Inligting

Hoe kan ek 'n geen in 'n plasmiedvektor kloneer met 'n N-terminaal his merker en TEV splitsingsplek tussen die merker en die begin van die volgorde?

Hoe kan ek 'n geen in 'n plasmiedvektor kloneer met 'n N-terminaal his merker en TEV splitsingsplek tussen die merker en die begin van die volgorde?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek is 'n wetenskaplike wat aansienlike ervaring in chemie het, maar is relatief nuut in molekulêre biologie en biochemiese tegnieke. Ek probeer om 'n geïsoleerde domein van 'n proteïen (166 residue, 19,5 kDa) te maak met 'n N-terminale His-merker en 'n TEV-knipplek tussen die His-merker en die N-terminus van die domein. Die doel is om die eienskappe van die domein in isolasie te bestudeer, maar sonder enige etikette wat met die funksie daarvan kan inmeng. Die gebruik van die His-tag sal maak vir maklike suiwering, waarna die merker verwyder kan word met TEV protease, wat slegs 'n glisien by die N-terminus van die domein laat, wat nie my eksperimente op 'n noemenswaardige manier sal beïnvloed nie.

Die manier waarop ek dit te werk gegaan het, is om 'n voorwaartse primer te gebruik wat, na die beperkingsplek en beginkodon, die volgorde bevat wat kodeer vir die his-merker, gevolg deur die TEV-splytingsvolgorde, gevolg deur die eerste 6 kodons van die domein volgorde. Die omgekeerde primer bevat die finale 6 kodons van die domeinvolgorde gevolg deur 'n stopkodon en beperkingsplek. Hierdie primers word gebruik om die teikendomeinvolgorde te amplifiseer vanaf 'n plasmied wat die volle proteïenvolgorde bevat, maar met die N-terminale kliefbare merker aangeheg. Die plan is dan om hierdie DNA-insetsel in 'n pET21b-vektor te kloneer om in DH5alfa / BL21-selle te transformeer.

Dit lyk egter asof ek probleme ondervind tydens PCR om die volgorde van die domein vanaf die sjabloon-DNA te versterk. Nadat ek my gesuiwerde PCR-produk in die pET21b-vektor gekloneer het, en suksesvol in DH5a-selle getransformeer het, het die opeenvolging van die gedeelte van die gekloonde plasmied met die insetsel aan die lig gebring dat die invoeging-DNS slegs uit die voorwaartse en omgekeerde primer-volgordes op die punte bestaan ​​het, wat 'n enkele alanien ingebou het. kodon. Anders gestel, die ingevoegde volgorde lees as (His-tag)-(TEV-knipplek)-(Eerste 6 kodons van domein)-(Enkel Ala-kodon)-(Laaste 6 kodons van domein). Dit sou beteken dat al my kloningsstappe goed was, maar die invoeg-DNA is tydens PCR verkeerd gekopieer. As dit net die primer-punte was, sou ek dink daar was 'n soort oorvleueling tussen die primer-volgorde, maar daar is daardie een alanien van die domeinsjabloon-DNA (alanien is die volgende oorblyfsel na die eerste 6 in die domeinvolgorde). 'n Vreemde resultaat, en ek is nie seker waar om te begin met die oplos van probleme nie.

My vraag is, is daar iets wat ek in hierdie prosedure doen wat as besonder problematies kan uitstaan ​​wat hierdie probleem kan veroorsaak? Of meer algemeen, is daar 'n beter manier om 'n TEV-protease-splitsbare sy merker op die N-terminus van 'n proteïen te plaas? Enige raad sal help, al is dit net om in die rigting van nuttige verwysings of protokolle te wys, en ek verduidelik graag soos nodig. Dankie!


Kloning

Die geen van belang moet gewoonlik geamplifiseer word vanaf genomiese of vektor DNA deur PCR (polimerase kettingreaksie) voordat dit in 'n uitdrukkingsvektor gekloneer kan word. Die eerste stap is die ontwerp van die nodige onderlaag.

Primer volgorde. Veral die 3'-kant van die primer molekule is krities vir die spesifisiteit en sensitiwiteit van PCR. Dit word aanbeveel om nie te hê nie:

  • 3 van meer G of C basisse op hierdie posisie. Dit kan nie-spesifieke uitgloeiing van die onderlaag stabiliseer.
  • 'n 3' timidien, aangesien dit meer geneig is tot mispriming as die ander nukleotiede.

Primer-pare moet nagegaan word vir komplementariteit aan die 3'-kant. Dit lei dikwels tot primer-dimeer vorming.

Basisse aan die 5'-punt van die primer is minder krities vir primer annealing. Daarom is dit moontlik om volgorde-elemente by te voeg, soos beperking plekke, aan die 5'-punt van die primer molekule.

Onderlaag lengte. Gewoonlik 'n onderlaag lengte van 18-30 basisse is optimaal vir die meeste PCR-toepassings. Korter primers kan lei tot amplifikasie van nie-spesifieke PCR produkte.

Smelttemperatuur (Tm). Die spesifisiteit van PCR hang sterk af van die smelttemperatuur (Tm) van die primers (die temperatuur waarteen die helfte van die primer aan die sjabloon uitgegloei het). Gewoonlik word goeie resultate verkry wanneer die Tmse vir beide primers is soortgelyk (binne 2-4 °C) en bo 60°C. Die Tm vir 'n onderlaag kan geskat word deur die volgende formule te gebruik:

GC inhoud. Die GC-inhoud van 'n onderlaag moet tussen wees 40 en 60%.

