Inligting

Uitsluiting Limiet en deurlaatbaarheid van buitenste membraan

Uitsluiting Limiet en deurlaatbaarheid van buitenste membraan



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Volgens hierdie handboek:

P aeruginosa, byvoorbeeld, wat uiters bestand teen antibakteriese middels is, is die buitenste membraan 100 keer minder deurlaatbaar as dié van E coli.[pg.no 27]

en dan op dieselfde bladsy:

Die poriene van verskillende spesies het verskillende uitsluitingsgrense, wat wissel van molekulêre gewigte van ongeveer 600 in E coli en S typhimurium tot meer as 3000 in P aeruginosa.

Hoe kan P. aeruginosa minder deurlaatbaarheid as E. coli hê, as sy uitsluitingslimiet groter is as dié van E.coli?


My poging:

Hierdie bron beweer dit

OprF voorsien P. aeruginosa buitenste membraan met 'n uitsluitingslimiet van 500 Da.

Dit (500 Da.) is naby aan dié van E. coli se 600 Da., so hoe is dit uiters bestand?


Druk die bakteriese koevert

4.2.4 Buitemembraanvesikels en bakteriese spoke

Buitemembraanvesikels (OMV's) en bakteriese spoke (BG's) is asellulêre afgeleides van die gram-negatiewe omhulsel wat die ouersel se oppervlak-uitgedrukte proteïene bevat [77-79]. OMV's bestaan ​​uit buitemembraan-afgeleide bilamellêre vesikels, 50-250 nm in deursnee, wat voortdurend uitgebrei word deur die groei van gram-negatiewe bakterieë [77]. Doeltreffende oppervlakvertoning op OMV's is bereik deur passasierproteïene aan die E coli toksien ClyA, wat tydens vesikulasie op hierdie strukture gekonsentreer word [80]. OMV's het besondere nut as entstofafleweringsvoertuie omdat hulle stabiel is tydens langdurige berging [81] en sterk immunogenies is (as gevolg van die baie immunostimulerende komponente van die OM wat hierdie vesikels behou), maar nie dieselfde omgewingsveiligheidsgevare as ongeskonde selle inhou nie. omdat hulle nie in staat is om voort te plant nie (sien Raam 4.1 ) [82–84] .

BG's, in teenstelling, is volledige gram-negatiewe bakteriële koeverte wat geproduseer word deur heteroloë uitdrukking van die bakteriofaag-afgeleide lisis-geen E (Figuur 4.2). By uitdrukking plaas Proteïen E in die IM via sy N-terminus, terwyl die C-terminale domein oor die IM translokeer (Figuur 4.2A) en integreer in die OM (Figuur 4.2B), wat samesmelting van die twee membrane veroorsaak. Proteïen E-oligomerisasie lei tot die vorming van 'n "lisis tonnel" (Figuur 4.2C), waardeur die sitoplasma ekstrasellulêr vrygestel word. As gevolg van die beheerde aard van die litiese gebeurtenis en die effektiewe seël tussen IM en OM, word selomhulselmorfologie en periplasmiese inhoud egter gehandhaaf [78]. Mees algemeen word ankering van vreemde proteïene op BG'e bewerkstellig deur samesmelting van passasiers met die buitenste membraanproteïen, OmpA. Ten slotte, soos OMV's, is BG's uitstekende voertuie vir entstoflewering as gevolg van hul kragtige immunostimulerende eienskappe en onvermoë om te repliseer [85,86].

Figuur 4.2 . Skematiese voorstelling van Proteïen E-geïnduseerde lise en BG generasie. (A) Die N-terminale domein van Proteïen E plaas in die IM en die C-terminus translokeer na die periplasma. (B) Die C-terminus integreer dan in die OM om samesmelting met die IM te veroorsaak. (C) Laastens oligomeer Proteïen E om die lysistonnel te vorm.

Bron: Aangepas uit Langemann et al. [78] .


