, terwyl die crRNA van BvCas12 in silico voorspel is gebaseer op die voorheen gerapporteerde Cas12a/Cpf1-ortoloë (fig. S3). Om die diversiteit van hul PAM-volgordes te ondervra, het ons DocMF op VeCas9 en BvCas12 uitgevoer met dieselfde DNB PAM-biblioteek (Fig. 3A) wat in die SpCas9-studie gebruik is. Vir VeCas9-eksperimente het ons drie individuele gRNA-ontwerpe ingesluit, crRNA:tracrRNA, sgRNA-1 met SpCas9-struktuur, en 'n afgeknotte sgRNA-2 (fig. S3).

Voordat DocMF gebruik word, 'n PAM-uitputtingstoets (24) is die eerste keer op VeCas9 uitgevoer vir metodologievergelyking (Aanvullende materiale en metodes). Soos in fig. S4 (A en B), met 4,62 Gb se volgorde-data, het ons 508 rye waargeneem met 'n drempel van 3 vir Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1 (AacC2c1), 'n positiewe kontrole in die uitputtingstoets, en het die gerapporteerde PAM, 5′-TTN-3′ (24). Met selfs meer opeenvolgingsdata (7.33 Gb) vir VeCas9, is 0 en 74 afsonderlike rye egter gevind met drempels van 3 en 0.8, onderskeidelik (fig. S4, C en D). Die resultate vir VeCas9 was redelik soortgelyk aan ons negatiewe kontrole-stelle (data nie getoon nie), en dus kon ons nie die korrekte PAM-volgorde vir VeCas9 opspoor deur die tradisionele uitputtingsmetode te gebruik nie. Die mislukking kan toegeskryf word aan óf swak VeCas9-proteïenuitdrukking óf funksie in E coli selle. Daarbenewens is die lae sensitiwiteit (

20× dekking vir elke 7-nt PAM volgorde) van die E coli uitputtingstoets kan die probleme net vererger.

Met behulp van DocMF is DNB's met seinvouverandering bo die drempel gekies vir verdere analise. In die leesfrekwensie-plot (Fig. 4, A en B), het die 5' PAM-gebied van VeCas9 (met sgRNA-1) en die 3' PAM-gebied van BvCas12 geen proteïenbindingspatroon getoon nie, en hul ooreenstemmende 3 SD's (0.09 vir VeCas9 en 0,075 vir BvCas12) is gebruik om afsnylyne te stel. As gevolg hiervan, is bepaal dat 4947 en 5580 unieke PAM-volgordes onderskeidelik deur VeCas9 en BvCas12 gesplits word. Beide CRISPR-Cas-stelsels het groot PAM-families oorgedra soos geïllustreer in konsensusreekse en volgordelogo, twee algemene PAM-verslagdoeningskemas (Fig. 4, C tot E en G) (22, 23). Die konsensusvolgorde van VeCas9 is geopenbaar as 5'-NNARRNN-3', of NYARRMY vir 'n selfs meer dominante stel PAM-reekse volgens frekwensieplot (Fig. 4C), terwyl volgordelogo 5'-NNNRR-3' PAM-reekse gerapporteer het (Fig. 4C). Fig. 4E). VeCas9 met die ander gRNAs het 'n soortgelyke patroon getoon (fig. S5). Meer as 99% van PAM's met die kort sgRNA-2 is gevind met ten minste een van die ander twee RNA's, wat die hoë reproduceerbaarheid van hierdie DocMF metode aandui. Effense verskil in PAM van BvCas12 is ook waargeneem tussen PAM-verslagdoeningsmetodes. Konsensus volgorde en volgorde logo gerapporteer 5'-TYTN-3' (Fig. 4D) of YYN (Fig. 4G), onderskeidelik. Hierdie twee rapporteringstelsels het egter die korrelasie tussen al sewe posisies geïgnoreer en kan 'n paar verkeerde aktiewe PAM's instel as elke posisie ewekansig gekombineer word.