Ontwerp van die 5'-einde onderlaag

Die 5'-einde primer oorvleuel met die 5'-end van die geen van belang en moet die volgende elemente bevat:

  • Beperkingsterrein. Die beperkingsplek moet dieselfde wees of dieselfde taai punt verskaf aan die eerste van die beperkingsensieme in die veelvuldige kloningsplek van die vektor wat gekies is om die geen van belang in te kloneer. Alternatiewelik kan jy enige beperkingsensiem kies wat 'n stomp punt gee by splitsing (sien kloning). Dikwels Nee ekCCATGG) of Nde I (KATATG) word gekies omdat die ATG binne hierdie terreine kan direk gebruik word om die ATG-beginkodon en/of die ATG-kodon vir die N-terminale metionienresidu te skep (sien Benutting van die Nco I-kloningsplek)
  • 5'-uitbreiding na die beperkingsterrein. Beperkingsensieme klief DNA baie minder doeltreffend teen die einde van 'n fragment. 'n 5'-verlenging van die beperkingsplek met 2-10 basisse verhoog die splitsingsdoeltreffendheid van die meeste ensieme aansienlik. Data oor die effek van die verlengingslengte en -volgorde op die splitsingsdoeltreffendheid van die mees gebruikte beperkingsensieme kan gevind word in die verwysingsbylaag van die New England Biolabs-katalogus.
  • Begin kodon. 'n Beginkodon (gewoonlik ATG) moet ingesluit word wanneer die geen van belang nie met 'n N-terminale merker of samesmeltingsvennoot uitgedruk word nie of wanneer 'n N-terminale metionienresidu teenwoordig is. Daar moet gekontroleer word dat die beginkodon en die geen van belang in raam is met 'n uiteindelike N-terminale merker en/of samesmeltingsvennoot.
  • Oorvleuel met the geen van belang. Die oorvleueling tussen die primer en die geen van belang moet lank genoeg wees om 'n T te geem van 60°C of meer (bereken soos hierbo getoon).

Merkers vir stabiliteit en oplosbaarheid

Wat is van die struikelblokke om te oorkom om 'n rekombinante proteïen te ooruitdruk? Dit is gewoonlik nie in 'n sel se beste belang om 'n proteïen te ooruitdruk nie. Energie en sellulêre hulpbronne word bestee om iets te maak wat die sel nie hoef te maak nie. Eukariote en sommige bakterieë ontplooi proteosome om af te breek wat die sel dalk as rommelproteïen beskou. Alhoewel daar 'n aantal chemiese en peptied-gebaseerde proteosoom-inhibeerders is, kan glutathione S-transferase (GST), wat saamgesmelt kan word met rekombinante proteïene vir een-stap suiwering met glutathion, ook teen proteolise beskerm.

Dit is een vorm van onstabiliteit. Prokariote kan ook moeilik eukariotiese proteïene vou. Jy kan jou bakterieë kry om massiewe hoeveelhede proteïen te produseer, maar as dit nie reg gevou is nie, het dit geen sin om dit te kristalliseer of die funksie daarvan te toets nie. Klein ubiquitin-verwante wysiger (SUMO) kan help met vou en stabilisering, so ook maltose-bindende proteïen (MBP). Ooruitdrukking kan ook lei tot onoplosbaarheid, en geaggregeerde proteïen is nie bruikbare proteïen nie. MBP-etikette kan help met oplosbaarheidskwessies, maar wetenskaplikes kan ook kies om kleiner proteïene by te voeg, soos Thioredoxin A (TrxA) wat disulfiedbindingsvorming verbeter om te help om jou proteïenoplosbaar te hou.


Wetenskaplikes is mal oor Addgene

Addgene was vir ons 'n besonder nuttige hulpbron, beide omdat hulle vertrou kan word om ons plasmiede doeltreffend aan ander laboratoriums te verskaf, en omdat ons self voortdurend reagense van belang bestel wat ander laboratoriums gedeponeer het. Hou aan met die goeie werk!

Dr. Anjana Rao La Jolla Instituut vir Immunologie
(La Jolla, CA)

Ons optogenetiese instrumente is besig om deur die neurowetenskap te spoel, en help wetenskaplikes om uit te vind hoe die brein werk. Sonder Addgene om dit aan die wêreld te help verskaf, sou neurowetenskap teen 'n baie stadiger pas beweeg.

Dr. Ed Boyden Massachusetts Instituut vir Tegnologie
(Cambridge, MA)

Weet van 'n wonderlike plasmied-instrument
is dit nie in ons versameling nie?

Laat weet ons sodat ons kan voortgaan om nuttige hulpbronne by die bewaarplek te voeg!


Hoe kan ek 'n geen in 'n plasmiedvektor kloneer met 'n N-terminaal his merker en TEV splitsingsplek tussen die merker en die begin van die volgorde? - Biologie

Prent: Geïllustreerde plasmiedkaart in PNG-formaat

GenBank-lêer: Plasmiedvolgorde en aantekeninge. Gebruik teksredigeerder of plasmied kartering sagteware om volgorde te sien.

SnapGene-lêer: Plasmiedvolgorde en SnapGene verbeterde annotasies. Gebruik met SnapGene-sagteware of die gratis Viewer om bykomende data te visualiseer en ander rye in lyn te bring.

Addgene volledige volgordekaart vir OmpA3-PNGaseF-TEV-His6

Neem asseblief kennis: Jou blaaier ondersteun nie die kenmerke wat op Addgene se webwerf gebruik word nie. Jy sal dalk nie 'n rekening kan skep of plasmiede deur hierdie webwerf kan versoek totdat jy jou blaaier opgradeer nie. Leer meer

Neem asseblief kennis: Jou blaaier ondersteun nie ten volle sommige van die kenmerke wat op Addgene se webwerf gebruik word nie. As jy enige probleme ondervind om te registreer, te deponeer of te bestel, kontak ons ​​asseblief by [email protected] Kom meer te wete


Keuse van vektor

Die basiese argitektuur van 'n E. coli-uitdrukkingsvektor word in die figuur hieronder getoon en bevat die volgende kenmerke:

Kiesbare merker. In die afwesigheid van selektiewe druk gaan plasmiede van die gasheer verlore. Veral in die geval van baie hoë kopiegetal plasmiede en wanneer plasmiedgedraagde gene giftig is vir die gasheer of andersins sy groeitempo aansienlik verminder. Die eenvoudigste manier om hierdie probleem aan te spreek is om vanuit dieselfde plasmied 'n antibiotika-weerstandmerker uit te druk en die medium aan te vul met die toepaslike antibiotika om plasmiedvrye selle dood te maak. Die mees gebruikte antibiotika en hul effektiewe konsentrasies word in tabel 1 gelys.