Uitsluiting Limiet en deurlaatbaarheid van buitenste membraan - Biologie

JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1992, p. 5196-5203

0021-9193/92/165196-08$02.00/0 Kopiereg © 1992, Amerikaanse Vereniging vir Mikrobiologie

Herevaluering, met behulp van ongeskonde selle, van die uitsluitingslimiet en rol van Porin OprF in Pseudomonas aeruginosa Buitemembraanpermeabiliteit FRANCIS BELLIDO, NANCY L. MARTIN, RICHARD J. SIEHNEL, EN ROBERT E. W. HANCOCK*

Departement Mikrobiologie, Universiteit van Brits-Columbië, 300-6174 University Boulevard, Vancouver, Bnitish Columbia, Kanada V6T 1Z3 Ontvang 25 Maart 1992/ Aanvaar 9 Junie 1992

Vroeëre studies wat modelmembraanrekonstitusiemetodes gebruik het, het tot verskillende gevolgtrekkings gekom oor die uitsluitingslimiet van die buitenste membraan van Pseudomonas aeruginosa en of OprF die belangrikste kanaalvormende proteïen in die buitenste membraan is. In hierdie studie is 'n 6.2-kbp Sall fragment, wat slegs twee sitoplasmiese ensieme, a-galaktosidase en sukrose hidrolase, en die binnemembraan raffinose permease kodeer, gekloneer agter die m-toluaat-induseerbare tol promotor van vektor pNM185 om plasmied pFB71 te skep. P. aeruginosa-stamme wat pFB71 bevat, het, wanneer dit met induseerder gekweek is, beide ensieme geproduseer wat deur die insetsel gekodeer is en het die vermoë verkry om op die disakkaried melibiose en die trisakkaried raffinose te groei. Die groeitempo was afhanklik van die konsentrasie en grootte van die sakkaried en is drie- tot vyfvoudig verminder deur die afwesigheid van OprF, soos ondersoek deur die groei op melibiose en raffinose van 'n isogeniese OprF-tekort Q-invoegingsderivaat, H636(pFB71) te meet. ). By hoë konsentrasies kon di-, tri- en tetrasakkariede oor die buitenste membraan beweeg om P. aeruginosa te plasmoliseer, soos gemeet deur ligverstrooiing en bevestig deur elektronmikroskopie. Die aanvanklike tempokinetika van ligverstrooiingsveranderinge was afhanklik van die grootte van die sakkaried wat gebruik word. Verder was die tempo van verandering in ligverstrooiing as gevolg van raffinose en stagiose opname oor die buitenste membraan vir stam H636 vyfvoudig of meer laer as vir sy OprF-voldoende ouer H103. Hierdie data stem ooreen met modelmembraanstudies wat toon dat OprF die mees oorheersende pornografie is vir verbindings groter as disakkariede in P. aeruginosa en dui daarop dat die uitsluitingslimiet vir hierdie porien en die buitenste membraan groter is as die grootte van 'n tetrasakkaried. Daarbenewens het hierdie data die bestaan ​​van ander poriene met 'n oorheersende funksie in monosakkariedopname en 'n mindere funksie in die opname van groter sakkariede bevestig.

Die buitenste membrane van gram-negatiewe bakterieë soos Pseudomonas aeruginosa is deurlaatbaarheid hindernisse geperforeer deur water gevulde kanale wat die grootte uitsluiting limiet vir hidrofiliese verbindings bepaal (9, 22). Hierdie kanale word gevorm deur 'n klas transmembraanproteïene wat poriene genoem word (9, 22). Die porien-proteïen F (wat later hernoem is tot OprF) van P. aeruginosa is geïsoleer en in liposome hersaamgestel en in ewewigtoetse (waarvoor die deurdringingstempo nie oorweeg is nie) getoon om kanale te vorm wat deurlaatbaar was vir dekstrane met deursnee van tot 2 nm (11). Daarteenoor is gevind dat Escherichia coli en Salmonella typhimurium onder dieselfde toestande poriene besit wat tetrasakkariede (deursnee, 1.17 nm) uitsluit (11, 16). Die data vir P. aeruginosa porien OprF het aanvanklik gelyk of dit data weerspreek wat aandui dat hierdie bakterie 'n hoë mate van intrinsieke weerstand teen antibiotika het in vergelyking met E. coli en S. typhimuium (11), asook daaropvolgende data wat toon dat P. aeruginosa het lae buitemembraanpermeabiliteit (2, 17, 37). Aangesien OprF 'n oorvloedige proteïen in P. aeruginosa was, is voorgestel dat, ten spyte van sy groot kanaaluitsluitingslimiet, OprF swak funksioneer in die opname van substrate soos antibiotika (5, 11). Resultate wat ooreenstem met hierdie voorstel is verskaf deur beide swart lipied dubbellaag (5) en liposoom-swelling (19, 38) model membraan studies. Twee afsonderlike hipoteses is voorgestel om die swak funksionering van OprF-kanale te verduidelik. Dit was molekulêre heterogeniteit, met individuele OprF-molekules *