(A) Die relatiewe leesfrekwensie aan beide die 5′-kant en die 3′-kant vir VeCas9. (B) Die relatiewe leesfrekwensie aan beide die 5′-kant en die 3′-kant vir BvCas12. Konsensus PAM-volgorde volgens frekwensie-plot met alle bespeurde 7-nt-reekse vir VeCas9 (C) en BvCas12 (D). PAM-volgorde vir volgorde-logo vir VeCas9 gegenereer deur alle bespeurde 7-nt-reekse (E) en deur die top 1000 7-nt-reekse van VOO-analise (F). PAM volgorde vir volgorde logo vir BvCas12 gegenereer deur alle bespeurde 7-nt rye (G) en deur die top 1000 7-nt-reekse van VOO-analise (H). (ek) In vitro-validering van VeCas9 PAM-volgordes. Nege 7-nt-reekse elk bo/onder die afsnypunt is gekies. Die VOO-ranglysnommers word in rooi getoon. NC, negatiewe beheer. (J) In vitro-validering van BvCas12 PAM-volgordes. Vyf 7-nt-reekse bo die afsnypunt en twee 7-nt-reekse onder die afsnypunt is gekies.

Om die relatiewe aktiwiteit van elke PAM te ondervra, is twee metodes toegepas, FET en die PAM-wiel. VOO is ingestel om die PAM-reekse te sorteer. VOO is 'n wyd gebruikte toets om te bepaal of die verskil tussen twee groepe betekenisvol is. Daarom, een spesifieke PAM met 'n kleiner P waarde volgens VOO het aangedui dat die relatiewe leesfrekwensie, of snydoeltreffendheid, meer betekenisvol was in vergelyking met een met 'n groter P waarde. Nadat ons die PAM's in volgorde gerangskik het, het ons die konsensus PAM-reekse vir die top 1000-reekse ondersoek (Fig. 4, F en H). 'n Effens duidelike PAM-konsensusvolgorde, 5'-NNARR-3' vir VeCas9 en 5'-TTTN-3 vir BvCas12, is onder hierdie streng seleksiekriteria waargeneem, wat beter met die frekwensie-plotresultate gekorreleer het (Fig. 4, C en D) ). Om die VOO-voorspelling verder te valideer, is 'n in vitro nuklease-toets uitgevoer met ewekansig geselekteerde PAM-volgordes. PCR-produkte wat individuele PAM's en 'n gemeenskaplike protospasieerder bevat, is geïnkubeer met óf Cas9 óf Cas12/Cpf1 proteïene by 37°C vir 1 uur. Reaksies met 50 ng insette is op TAE-gels uitgevoer, en die oorblywende insethoeveelheid is gebruik om splitsingsdoeltreffendheid te bereken. Soos gedemonstreer in Fig. 4 (G en H), het die PAM's met hoër VOO-rangordenommers (in rooi) minder insette oor gehad, wat 'n beter snydoeltreffendheid aandui. Die PAM wat die minste gerangskik is, het minimale snywerk gegee, waarvan die produk byna nie sigbaar was op agarose gels wie se sensitiwiteit verskeie ordes van groottes laer as NGS is nie. Die konsekwentheid het voorgestel dat ons ons VOO-voorspelling kan gebruik om die mees aktiewe PAM's vir in vivo geenredigering te kies.

'n PAM-wiel is ook gebruik om die PAM-reekse en hul basisafhanklikheid volledig te verstaan. Die PAM-wiel, afgelei van interaktiewe Krona-plotte, vang individuele PAM-volgorde en hul relatiewe aktiwiteit vas, insluitend dié met lae verryking (20). Dit kan ook uitgebrei word by enige sektor van die wiel om 'n subset van rye beter te sien en die funksie van daardie PAM's te bestudeer. Figuur 5 (A en B) beeld die onderskeie PAM-wiele vir VeCas9 en BvCas12 uit. Vir VeCas9 is daar 'n sterk basisafhanklikheid tussen posisie 3 en 4. As posisie 3 'n basis R (A of G) gehad het, was posisie 4 geneig om R te hê (>80% fig. S6) en 'n klein maar noemenswaardige vlak van C ( >0%). As posisie 3 Y (T of C is), bevoordeel posisie 4 slegs R (