Die gebruik van ampicillien vereis spesiale sorg. Die selekteerbare merker, b-laktamase, word in die medium afgeskei waar dit al die ampicillien hidroliseer. Hierdie punt word reeds bereik wanneer die kultuur skaars troebel is. Van hier af sal selle wat nie die plasmied het nie, nie doodgemaak word nie en kan dit die kultuur oorgroei. Sommige moontlike oplossings is:

  • kweek oornagkulture by 30°C of minder.
  • spin oornagkulture en hersuspendeer die korrel in vars medium om die geproduseerde b-laktamase te verwyder.
  • gebruik die meer stabiele karbenisillien in plaas van ampicillien.

Regulerende geen (onderdrukker). Baie promotors toon lekheid in hul uitdrukking d.w.s. geenprodukte word op lae vlak uitgedruk voor die byvoeging van die induseerder. Dit word 'n probleem wanneer die geenproduk giftig is vir die gasheer. Dit kan voorkom word deur die konstitutiewe uitdrukking van 'n onderdrukkerproteïen.

Die lac-afgeleide promotors is veral lekkend. Hierdie promotors kan beheer word deur die invoeging van 'n lac-operateur volgorde stroomaf die promotor en die uitdrukking van die lac-onderdrukker deur gasheerstamme wat die lac q alleel (vir medium kopiegetal plasmiede) of van dieselfde of 'n helperplasmied (vir hoër kopiegetal plasmiede). Alternatiewelik kan onderdrukking bewerkstellig word deur 1% glukose by die kweekmedium by te voeg.

Oorsprong van replikasie. Die oorsprong van replikasie beheer die plasmiedkopiegetal.

Promotor. Die promotor inisieer transkripsie en is 10-100 nukleotiede stroomop van die ribosoombindingsplek geposisioneer. Die ideale promotor vertoon verskeie gewenste kenmerke:

  • Dit is sterk genoeg om produkophoping tot 50% van die totale sellulêre proteïen moontlik te maak.
  • Dit het 'n lae basale uitdrukkingsvlak (d.w.s. dit word streng gereguleer om produktoksisiteit te voorkom).
  • Dit is maklik om te veroorsaak.

'n Uitgebreide lys van moontlike promotors word in tabel 2 gegee. Die mees gebruikte promotors word in rooi aangedui.

Transkripsie terminator. Die transkripsieterminator verminder ongewenste transkripsie en verhoog plasmied- en mRNA-stabiliteit.

Shine-Delgarno volgorde. Die Shine-Dalgarno (SD)-volgorde word benodig vir translasie-inisiasie en is komplementêr tot die 3'-kant van die 16S ribosomale RNA. Die doeltreffendheid van translasie-inisiasie by die beginkodon hang af van die werklike volgorde. Die konsensusvolgorde is: 5'- TAAGGAGG -3'. Dit is 4-14 nukleotiede stroomop die beginkodon geposisioneer met die optimale spasiëring 8 nukleotiede. Om die vorming van sekondêre strukture (wat uitdrukkingsvlakke verminder) te vermy, moet hierdie streek ryk wees aan A-residue.

Begin kodon. Beginpunt van vertaling. In E coli die mees gebruikte beginkodon is ATG. GTG word in 8% van die gevalle gebruik. TTG en TAA word skaars gebruik.

Merkers en samesmeltingsproteïene. N- of C-terminale samesmeltings van heteroloë proteïene aan kort peptiede (merkers) of aan ander proteïene (samesmeltingsvennote) bied verskeie potensiële voordele:

  • Verbeterde uitdrukking. Fusie van die N-terminus van 'n heteroloë proteïen aan die C-terminus van 'n hoogs-uitgedrukte fusievennoot lei dikwels tot hoë vlak uitdrukking van die samesmeltingsproteïen.
  • Verbeterde oplosbaarheid. Fusie van die N-terminus van 'n heteroloë proteïen aan die C-terminus van 'n oplosbare samesmeltingsvennoot verbeter dikwels die oplosbaarheid van die samesmeltingsproteïen.
  • Verbeterde opsporing. Versmelting van 'n proteïen aan óf terminus van 'n kort peptied (epitope tag) óf proteïen wat herken word deur 'n teenliggaam of 'n bindende proteïen (Western klad-analise) of deur biofisiese metodes (bv. GFP deur fluoressensie) maak voorsiening vir opsporing van 'n proteïen tydens uitdrukking en suiwering.
  • Verbeterde suiwering. Eenvoudige suiweringskemas is ontwikkel vir proteïene wat aan weerskante saamgesmelt is aan merkers of proteïene wat spesifiek aan affiniteitharse bind (sien tabel 3 en verwysings daarin).

Protease-splitsingsplek. Protease-splitsingsplekke word dikwels bygevoeg om 'n merker of samesmeltingsvennoot uit die samesmeltingsproteïen te kan verwyder na uitdrukking. Mees algemeen gebruikte proteases word in tabel 4 gelys. Splitsing is egter selde voltooi en dikwels word bykomende suiweringsstappe vereis.

Veelvuldige kloningswerf. 'n Reeks unieke beperkingsplekke wat jou in staat stel om jou geen van belang in die vektor te kloneer.