met óf groot kanale (frekwensie van 99%) (32), en die spesifieke geometrie van OprF-kanale (19). Sedert 1986 het Nakae en medewerkers 'n reeks referate vervaardig wat tot die gevolgtrekking gekom het dat die P. aeruginosa buitenste membraan die opname van selfs disakkariede verhoed (8, 33-36), dat OprF nie 'n porien is nie (8, 36), en dat die werklike poriene van P. aeruginosa is drie proteïene genaamd C, D en E (36). Die metodologieë wat gebruik is om tot hierdie gevolgtrekkings te kom, het beide liposoom-swelmetodologieë (8, 35, 36) en plasmolise-eksperimente (25, 26) behels. Alhoewel elkeen van hierdie studies spesifiek gekritiseer is op grond van gebrekkige metodologie (18, 19, 27), is dit ontstellend dat dieselfde tegniek, dit wil sê liposoom swelling, in die hande van twee verskillende groepe, aanleiding kan gee tot sulke verskillende resultate (36, 38). Daarbenewens het OprF-tekorte stamme wat deur chemiese (8, 17) of molekulêre genetiese (30) middels gegenereer is óf geen verandering óf klein veranderinge in antibiotika vatbaarheid gehad nie en het dus nie die gevolgtrekking ondersteun dat OprF die belangrikste porienproteïen van P. aeruginosa is nie . Aan die ander kant, is voorgestel dat hierdie gebrek aan verandering in antibiotika vatbaarheid te wyte is aan die aansienlike veranderinge in sel deurlaatbaarheid, vorm en groei eienskappe as gevolg van die rol van OprF in

buitenste membraan en selstruktuur (8, 31). Daarom het ons besluit om hierdie probleem te heroorweeg deur in vivo eksperimentele protokolle te gebruik om potensiële artefakte wat deur modelmembraanstudies veroorsaak word, uit te skakel. Die resultate wat verkry is, dui daarop dat die buitenste membraan van P. aeruginosa die deurdringing van suikermolekules so groot soos raffinose ('n trisakkaried) of