99%). T is die minste bevoordeelde basis by posisie 4 of 5, wat ooreenstem met die in vitro snyresultate van Fig. 5C (bane 9 en 10). Die jel het ook getoon dat NYARRMY (die konsensus-PAM gebaseer op die mees dominante konsensusvolgordebaan 1 in Fig. 4C), NNARRNN (bane 2 tot 4) en ACAAGCC (58ste gerangskik volgorde as positiewe kontrolebaan 11) meer doeltreffend gesny is as NNCRRNN (baan 5), NNTRRNN (baan 6) of NNGRRNN (baan 7), wat verduidelik waarom A 47% by posisie 3 uitgemaak het, terwyl die ander drie basisse elk tussen 16 en 19% was (Fig. 5A en Fig. S6) ). Vir die BvCas12 PAM-wiel wat in Fig. 5B getoon word, het ons gevind dat posisie -4 ewekansig was wanneer beide posisies -2 en -3 Y (T/C) was. PAM YYN het dus meer snyprodukte gegenereer as YRN in Fig. 5D (bane 1 en 2). Posisie −4 was egter geneig om T te wees as een van die −2 of −3 posisies nie Y was nie. Gevolglik het ons effens meer sny met T waargeneem as V by posisie −4, wanneer posisie −2 en −3 óf is RY of YR (Fig. 5D bane 7 tot 10). R by posisie −2 het ook bepaal dat posisie −3 Y sal wees (100% fig. S6). Soos getoon in Fig. 5D, het die BvCas12-stelsel duidelike sny op 5'-TTTN-3' of TYTN gedemonstreer (Fig. 5D). Ons data het voorgestel dat beide VeCas9 en BvCas12 'n stel ontspanne PAM-reekse gehad het wat omvattend deur DocMF vasgelê is.

(A) PAM-wiel vir VeCas9. Die boonste geel blokkie gee 'n aanduiding oor elke posisie van die PAM-volgorde, en die pyltjie illustreer die oriëntasie van elke basis. Die oppervlakte van 'n sektor van die ring vir een basis by een spesifieke posisie verteenwoordig sy frekwensie by hierdie posisie. (B) PAM-wiel vir BvCas12. (C) In vitro-validering van VeCas9 PAM-wielresultate. NYARRMY is die konsensusvolgorde gebaseer op posisionele frekwensie, terwyl ACAAGCC 58ste VOO-gerangorde volgorde is wat as 'n positiewe kontrole ingesluit is. (D) In vitro-validering van BvCas12 PAM-wielresultate. NNNTTTN of NNNTYTN is die konsensusvolgorde gebaseer op posisionele frekwensie, terwyl AATTTTG 70ste VOO-gerangorde volgorde is wat as positiewe kontrole ingesluit is. NC (negatiewe beheer): positiewe PAM's geïnkubeer met ooreenstemmende proteïen maar sonder enige sgRNA.

DocMF kan proteïenbindingsplekke akkuraat identifiseer

Proteïen-DNA-interaksies is gekenmerk in baie hoë-deurset-platforms, insluitend mikroskikkings, HT-SELEX en CHAMP (4, 11). Ons het die DocMF-werkvloei wat hierbo genoem is gewysig om proteïen-DNA-bindende motiewe op te spoor. Die stappe het onveranderd gebly totdat die natuurlike komplementêre string hersinteteer is om 50-bp dsDNA te vorm en geëtiketteer is met fluoresserende kleurstowwe. Nadat ons die proteïen van belang aan sy dsDNA-teikens gebind het en enige oormaat afgewas het, het ons die eerste beelde verkry om seinintensiteit op te teken. Na hierdie eerste beelding is 'n on-chip inkubasie met MDA reaksie buffer, dNTP's en 'n polimerase met sterk string verplasing uitgevoer by 30°C vir 30 minute om 'n tweede komplementêre string te sintetiseer deur die ssDNB as sjabloon te gebruik (fig. S1). Gevolglik sou die oorspronklike fluoresserende string vervang en van DNB's verplaas word, wat lei tot seindaling wanneer daar geen proteïenbinding was om MDA te voorkom nie. Om hierdie idee te toets, het ons 'n goed bestudeerde proteïen, dCas9, gebruik en die endonuklease-aktiwiteit daarvan verwyder deur puntmutasies in sy endonuklease-domeine HNH en RucV (17). Die puntmutasies D10A en H840A het twee belangrike residue vir endonuklease-aktiwiteit verander, wat uiteindelik lei tot die deaktivering daarvan. Alhoewel dCas9 nie endonuklease-aktiwiteit het nie, bly dit in staat om te bind aan sy gRNA en die DNA-string wat geteiken word omdat die binding deur sy REC1-, BH- en PI-domeine bemiddel word (30). Boonop is daar voorheen gewys dat dCas9 nie aan sy teikenvolgorde bind wanneer daar geen PAM (NGG) teenwoordig is nie (31). Anders as die studies hierbo, is die lesings met fluoressensievouverandering onder die drempel as positief beskou, wat die DNB's aandui wat dCas9 kon herken en bind. Daarbenewens het ons 'n negatiewe kontrolebaan sonder dCas9-inkubasie in dieselfde proses ingesluit, aangesien BGISEQ-500 twee bane op 'n enkele skyfie het. Ongeveer 95% van 'n totaal van 253M lees vanaf die negatiewe beheerbaan het die helfte van die seinintensiteit verloor (data nie gewys nie). Ons het 'n seinverandering by 0,5 as drumpel gekies (prent 2/prent 1) en het onderskeidelik 14,371,289 van 335,497,075 en 15,647,574 van 337,529,837 lesings van eksperimentele en kontrolebane herwin. Ons het 'n betroubare relatiewe bindingsterkte-konsep bekendgestel om die bindingsterkte vir elke 7-nt-reeks te evalueer. Net so is die data aan die 5′-kant wat by 'n normale verspreiding pas, as agtergrondgeraas beskou, en die drie sigma-reël is aangeneem om die afsnypunt by 0.135 te definieer. Nadat ons die geluide afgetrek het, het ons opgemerk dat die NGG-volgorde noodsaaklik was vir dCas9 se binding (Fig. 6), in ooreenstemming met vorige bevindings. Dit dui daarop dat met die gewysigde DocMF, werkvloeie ingespan kan word as 'n algemene hulpmiddel vir die identifisering van DNA-bindende motiewe.