Stop kodon. Beëindiging van vertaling. Daar is 3 moontlike stopkodons maar TAA word verkies omdat dit minder geneig is tot deurlees as TAG en TGA. Die doeltreffendheid van beëindiging word verhoog deur 2 of 3 stopkodons in serie te gebruik.


Abstrak

Daar is gevind dat uitdrukking van rekombinante proteïene as samesmeltings met die eukariotiese proteïen ubiquitin die opbrengs van onstabiele of swak uitgedrukte proteïene aansienlik verhoog. Die voordeel van hierdie tegniek word verder versterk deur die beskikbaarheid van natuurlik voorkomende deubiquitilerende ensieme, wat ubiquitien uit die samesmeltingsproduk verwyder. Die veelsydigheid van die stelsel is egter beperk as gevolg van die gebrek aan 'n robuuste, maklik gesuiwerde deubiquitilerende ensiem. Hier rapporteer ons die ontwikkeling van 'n doeltreffende uitdrukkingstelsel, deur gebruik te maak van die ubiquitin-fusietegniek, wat gerieflike hoë opbrengs en maklike suiwering van outentieke proteïen moontlik maak. An Escherichia coli vektor (pHUE) is gekonstrueer vir die uitdrukking van proteïene as histidien-gemerkte ubiquitin-fusies, en 'n histidien-gemerkte deubiquitilerende ensiem om hierdie samesmeltings te splits is uitgedruk en gesuiwer. Die uitdrukkingsisteem is getoets met behulp van verskeie proteïene wat in grootte en kompleksiteit verskil. Hierdie resultate dui aan dat hierdie prosedure geskik sal wees vir die uitdrukking en vinnige suiwering van 'n wye reeks proteïene en peptiede, en moet vatbaar wees vir hoë-deurset toepassings.

Die uitdrukking van 'n gekloonde geen om groot hoeveelhede van sy proteïenproduk te isoleer, vereis 'n hoogs doeltreffende uitdrukkingstelsel waarin proteïen tot homogeniteit gesuiwer kan word, veral vir kristallografiese en terapeutiese doeleindes. Ongelukkig is hoëvlak uitdrukking van biologies aktiewe rekombinante proteïene, veral dié van eukariote, dikwels moeilik om te bereik. In reaksie op hierdie behoefte aan doeltreffende uitdrukking, het verskeie stelsels na vore gekom wat die samesmelting van die geen van belang stroomaf van 'n tweede geen behels om 'n samesmeltingsproteïen te produseer (Uhlen en Moks 1990). Hierdie strategie gee oor die algemeen betroubare hoë proteïenopbrengste en kan ook eenvoudige suiweringsmetodes toelaat as gevolg van die affiniteit van sekere samesmeltingsvennote vir 'n bepaalde ligand (Baker 1996). 'n Groot nadeel van hierdie benadering is die kovalente koppeling van die twee proteïene, waar die teenwoordigheid van die samesmeltingsvennoot die daaropvolgende gebruik van die verlangde proteïen kan voorkom of inmeng. Om hierdie probleem te oorkom, kan 'n protease-herkenningsplek tussen die twee saamgesmelte proteïene gekonstrueer word, maar dit behels die verandering van die N-terminus van die verlangde produk, wat lei tot die uitdrukking van 'n nie-outentieke proteïen (Butt et al. 1989). Verder is splitsing van die samesmeltingsproteïen selde volledig, wat 'n vermindering in proteïenopbrengs veroorsaak, en dit kan ook nie-spesifiek binne die saamgesmelte proteïen voorkom (Baker 1996).

'n Fusievennoot wat al vir 'n paar jaar gebruik word, is ubiquitin (Ub). Hierdie klein eukariotiese proteïen bied twee voordele. Eerstens, soos ander samesmeltingsvennote, bied dit 'n natuurlike opbrengsverhoging, en tweedens en uniek, kan die Ub-deel verwyder word deur hoogs spesifieke proteases bekend as deubiquitilerende ensieme (DUB's) wat nie nie-spesifieke volgordes klief nie en nie addisionele aminosure by die N-terminus van die proteïen van belang (Baker 1996 Hondred et al. 1999). Hierdie splitsing vind plaas presies na die finale glisienresidu by die karboksielterminaal van Ub, ongeag die aminosuur wat onmiddellik daarop volg, met die enigste uitsondering van prolien, wat ondoeltreffend gesplit word (Bachmair et al. 1986). Tot op datum was die belangrikste nadele van die Ub-fusietegniek geen eenvoudige affiniteitsuiwering vir Ub nie en geen geredelik beskikbare deubiquitilerende ensiem nie. Die meeste DUB's wat van verskeie spesies geïsoleer is, was relatief groot ensieme en probleme is ondervind met die uitdruk en suiwering van groot hoeveelhede, tesame met probleme om 'n stabiele DUB met algemene aktiwiteit teen 'n reeks samesmeltingsproteïene te vind (Varshavsky 2000).

Ons het 'n doeltreffende Escherichia coli-gebaseerde uitdrukkingstelsel waar die proteïen van belang uitgedruk word as 'n samesmelting met poli-histidien-gemerkte Ub, wat 'n eenvoudige een-stap suiwering van die samesmeltingsproteïen moontlik maak deur geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie (IMAC). Ons het ook 'n muis DUB, Usp2, ontwerp om 'n minimale katalities aktiewe deubiquitilerende domein te verskaf en dit uitgedruk en gesuiwer as poli-histidien-gemerkte proteïen. Die gemerkte protease laat die in vitro-splyting van Ub van die verlangde proteïen toe, sowel as die selektiewe verwydering daarvan uit die splytingsreaksie, tesame met die gekloofde Ub, enige ongesplitste samesmeltingsproteïen en enige saamgesuiwerde kontaminante, wat die verlangde proteïen as die enigste oplosbare produk laat. . Daar is gevind dat hierdie stelsel baie effektief en toepaslik is vir die uitdrukking van 'n wye reeks proteïene en peptiede, en behoort bruikbaar te wees vir hoë-deurset toepassings.