stachyose ('n tetrasakkaried) en stel verder voor dat OprF

Ooreenstemmende skrywer. 5196

is die belangrikste maar nie noodwendig die enigste kanaal wat betrokke is by die opname van hierdie sakkariede nie. MATERIALE EN METODES Bakteriële stamme, plasmiede en groeitoestande. P. aeruginosa PAO1 ouksotrofiese stam H103 (30) is as die OprF-bevattende wildtipe stam gebruik. P. aeruginosa H636 was 'n oprF::fQ-afgeleide van stam H103 wat geskep is deur geenvervanging met 'n fl-fragment-gemuteerde oprF-geen (30). E. coli DH5a F' [F' end41 hsdRl7 (rK- mK+) supE44 thi-1 recAl gyrA96 real X- +80dlacZAM15 A(lacZYA argF) U169] (30) is vir primêre kloning gebruik, terwyl E. coli SM10 (28) ), wat 'n gemuteerde RP1-plasmied bevat wat in die chromosoom geïntegreer is, is gebruik vir biouerlike paring van plasmiede van E. coli tot P. aeruginosa. E. coli DS25-91 (lacY melB metB rpsL raf?) (3) wat die raffinose benutting bevat, 130-kbp plasmied pRSD2-1 met 'n konstitutiewe mutasie is verkry van R. Schmitt (Lehrstuhl fuir Genetik, Universitat Regensburg, Regensburg, Duitsland ). 'n 6.2-kb SalI-fragment van pRSD2-1 (rafR [RafC] Tra+ InI) is volledig gevolgorde (GenBank-toetredingsnommer, M27273) en getoon dat dit slegs drie strukturele gene kodeer, rafA (oagalaktosidase), rafB (binnemembraan raffinosepermease) , en rafD (sukrosehidrolase), en 'n afgeknotte geen, raft ('n onderdrukkergeen) (3). Hierdie fragment is uit pRSD2-1 gesny en in die SalI-plek van die m-toluaat- of bensoaat-gereguleerde uitdrukkingsvektor pNM185 (Kmr Smr pmTOL mob' tra +) (15) ingevoeg om pFB71 te skep. Om 'n unieke SalT-plek in plasmied pNM185 te skep, moes 'n EcoRI-SalI-adapter in die unieke EcoRI-plek van hierdie plasmied ingevoeg word. Plasmied pFB71 is gebruik om E. coli SM10 te transformeer, met seleksie vir plasmied-spesifieke antibiotiese weerstandmerkers en groei op raffinose, en dan oorgedra na stamme H103 en H636 deur vervoeging, met behulp van die mob-funksie wat op die vektore (3, 7) en gekodeer is. tra-gene wat in die chromosoom van SM10 ingevoeg is (28). Stamme is gereeld gekweek op Luria-bouillonmedium (0.8% Bacto Tryptone, 0.5% gisekstrak), wat 150 mM NaCl bevat, gestol wanneer toepaslik met 2% (gew/vol) Bacto-agar (30). Vir eksperimente wat groei op spesifieke koolstofbronne behels het, is E. coli-stamme op AB-minimaal medium (6) gekweek, terwyl P. aeruginosa-stamme op BM2-minimaal medium (2) gekweek is. Vir groei-eksperimente is bakterieë wat tot middel-eksponensiële fase op minimale medium met glukonaat (P. aeruginosa) of gliserol (E. coli) as koolstofbron gegroei het, 1 uit 50 gesubkweek in voorafverwarmde vars medium wat die gespesifiseerde vlakke van sakkariede bevat en gekweek met skud by 37°C. Monsters (1 ml elk) is met gereelde tussenposes vir A6 geneem. metings. Vir meting van groei Km (dws die konsentrasie van koolstofbron wat die helfte van die maksimum groeitempo lewer), is die resiproke van die aanvanklike groeitempo's geplot teen die resiproke van die sakkariedkonsentrasies om lyne te gee met 'n korrelasiekoëffisiënt r wat oorskry 0.92 (dit moet daarop gewys word dat hierdie data slegs buitemembraanpermeasie weerspieël as hierdie gebeurtenis tempobeperkend is vir groei, soos aangevoer in verwysings 20 en 37 en hieronder). Groei Km-waardes is bereken vanaf die snypunt op die ordinaat-as (-l/Km). Raffinose en melibiose (>99.5% suiwer) is verkry vanaf Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.). Die gebrek aan beduidende kontaminasie deur kleiner sakkariede is aan die lig gebring deur die onvermoë van P. aeruginosa- en E. coli-stamme om op hoë vlakke van hierdie sakkariede te groei, tensy hulle die plasmied bevat