(A) Die relatiewe bindingssterkte aan beide die 5′-punt en die 3′-kant vir dCas9. Die X as is alle kombinasies van 7-nt-reekse en word outomaties volgens letter gesorteer met behulp van Excel. (B) Volgorde-logo vir dCas9 is gegenereer deur alle bespeurde 7-nt-reekse gebaseer op dié met die hoogste relatiewe bindingssterkte.


Metielblou-kleuring op gis

Die metileenblou-kleuringsprosedure word gebruik om gis lewensvatbaarheid te meet gebaseer op die aanname dat die metileenblou die selle sal binnedring en afgebreek word deur lewende gisselle wat die ensieme produseer wat metileenblou afbreek, wat die selle kleurloos laat. Die nie-lewensvatbare selle produseer nie hierdie ensiem (of ensieme) nie en as sodanig word die metileenblou wat die selle binnedring onverbreek en veroorsaak dat die selle gekleur bly (die geoksideerde vorm konsentreer intrasellulêr).

Die gekleurde en kleurlose selle word dan getel met 'n hemositometer en die aantal lewensvatbare en nie-lewensvatbare selle word in 'n gegewe area bepaal, die resultaat sal dan gebruik word om die aantal selle in die oorspronklike monster te skat.

Dit is 'n maklike, vinnige en goedkoop metode om die hoeveelheid lewensvatbare gis in 'n monster te bepaal, alhoewel dit om 'n aantal redes nie die beste metode is nie. A major reason is that methylene blue rapidly becomes toxic to the yeast and as such preparations should be examined within 10 minutes of preparation.

The older the cells become, the less likely that they are to take up the methylene blue dye from solution since as the yeast age, they deposit lipid and/or sugar in their cell membrane (in the form of free sterols[predominantly ergosterol and zymosterol with minor portions of lanosterol and fecosterol] and phospholipids[phosphotidylcholine and phosphotidylethanolamine with minor portions of phosphotidylinositol, phosphotidylserine and phosphotidyl-glycerol]) as a survival mechanism to protect their internal mechanisms from the buildup of waste in the external environment.

This means that cells which are not viable would not take up the dye and due to their age and not their ability to break down the methylene blue (as a result of their viability) would remain colourless and be determined to be viable (a false positive). The test itself is also not very accurate since yeast might not be evenly distributed in the original sample and depending on the sample taken for determination , may yield higher or lower viability counts than are really present in the original sample.

This viability count and cell count is absolutely essential since the yeasts are the producers of the ethanol through the breakdown of sugars (catabolism of sugars by glycolysis to pyruvate, which is then converted to CO2 and ethanol) present in the wort/must (the pitching rate is a measure of the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation). These processes can only be performed by viable yeast cells and consequently the greater the umbers of viable yeasts in the sample, the higher the rate of ethanol production. The expected yield of ethanol (alcohol) can also be calculated based on the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation (along with the sugar present in the wort). This is very important in industrial alcohol production to determine the required alcohol content of the final product and the viability of the yeast pitched must be greater then 85% or it is not used.


Pioneering technique paves way for fast and cheap fabrication of rapid medical diagnostic tools

Example 100-micron wide 3D-printed microchannel scaffolds, shown next to a 20p coin - the cost to print 1000 of these channels. Credit: University of Bristol

New technology developed by the University of Bristol has the potential to accelerate uptake and development of on-chip diagnostic techniques in parts of the world where rapid diagnoses are desperately needed to improve public health, mortality and morbidity.