Stelselbiologie van bakterieë

Eric Botella,. Kevin M. Devine, in Methods in Microbiology, 2012

7.3 Hoë-deurset kloning en plasmied voorbereiding

Promotorsamesmeltings kan maklik met die hand gegenereer word in groepe van tot 24 konstrukte of roboties met behulp van hoë-deursetprosedures. Die LIC-prosedure wat hierbo uiteengesit is, leen hom goed tot outomatisering en hoë-deursettoepassing omdat stelle vorentoe-primers algemene 5'-uitbreidings het, asook die stelle omgekeerde primers (Au) et al., 2006 Fogg en Wilkinson, 2008). 'n Lys van teikenpromotorvolgordes word opgestel en versoenbare stelle PCR-inleidervolgordes met gebruiker-gespesifiseerde eienskappe word deur rekenaar gegenereer. Oligonukleotiede word verkry van kommersiële verskaffers in gevriesdroogde vorm in pare van 96-put blokke, die eerste wat die voorwaartse primers bevat, die tweede wat die omgekeerde primers bevat. Hanteringstappe word uitgevoer met 'n TECAN-robot (Tecan Group Ltd., Switserland). Oligonukleotiede word hersuspendeer en tot 20 pmol/μl verdun. PCR's om DNA-fragmente te amplifiseer word opgestel in 96-put-bakkies met putvolumes van 0,2 ml. Elke reaksie bevat 1 μl elk van die voorwaartse en omgekeerde primers, 48 ​​μl van 'n meestermengsel (wat dNTP's, MgSO bevat4, 10 × buffer en DNA-polimerase) en 25 ng chromosomale DNA. Nadat suksesvolle amplifikasie van DNA-fragmente van die korrekte grootte bevestig is ( 400 bp) deur gelelektroforese, word DNA-produkte gesuiwer deur gebruik te maak van die QIAGEN 96-put PCR-skoonmaakstel (QIAGEN, Crawley, VK) met die stappe wat op die TECAN-robot uitgevoer word, wat ook 'n vakuumspruitstuk bevat. Die konsentrasie van die gesuiwerde DNA word met behulp van 'n nanodrop-spektrofotometer bepaal. LIC enkelstring DNA oorhange (Figuur 1.1) word in 'n 96-put skinkbord gegenereer, wat by elke put 0,2 pmol van elke PCR produk, 2,5 eenhede LIC gekwalifiseerde T4 DNA polimerase ensiem (Novagen), 2 μl 10 × T4 polimerase gevoeg word buffer (Novagen, Darmstadt, Duitsland), 1 μl 100 mM dithiothreitol, en 2 μl 25 mM dTTP in 'n finale volume van 20 μl. Die plaat word vir 30 min by 22 °C geïnkubeer en die reaksie gestop deur hittebehandeling by 75 °C vir 20 min. Ongeveer 5 ng van elke T4 DNA-polimerase-behandelde PCR-produk word gemeng met ~ 15 ng lineêre pBaSysBioII met versoenbare LIC-punte (Botella) et al., 2010). Plasmied en insetsel word vir 'n minimum van 10 min uitgegloei en omskep in toepaslik E coli stamme. Twintig mikroliter van die transformasieselsuspensie van elk van die 96 putte word op 1 ml soliede Luria Bertani (LB) agarmedium met toepaslike antibiotika uitgeplaat, dit wil sê vier plate elk met 24 putte. Twee kolonies van elke agarput word in 1 ml vloeibare LB-medium in 96-put plate (putvolume 2 ml) opgetel en by 37 °C gekweek.

Plasmied DNA word geïsoleer met behulp van 'n QIAGEN 96-put miniprep kit, in stappe wat uitgevoer word op die TECAN robot met behulp van die vakuum manifold, soos gespesifiseer in verskaffer se instruksies. Die konsentrasie van die gesuiwerde plasmied word deur nanospektrofotometrie bepaal en invoegings word geverifieer deur DNA-volgordebepaling. Die suksessyfer vir die kloning van insetsels met korrekte volgordes was tipies 80% vir 'n 96-put plaat. Plasmiede wat transkripsionele samesmeltings kodeer, word getransformeer in B. subtilis volgens die prosedure van Anagnostopoulos en Spizizen (1961).


    &mdash Maak geenlewering van hoë doeltreffendheid aan feitlik alle seltipes en hele modelorganismes moontlik, wat lei tot hoë uitdrukkingsvlakke van afgelewerde gene. &mdash Laat gekoördineerde en doeltreffende mede-uitdrukking van twee gene met dieselfde promotor in 'n enkele vektor toe. Wanneer verslaggewer- en teikengene gelyktydig uitgedruk word, word biologiese aktiwiteite van die teikenproteïene minimaal beïnvloed. &mdash Hierdie nuwe multifunksionele proteïenmerker bind kovalent en spesifiek aan 'n verskeidenheid sintetiese ligande, wat dit moontlik maak om gemerkte proteïene met fluorofore gemerk te word vir in vitro of in vivo beelding of met affiniteitsmiddels vir suiwering. &mdash Gebaseer op plekspesifieke in vitro of in vivo biotinylering van 'n kort merkervolgorde wat spesifieke of omkeerbare binding van avidien of streptavidien aan biotien moontlik maak vir immobilisering, suiwering en visualisering van die gemerkte teikenproteïene. &mdash Maak 'n hoë sukseskoers van teikenproteïenuitdrukking en natuurlike proteïenvou met 'n hoë persentasie aktiewe proteïene moontlik. Proteïene wat potensieel giftig is vir selle kan ook geproduseer word deur die selvrye sisteem te gebruik.