pFB71. Ligverstrooi-eksperimente. Selle gegroei in BM2 medium

PSEUDOMONAS AERUGINOSA PORIN

wat 10 mM glukonaat bevat is deur sentrifugering by 3 000 x g versamel en sagkens hersuspendeer in 10 mM MOPS (morfolienpropaansulfonsuur) buffer (pH 6.5) wat 5 mM MgCl2 en 300 mosM konsentrasies van 'n verskeidenheid suikers bevat. Ligverstrooiingsmetings is uitgevoer deur 1 ml van die selle in die kuvettehouer van 'n Perkin-Elmer 650-1OS Spektrofluorimeter te plaas met die emissie- en opwekkingsgolflengtes gestel op 600 nm en die spleetwydtes gestel op 2 nm. Ligverstrooiing in arbitrêre eenhede is deurlopend vir tot 60 min aangeteken. Elektronmikroskopie. Die selle is vir 30 min in 300 mosM glukose, melibiose, raffinose of staccyose met en sonder 10 mM KCN ​​geïnkubeer, waarna glutaaraldehied bygevoeg is tot 'n finale konsentrasie van 2.5%. Kontrole eksperimente het aan die lig gebring dat KCN nie die tempo van plasmolise beïnvloed het nie, soos aangedui deur ligverstrooiing eksperimente. Na 3 uur is die selle gewas en vir 2 uur in 1% osmiumtetroksied vasgemaak, in 'n etanolreeks (25, 50, 80, 95 en 100%) gedehidreer en dan in Araldite ingebed. Dun snitte is gesny met 'n Reichert Ultramicrotome OM U4 Ultracut, versamel op koolstofbedekte koperroosters, en nagekleur met uranielasetaat en loodsitraat. Alle monsters is ondersoek met 'n Zeiss EM 10C transmissie-elektronmikroskoop wat by 60 kV werk. Ensiemtoetse. Vlakke van sukrosehidrolase en a-galaktosidase-aktiwiteite is bepaal in eksponensieel gegroeide selle in die toepaslike minimale medium (Tabel 1) met of sonder induseerder (0.1 en 5 mM m-toluaat vir E. coli en P. aeruginosa, onderskeidelik). Ru-ekstrakte is berei deur die selle drie keer vir 30 s by 0°C te sonikerer met 'n klein sonde van 'n Fisher soniese disembrator (model 300) teen 'n relatiewe uitsetvlak van 35%. Sukrosehidrolase en a-galaktosidase aktiwiteite is gemeet soos elders beskryf (24, 25). RESULTATE EN BESPREKING Groei op raffinose. Woodruff en Hancock (30, 31) het voorheen voorgestel dat die groot strukturele defekte in die P. aeruginosa buitenste membraan, as gevolg van verlies van OprF in stam H636::Q, definitiewe gevolgtrekkings oor die rol van OprF in antibiotika vatbaarheid uitgesluit het. Verskeie antibiotika, insluitend 13-laktame, is voorgestel om deur die buitenste membraan te gaan deur nie-porienpaaie (10) te gebruik wat gedeeltelik kon vergoed het vir die verlies van die porienweg (30). Ons het egter geredeneer dat hidrofiliese oligosakkariede nie deur die buitenste membraan sal kan beweeg deur nie-porienpaaie te gebruik nie. Dus, as OprF werklik die belangrikste porien van P. aeruginosa was, behoort die verlies daarvan 'n verandering in groei Km vir sakkariede te veroorsaak. Ongelukkig is P. aeruginosa nie in staat om op enige sakkariede groter as 'n monosakkaried te groei nie, 'n resultaat wat 'n monosakkaried-uitsluitingslimiet vir die buitenste membraan kan weerspieël, soos voorgestel deur Yoneyama et al. (33, 34), of kan 'n gebrek aan geskikte ensieme weerspieël. Daarom het ons gepoog om die toepaslike metaboliese vermoëns te verskaf deur 'n raffinose-benuttingsoperon vanaf E. coli plasmied pRSD2-1 in P. aeruginosa te kloneer. Die 6.2-kb SalI-fragment wat gekloon is, is volledig gevolgorde en bevat slegs 'n deel van die rafR-gekodeerde onderdrukker bykomend tot die gene vir twee sitoplasmiese ensieme, cx-galaktosidase en sukrosehidrolase, en een integrale binnemembraanpermease (7). Oorspronklik is die fragment in die uitdrukkingsvektor pVDtac (6) agter die tac-promotor in plasmied pFB15 gekloneer. Alhoewel resultate analoog aan dié wat hieronder beskryf word verkry is (soos kortliks in verwysing 4 hersien), is die swak uitdrukking van die tac

TABEL 1. Sukrosehidrolase- en a-galaktosidase-aktiwiteite van E. coli DH5a(pFB71) en P. aeruginosa H103(pFB71) en H636(pFB71) a-galaktosidase-aktiwiteit (,umol p-nitrofenol vrygestel/min/mg proteïen)

Sukrose hidrolase aktiwiteit

(1tmol glukose vrygestel/min/mg proteïen)