Microfluidic devices underpin lab-on-a-chip (LOC) technologies which are developed to provide the rapid diagnoses at that are needed at point of care (POC) for the swift and effective treatment of many diseases.

Researchers at Bristol have developed a fast, reliable and cost-effective alternative for producing the soft-lithographic moulds used for fabricating microfluidic devices, published in the journal PLOS ONE. This discovery means fabrication of microfluidic devices (with channel dimensions

width of a human hair) is now both accessible and affordable using simple, low-cost 3-D-printing techniques and the open-source resources developed by the team.

"Previously, techniques for producing the soft-lithographic scaffolds/moulds (microfluidic channel patterns) were time-consuming and extremely expensive, while other low-cost alternatives were prone to unfavourable properties. This development could put LOC prototyping into the hands of researchers and clinicians who know the challenges best, in particular those in resource-limited settings, where rapid diagnostics may often have the greatest impact," said lead author of the study, Dr. Robert Hughes.

Dye-mixing inside a microfluidic chip made using 3D-printed interconnecting channel scaffolds. Credit: University of Bristol

"This technique is so simple, quick & cheap that devices can be fabricated using only everyday domestic or educational appliances and at a negligible cost (

0.05% of cost of materials for a single microfluidic device). This means researchers and clinicians could use our technique and resources to help fabricate rapid medical diagnostic tools, quickly and cheaply, with minimal additional expertise or resources required," said co-author, Mr Harry Felton.

"The simplicity and minimal cost of this technique, as well as the playful click-and-connect approach developed, also makes it suitable for hobbyists and educational use, to teach about microfluidics and the applications of lab-on-a-chip technology," said co-author Ms Andrea Diaz Gaxiola.

"It is our hope that this will democratise microfluidics and lab-on-a-chip technology, help to advance the development of point-of-care diagnostics, and inspire the next generation of researchers and clinicians in the field," said Dr. Hughes.

Simplified flow-diagram of the low-cost technique for fabricating microfluidic devices. Resulting channels can be applied directly to a glass surface with no additional treatment. Credit: University of Bristol

The next step for the team is to identify potential collaborators in both research and education to help demonstrate the impact this technology could have in both settings by developing and supporting outreach activities and applications for on-chip diagnostic testing.


Science works in strange ways. The experiment, which requires a few basic metal materials and a small digital clock, also calls for an uncooked spud and America's least expensive coin -- the penny. After setting up an electrical circuit with the objects, the potato's natural acidity interacts with the penny's copper to complete one half of this natural "battery's" circuit.

Science fair students, like real scientists, should work to gain consent from people before including them in an experiment.


Affiliasies

Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Young Hwang, Aoife M. Roche, Abigail Glascock, Susan R. Weiss, Yize Li, Louis J. Taylor & Frederic D. Bushman

Department of Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Jevon Graham-Wooten & Ronald G. Collman

Department of Genetics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Leila Haddad, Peter Deraska, Caitlin Monahan, Andrew Kromer & Arupa Ganguly

Department of Emergency Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Department of Biochemistry and Biophysics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA


Be safe and follow some simple rules

  • Never use the same pots and utensils for dyeing that you use for cooking.
  • Wear rubber gloves and use a face mask when measuring mordants and dyes.
  • Work in a well ventilated area.
  • Dispose of used mordants and dye baths safely.

Well there you have it. A simple and practical guide to the use of mordants and fixitives in your natural dyeing products!

Whilst all this talk may seem a little off-putting at first, hopefully you now see how simple and fun the whole affair really is!

But… if you’re still feeling a bit shell shocked, do consider my Natural Dyeing Bootcamp. I cover 4 stunning natural dyeing projects in detail that don’t require mordants or fixatives at all!

Not sure where to get started? Check out my 30 day Natural Dyeing Boot Camp! Try It Now



Kommentaar:

  1. Mogul

    Ek dink baie interessante onderwerp. Ek stel voor jy bespreek dit hier of in PM.

  2. Akiba

    Die volgende keer vra ek u om aandag te gee aan die onderwerp van die blog en nie met so 'n pos oor kleinighede versprei te word nie. Anders sal ek jou nie lees nie.

  3. Tabbart

    Wel, ek het al so iets gesien

  4. Garton

    Ek stem saam, die merkwaardige boodskap

  5. Akinogore

    Dit is jammer dat ek nie nou kan praat nie - baie besig. Osvobozhus - maak seker dat u mening oor hierdie kwessie is.



Skryf 'n boodskap