Vrywaring: Volgende-dag-versending is beskikbaar vir NextDay ORF-klone in bakteriese voorraadformaat. Lei tye vir NextDay ORF klone in gesuiwerde plasmied is

3-5 dae. Bestellings vir NextDay ORF-klone moet teen 12:00 EST Ma-Do ontvang word om die volgende dag verwerk en versend te word.


Materiale en Metodes

Stamme en groeitoestande

Escherichia coli stam DH5α is gebruik vir plasmied voortplanting en kloning tensy anders vermeld (groei in LB medium by 37ଌ, 200 rpm). Syn6803GT wat in hierdie studie gebruik word, is 'n nie-beweeglike spontane glukosetolerante mutant Syn6803. Dit kan in die donker groei in BG11-medium aangevul met tot 20 mM glukose (Williams, 1988), wat hierdie stam beide foto-outotrofies en heterotrofies laat groei. Syn6803M is 'n modelstam vir motiliteitstudies (Bhaya et al., 1999). Syn6803 stamme is gekweek onder 25 㯎 m -2 s -1 deurlopende beligting by 30ଌ in BG11 vloeibare medium met skud (50 of 250 ml fles, 170 rpm) of op agarplate. Vir fotomixotrofiese groei is 5 mM glukose by die medium gevoeg. Wanneer die stam 'n plasmied bevat, is geskikte gepaste antibiotika by die volgende konsentrasies bygevoeg: 10 of 100 μg/ml Spectinomycin (Sp), 50 of 100 μg/ml Carbenicillin (Cb) en 25 of 50 μg/ ml Kanamisien (Km) vir Syn6803 en E coli, onderskeidelik. Stamme en plasmiede wat in hierdie studie gebruik word, word in Tabel 1 opgesom.

TABEL 1. Stamme en plasmiede wat in hierdie studie gebruik is.

Vir mikroskopie is kulture van Syn6803 wat die verskillende konstrukte dra, gekweek in 10 ml BG11-medium, aangevul met antibiotika vir 3 dae, en dan ingeënt in 50 ml medium in 'n 250 ml-fles wat begin met 'n aanvanklike optiese digtheid van OD730 = 0.1 (aangevul met antibiotika, 30ଌ, 170 rpm), dan gekweek vir 'n bykomende 3 dae tot die OD730 bereik 𢏂𠄲.5. Vir plasmiedkopiegetaltoetse is selle in stilstaande fase geneem, wat 𢏅 dae geneem het begin met 'n aanvanklike OD730 = 0.1.

Totale DNA-onttrekking vanaf Syn6803

Vyftig milliliter kultuur van Syn6803 is vir 5 dae gekweek, op watter tydstip die OD730 is 𢏂.5, dan versamel deur sentrifugering by 10 000 × g vir 10 min, vir totale DNA-isolasie. Selle is hersuspendeer in 500 μl TE buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0) in 2 ml skroefdopbuis (Thermo Fisher, Kat No. 3463). 0,5 g 0,1 mm deursnee glaskrale (SIGMA, Kat No. G1145-500G), 25 μl 10% natriumdodesielsulfaat (SDS), en 500 μl fenol𠄼hloroform𠄣isoamylalkohol 1, v/v) is bygevoeg en selle is ontwrig met behulp van 'n Biospec Mini-Beadbeater (Model 3110BX) met vier siklusse van maksimum spoed vir 30 s, met 2 min op ys tussen die siklusse. Die vloeistoffase is geskei deur sentrifugering by 14 000 × g vir 15 min, en die boonste waterige fase is met 'n gelyke volume fenol𠄼hloroform–isoamyl alkohol (25:24:1) onttrek. Die boonste waterfase is daarna nog twee keer met 'n gelyke volume chloroform:isoamielalkohol (24:1) onttrek. Die DNA is presipiteer met 1/10 volume 3 M natriumasetaat (pH 5.2) en twee volumes 100% etanol by -20ଌ vir etlike ure (of oornag). DNA is versamel deur sentrifugering by 4ଌ, 12 000 × g vir 10 min, die supernatant is weggegooi en die korrel twee keer gewas met 70% etanol. Na droging is DNS in water opgelos (Heidorn et al., 2011). DNA-konsentrasie is spektroskopies gekwantifiseer met die NanoDrop 1000.

PCR en Southern Blot

Tweehonderd nanogram totale DNS is as 'n PCR-templaat gebruik om te toets vir spesifieke plasmied-teenwoordigheid met behulp van die primers gelys in Tabel 2. Twee pare primers, DB148 en DB149, en DB150 en DB151, is ontwerp om spesifieke amplicons 392 bp en 778 te amplifiseer bp lank, onderskeidelik, vanaf die plasmied pCA2.4. Twee pare primers, DB152 en DB153, en DB154 en DB155, is ontwerp om spesifieke amplikone van onderskeidelik 701 bp en 645 bp lank vanaf plasmied pCB2.4 te amplifiseer. Drie pare primers is ontwerp gebaseer op die volgorde van plasmied pCC5.2. DB156 en DB157 amplifiseer die 651 bp-streek tussen posisie 147 en 797 bp vir gebruik as DNA-hibridisasie-sonde 1 DB158 en DB159 amplifiseer die 787 bp-streek tussen 1273 en 2059 bp en DB160 en DB160 en DB161 902-gebied 3 en DB161 902-gebied 3 en bp1 as DNA hibridisasie probe 2. 'n 660 bp fragment van 16S rRNA is geamplifiseer met primer paar DB554 en DB555 en gebruik as 'n positiewe kontrole vir beide PCR en DNA hibridisasie (probe 3). Al hierdie probes is gegenereer vanaf PCR-amplifikasie met behulp van Syn6803GT totale DNA as die templaat. Drie pare primers wat verskillende streke van pSCB-YFP dek (DB239 en DB159, DB160 en DB161, en DB187 en DB188) is ontwerp om Syn6803-ekskonjugante deur PCR te skerm vir die teenwoordigheid van pSCB-YFP. Nog 'n stel PCR-primers DB245 en DB246 (amplikoonlengte: 856 bp) wat die gebied van pSCB-YFP dek E coli replikasie oorsprong pMB1, is gebruik as DNA hibridisasie sonde 4. PCR is uitgevoer met behulp van Phusion Hot Start II DNA polimerase (Thermo Fisher, Kat No. F549L) met aanvanklike denaturering by 98ଌ vir 2 minute, daarna 30 siklusse met 98ଌ denature 15 s, 58ଌ uitgloeiing 30 s, 72ଌ verlenging van 15 tot 30 s volgens PCR produk grootte, met 'n 72ଌ finale uitbreiding stap van 5 min.