Beheerde Melibiose Raffinose

1.6 ± 0.4 3.5 ± 0.4 4.9 ± 0.1 5.1 ± 0.9 2.6 ± 0.5 4.1 ± 0.6 9.3 ± 0.8 8.9 ± 0.2 3.3 ± 0.3 4.4 . DH toluaat as 'n induseerder. P. aeruginosa H103(pFB71) en H636(pFB71) kulture het 5 mM m-toluaat bevat

as 'n induseerder, aangesien 0.1 mM m-toluaat nie daarin kon slaag om waarneembare vlakke van enige ensiem te induseer nie. Vir E. coli DH5a(pFB71), was 5 mM m-toluaat toksies. Die konsentrasies van koolstofbronne wat gebruik is, was 50 mM glukonaat, gliserol en melibiose of 100 mM raffinose. I Beteken ± standaardafwykings van drie onafhanklike toetse van spesifieke aktiwiteit uitgedruk as mikromol glukose vrygestel per minuut per milligram proteïen by 3rC. Aangesien die ekstrakte wat gebruik is almal selafgeleide glukose bevat het, is agtergrondkonsentrasies (ongeveer 30 tot 40% van die gegewe getalle) in plasmiedvrye of nie-geïnduseerde kulture afgetrek. C Beteken ± standaardafwykings van drie toetse van spesifieke aktiwiteit uitgedruk as mikromol p-nitrofenol vrygestel per minuut per milligram proteïen by 37°C. d a-Galaktosidase-aktiwiteite is gemeet na groei op glukonaat, aangesien dit die kontrolekoolstofbron was wat in groei-eksperimente gebruik is. Glukonaat het egter inmeng met sukrosehidrolase-toetse, so dit is gedoen na groei in gliserol (E. coli) of suksinaat (P. aeruginosa).

promotor in P. aeruginosa in minimale medium (14) het gelei tot baie stadige groei op suikers en lang (10 tot 24 uur) vertragingstye. Daarom het ons die 6.2-kb SalI-fragment wat hierbo beskryf is, hergekloneer agter die m-toluaat-induseerbare tol-promotor in plasmied pNM185. Die resulterende plasmied pFB71 het E. coil DHSa toegelaat om a-galaktosidase en sukrosehidrolase onder induserende toestande uit te druk (Tabel 1) en om op raffinose te groei (Tabel 2). Na oordrag van plasmied pFB71 na P. aeruginosa H103, is aansienlike vlakke van beide sukrosehidrolase en ot-galaktosidase geïnduseer wanneer hierdie stam in suksinaat of glukonaat gekweek is met 5 mM m-toluaat bygevoeg (Tabel 1). Laer vlakke van toluaat (d.w.s. 0.1 mM) kon nie hierdie plasmiedenkodeerde ensieme induseer nie. Stam H103 wat die plasmied bevat het die vermoë verkry om op die disakkariede melibiose en raffinose te groei (Fig. 1), terwyl die plasmied-ontbrekende stam H103 (Fig. 1) of stam H103 wat die vektor pNM185 bevat (data nie getoon nie) nie. In teenstelling hiermee het plasmied pFB71 nie groei op glukonaat beïnvloed nie (Fig. 1). In ooreenstemming met hierdie waarnemings het stam H103(pFB71) wat op raffinose of melibiose in die teenwoordigheid van 5 mM m-toluaat as 'n induseerder gegroei het, hoë vlakke van beide sukrosehidrolase en a-galaktosidase geproduseer (Tabel 1). Verkryging van die vermoë van H103(pFB71) om op melibiose en raffinose te groei, het geïmpliseer dat beide di- en trisakkariede oor die buitenste membraan kon beweeg, aangesien die insetsel in pFB71 slegs 'n binnemembraanpermease en twee sitoplasmiese ensieme bevat het. In ooreenstemming met hierdie interpretasie was ons nie in staat om enige ensiemaktiwiteite in die sel-supermatant te identifiseer nie. Verder, by vaste konsentrasies van sakkariede (50 mM), stam H103(pFB71) TABEL 2. Groei Km op verskillende koolstofbronne vir E. coli en P. aeruginosa stamme bron

Glukonaat Melibiose Raffinose

het vinniger gegroei op die disakkaried melibiose as op die trisakkaried raffinose (Fig. 1), 'n bevinding wat geïnterpreteer word as deels die gevolg van die groottes van hierdie sakkariede relatief tot die groottes van porienkanale in die buitenste membraan. Om die rol van OprF in suikervervoer te toets, is plasmied pFB71 in die stam H636 ingebring, 'n OprF-defekte, Qt-invoegingsmutant van stam H103. H636(pFB71), gegroei in die teenwoordigheid van 5 mM m-toluaat as 'n induseerder, het vlakke van sukrosehidrolase en a-galaktosidase uitgedruk wat nie onderskeibaar was van dié van stam H103(pFB71) (Tabel 1). Stam H636(pFB71) het teen dieselfde tempo gegroei as stam H103(pFB71) op minimale glukonaatmedium oor 'n 50-voudige reeks glukonaatkonsentrasies (sien Fig. 3). Dit het voorgestel dat ander poriene as OprF oorheersend was in glukonaat deurgang oor die buitenste membraan. Daarteenoor het H636 (pFB71) stadiger gegroei as H103(pFB71) op beide raffinose (Fig. 2 en 3) en melibiose (Fig. 3). By groeitempo-beperkende konsentrasies was die groeitempo van die OprF-deficient mutant slegs 20% (vir raffinose) tot 33% (vir melibiose) dié van sy OprF-bevattende ouerstam, en