TABEL 2. Oligonukleotiede wat in hierdie studie gebruik is.

Alle DNA-hibridisasie-probes is gemerk met GE Healthcare Amersham Gene Images AlkPhos Direct Labeling and Detection System-stel, waaronder probe 1 en probe 2 gebruik is om die teenwoordigheid van plasmied pCC5.2 vas te stel, en probe 2 en probe 4 is gebruik om te skerm vir pSCB-YFP-plasmied in Syn6803M-ekskonjugante. Probe 3 wat met die 16S rRNA geen gehibridiseer het, is as kontrole in beide toetse gebruik. Alle probes wat in hierdie studie gebruik is, was hoogs spesifiek vir teikenfragmente. NCBI-ontploffing wat hierdie probes gebruik het, het geen nie-spesifieke belynings gegenereer nie. Vir DNA-hibridisasies is 2 μg van oornag ensiem-verteerde totale DNA op 1% agarose gels gelaai en teen 6 V/cm vir 2 uur gehardloop. Verskillende ensieme is gebruik vir die DNA-verterings, EcoRV is gebruik vir plasmied pCC5.2, PstI is gebruik vir plasmied pSCB-YFP, en HindIII is gebruik vir Syn6803 genomiese DNA (Chen et al., 2016a). Southern klad-hibridisasie is uitgevoer met behulp van GE Healthcare Amersham Gene Images AlkPhos Direkte Etikettering en Opsporingstelsel en Amersham CDP-Star Opsporingsreagensstelle.

Konstruksie Voorbereiding

Die pSCB-YFP-pendelvektor is uit vier fragmente saamgestel. Hierdie fragmente is verkry deur PCR of gesintetiseer deur Integrated DNA Technologies (IDT) met 20 bp oorvleuelende rye van naburige fragmente vir Gibson-samestelling (Gibson et al., 2009). Die pCC5.2 plasmied ORFb wat 2916 bp is insluitend 5′ en 3′ onvertaalde streke (257 en 69 bp, onderskeidelik) is geamplifiseer deur gebruik te maak van primers DB202 en DB203. 'n Fragment wat die oorsprong van replikasie (pMB1) en bevat bom site (oriT) vanaf pBR322 is geamplifiseer deur gebruik te maak van primers DB241 en DB242. Die bom plek is behou om te verseker dat die pendelvektor konjugatief met die helperplasmied pGJ28 getransformeer kan word. Die aadA geen wat Sp-weerstand verleen, is geamplifiseer met primers DB213 en DB214 met behulp van plasmied pPZP200 as 'n templaat. pSCB-YFP Sintese fragment wat die MCS bevat, die Trc1O-promotor (Huang et al., 2010), die sintetiese ribosoombindingsplek (RBS) (BBa_B0034), YFP (BBa_E0030), en die terminator (BBa_B0015) is gesintetiseer deur IDT (Aanvullende Figuur 1). Die komponente van RBS, YFP en terminator wat begin met “BBa_” is geneem uit iGEM Registry of Standard Biological Parts 1. Die vier fragmente is saamgestel deur Gibson-samestelling (NEB, Kat. No. E2611L). Die hele saamgestelde pendelvektor is geverifieer deur volgordebepaling deur gebruik te maak van primers (pSCB-YFP-seq1 tot 11) getoon in Tabel 2. Die pSCB-YFP konstruk is verteer deur XbaI en Spel wat versoenbare taai ente gegenereer het, en geligeer met T4 ligase. Dit het die pSCB-konstruk gegenereer wat geverifieer is deur volgordebepaling met behulp van primer DB243. pSCB wat nie die YFP-verslaggewergeen bevat nie, is gebruik as 'n negatiewe kontrole vir konfokale mikroskopie om YFP-fluoressensie te ondersoek. Vir die generering van die uitdrukkingsvektor pSCBe, is pSCB-YFP verteer met NotI en Spel as die plasmiedruggraat, dan is die pSCBe-MCS fragment wat deur IDT met verskillende komponente gesintetiseer is (gedetailleerde aantekening in Figuur 3A) is saamgestel met plasmiedruggraat deur Gibson-samestelling, en dan geverifieer deur opeenvolging met primer DB243.

Vervoeging

Die vervoegingsprosedure was gebaseer op die metode wat deur Elhai en Wolk (1988) beskryf is. pGJ28 en pRL443 is onderskeidelik as helper- en konjugatiewe plasmiede gebruik. Al die Syn6803-ekskonjugante is op antibiotika-vrye LB-agarplate gekweek om die afwesigheid van E coli kontaminasie, en geverifieer deur volgordebepaling voordat hulle vir verdere eksperimentele prosedures in die studie gebruik is.