'n Groei Km. gedefinieer in verwysing 20, is die konsentrasie van koolstofbron wat lei tot 'n 50% maksimum groeitempo, geneem uit resultate soos dié getoon in Fig. 3. b As gevolg van die toksiese effek op P. aenrginosa groei van konsentrasies van raffinose van >200 mM, dit was nie moontlik om die groei Km akkuraat te bepaal in hierdie geval, waarvoor slegs drie datumpunte beskikbaar was nie (Fig. 3).

Tyd (ure) FIG. 1. Groei van P. aeruginosa H103 met (soliede lyne) of sonder (gebroke lyne) die raffinose-benuttingsplasmied pFB71. Groeisubstrate (by 50 mM) was glukonaat (sirkels), melibiose (driehoeke) en raffinose (vierkante).

PSEUDOMONAS AERUGINOSA PORIN

0.1 R_Q) 0 20 40 60 80 100 120 140

Tyd (ure) FIG. 2. Groei van stam H103(pFB71) (soliede lyn) en sy oprF::fl mutant H636(pFB71) (gebroke lyn) op 100 mM raffinose.

hierdie verskille was statisties betekenisvol (P 3MB Groottes 0 Aflaaie 0 Views


ASJC Scopus vakgebiede

  • APA
  • Skrywer
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standaard
  • RIS
  • Vancouver

In: Tydskrif vir bakteriologie , Vol. 136, No. 1, 01.12.1978, p. 381-390.

Navorsingsuitset : Bydrae tot tydskrif › Artikel › ewekniebeoordeling

T1 - Buitenste membrane van gram-negatiewe bakterieë. XIX. Isolasie van Pseudomonas aeruginosa PAO1 en gebruik in rekonstitusie en definisie van die deurlaatbaarheidsversperring

N2 - 'n Metode vir die skeiding van die buitenste en binneste membrane van P. aeruginosa PAO1 in die afwesigheid van bygevoegde etileendiamientetra-asynsuur is ontwerp. Die metode lewer twee buitenste membraanfraksies wat dieselfde proteïenpatroon toon op natriumdodesielsulfaat-poliakrielamiedgelelektroforese, maar wat aansienlik verskil in hul relatiewe inhoud van fosfolipiede. Een van hierdie buitenste membraanfraksies en die binnemembraanfraksie is minder as 4% kruisbesmet, soos beoordeel deur die inhoud van tipiese binne- en buitemembraanmerkers. Die buitenste membraan bevat vier hoofproteïenbande met oënskynlike molekulêre gewigte van 37 000, 35 000, 21 000 en 17 000. Vesikels wat hersaamgestel is uit lipopolisakkaried en fosfolipiede was ondeurdringbaar vir alle sakkariede wat in die vesikels ingesluit is tydens vesikelvorming. Wanneer die vesikels buitemembraanproteïene bevat het, het hulle slegs daardie sakkariede van meer as 9 000 molekulêre gewig ten volle behou, wat daarop dui dat die uitsluitingslimiet van die buitenste membraan van P. aeruginosa vir sakkariede aansienlik groter is as die syfer (500 tot 600 dalton) wat verkry is vir sekere enteriese bakterieë. Die voordele en potensiële nadele van 'n buitemembraan met 'n hoër uitsluitingslimiet vir hidrofiliese stowwe word bespreek.