Leica TCS SP8 konfokale mikroskopie

Selle is waargeneem met die Leica TCS SP8 60x oliedoelwit. Die opwekking en emissie golflengte vir verskillende fluoresserende verslaggewers is gestel as chlorofil outofluoressensie (Bv: 550 nm Em: 650� nm) en YFP (Bv: 500 nm Em: 540� nm).

Fluoresensie-karakterisering deur 'n plaatleser

YFP fluoressensie is getoets met behulp van die TECAN Infinite M1000 PRO mikroplaatleser, met 360 rpm skud (2 mm amplitude) vir 10 s. Die YFP-verslaggewer was opgewonde by 515 ± 5 nm en emissie gemeet teen 530 ± 5 nm terwyl OD730 is ook gemeet vir normalisering. Vir elke monster is 120 μl van kultuur oorgedra in 'n Greiner 96 platbodem deursigtige polistireen mikroplaat (Sigma-Aldrich Kat. No: 655101). Elke monster is gemeet met behulp van drie biologiese en drie tegniese herhalings. Die YFP-seine van al die ekskonjugante is genormaliseer deur die sein deur OD te deel730 en die sein van die negatiewe beheer af te trek.

Plasmiedstabiliteittoetse en data-analise

Instandhouding van die plasmied in die afwesigheid van antibiotika seleksie is getoets op grond van die pendelvektor-onderhoudsprotokol in Syn7942 met 'n paar geringe wysigings (Chen et al., 2016b). The test was conducted at a similar stage (1-week-old cultures) because Syn6803 and Syn7942 have similar doubling times (between 7 and 12 h) (Bernstein et al., 2016). Cells with pSCB-YFP were grown in medium supplemented with Sp 10 μg/ml for 7 days, then inoculated into two flasks, each containing 50 ml of medium, one containing 10 μg/ml Sp, the other without antibiotic. Each treatment was performed for three biological replicates. Syn6803M that had no plasmid was used as the negative control. After 7 days of growth (OD730: 2.5𠄳), these cultures were tested for YFP fluorescence using a TECAN Infinite M1000 PRO Microplate reader. Each culture was used as a seed culture for the next iteration of the same procedure for 5 weeks.

Quantitative PCR to Assay Plasmid Copy Number

To measure the ratio of shuttle vector pSCB-YFP to chromosome copy number, we developed the following protocol. In order to minimize variability in the purification of genomic and plasmid DNA molecules that have different structures and sizes, we directly used clones as templates to assess the plasmid copy number, as follows. A 2 ml sample of each stationary phase culture was centrifuged at 13,000 × g for 10 min, and the pellet was suspended in 120 μl RNase/DNase-free water, and heated at 97ଌ for 10 min, then put on ice for immediate usage or at -20ଌ for long-term storage. Real-time quantitative PCR (qPCR) was used to assay the ratio of plasmid to chromosome copy number in these crude extracts. The ratio was calculated based on the equation:

Two target regions were selected, one is on pSCB-YFP ORFb (DB423 and DB424) which generated a 122 bp amplicon the other is on the β-lactamase gene (bla) (DB419 and DB420) which is located on pPMQAK1-GFP and generated an 81 bp amplicon (Lee et al., 2006) two reference genes were selected from the chromosome (Pinto et al., 2012), petB (DB219 and DB220) which is single copy and generated a 179 bp amplicon, and the 16S rRNA gene (DB231 and DB232) which has two copies and generated a 190 bp amplicon. SensiFAST TM SYBR No-ROX kit from BIOLINE (Cat. No. BIO-98020) was used for qPCR. All primers are listed in Table 2. qPCR was performed on Roche LightCycler ® 480 Multi-well in 96-well plates covered with Optical Sealing Foils (Roche Cat. No. 04729749001). Data analysis was conducted based on LinRegPCR software (Ruijter et al., 2009). The PCR efficiencies were calculated from the algorithm of LinRegPCR which can bypass the need for standard curve method to calculate PCR efficiencies. All primer pairs showed PCR efficiencies from 0.93 to 0.94. The average signal used for plasmid copy number ratio calculation was the extracted N0 value which is the target quantity or starting concentration per sample expressed in arbitrary fluorescence unit. All reported results are from two biological and three technical replicates.


Gevolgtrekkings

In this work, a new vector, pCPD, was developed for overexpression of recombinant proteins with a C-terminal fusion to CPD-tag inducible by InsP6 to remove itself by autoprocessing. This new vector has several advantages over previous CPD-fusion vectors that depended on classical restriction enzyme gene insertion [8]. First, the backbone vector pMCGS58 provided a site for easy insertion of genes for protein expression by LIC or by recombination methods such as Gibson Assembly® and rare codons genes ileX en argU for improved success in protein expression. The pCPD vector was initially tested for two target proteins that had previously proven difficult to purify due to small size and insolubility, MLD and KRas, respectively. Interestingly, pCPD was shown to increase significantly the solubility of KRas1–169. Intrinsic and GAP stimulated GTP hydrolysis of KRas1–169-GAAL was equally active to KRas1–169 purified with an N-terminal 6xHis-tag. In addition, the developed purification protocol can be easily applied to a high yield-high purity, two-step production scale purification strategy of Ni-NTA followed by SEC. Strategies for single step purification and cleavage could also be developed and useful when protein yield and purity are not as essential as they are in structural determination and biochemical assessment.

The vector pCPD was then further modified to contain ccdB cassette in order to increase cloning efficiency. Using a pilot set of 40 proteins, the CPD-tag was unexpectedly shown to increase the rate of success for expression and solubility of recombinant proteins by 23% when compared with proteins expressed with a TEV protease cleavable 6xHis-tag. Thus, pCPD and pCPD/ccdB are excellent options both to be implemented as a first line approach to recombinant protein expression and solubility, or as a side-by-side alternative to standard TEV protease cleavable tags for successful recombinant protein production.