AB - 'n Metode vir die skeiding van die buitenste en binneste membrane van P. aeruginosa PAO1 in die afwesigheid van bygevoegde etileendiamientetraasynsuur is bedink. Die metode lewer twee buitenste membraanfraksies wat dieselfde proteïenpatroon toon op natriumdodesielsulfaat-poliakrielamiedgelelektroforese, maar wat aansienlik verskil in hul relatiewe inhoud van fosfolipiede. Een van hierdie buitenste membraanfraksies en die binnemembraanfraksie is minder as 4% kruisbesmet, soos beoordeel deur die inhoud van tipiese binne- en buitemembraanmerkers. Die buitenste membraan bevat vier hoofproteïenbande met oënskynlike molekulêre gewigte van 37 000, 35 000, 21 000 en 17 000. Vesikels wat hersaamgestel is uit lipopolisakkaried en fosfolipiede was ondeurdringbaar vir alle sakkariede wat in die vesikels ingesluit is tydens vesikelvorming. Wanneer die vesikels buitemembraanproteïene bevat het, het hulle slegs daardie sakkariede van meer as 9 000 molekulêre gewig ten volle behou, wat daarop dui dat die uitsluitingslimiet van die buitenste membraan van P. aeruginosa vir sakkariede aansienlik groter is as die syfer (500 tot 600 dalton) wat verkry is vir sekere enteriese bakterieë. Die voordele en potensiële nadele van 'n buitemembraan met 'n hoër uitsluitingslimiet vir hidrofiliese stowwe word bespreek.


Bespreking

Die interessantste deel van die CymA-struktuur is die N-terminus, wat 'n mobiele element vorm wat in en uit die kanaallumen kan beweeg. Wat is die rol van die N-terminus, aangesien ons data aandui dat dit onontbeerlik is vir substraatbinding (Fig. 6)? Deur die kanaal te vernou, behou die N-terminale ~15 residue waarskynlik die deurlaatbaarheid van die OM, wat andersins gekompromitteer kan word. Vernouingselemente wat bestaan ​​uit ekstrasellulêre lusse wat na binne vou om die effektiewe deursnee van die loop te verminder, word gevind in OM-kanale wat bestaan ​​uit 16 of meer β-stringe soos OmpF (Fig. S1) (1). Daardie lusse is geneig om baie stabiel te wees omdat hulle baie interaksies met die binne-oppervlaktes van die loop of met ander lusse maak. In die geval van CymA, steek 'n relatief kort segment (die N-terminus) vanaf die periplasmiese kant in die kanaal in en tree in wisselwerking met die loopwand. Om insig te kry in die energetika van hierdie interaksie, het ons 'n eendimensionele potensiaal van gemiddelde krag berekening van die N terminus in wild-tipe CymA met behulp van metadinamika (14). Die resultaat toon dat die posisie van die N-terminus in die kristal ooreenstem met 'n vrye energie minimum (Fig. S8). Boonop vereis die beweging van die N-terminus in die periplasmiese ruimte die verbygaan van verskeie energieversperrings. Dus, om 'n oop kanaal te genereer, moet die interaksies van die N-terminus met die loop versteur word. Met inagneming van die feit dat slegs 'n beperkte aantal N-terminale oorblyfsels met die loopwand in wisselwerking is (Fig. 3)B), stel ons voor dat die CD-substraat wat afbeweeg vanaf die ingangsplek die dryfkrag vir kanaalopening kan verskaf, moontlik deur die suurreste van die kanaalwand wat in wisselwerking met die belangrike oorblyfsel Arg5 inwerk (Fig. 8). CymA kan dus as 'n ligand-gehekte OM diffusiekanaal beskou word. Toekomstige eksperimente en meer gedetailleerde molekulêre dinamika-simulasies sal vereis word om insigte te verkry in die verplasingsmeganisme van die N-terminus deur CD's en of ander molekules die kanaal kan oopmaak.

Skematiese model vir siklodekstrien vervoer deur CymA. (i) Die N-terminus van CymA (magenta) is binne die looplumen geleë. Arg5 in die N-terminus (+) tree in wisselwerking met karboksilaatgroepe van glutamiensuurreste (−) in die kanaalwand. (ii) Nadat die substraat vasgevang is deur die ingangsplek, roteer die CD-molekule om sy affiniteit vir die kanaal te verlaag en diffundeer verder. Die N-terminus word uit die loop verdryf deur versteuring van die interaksies van die N-terminus met die loopwand. (iii) By uitsetting van die N-terminus diffundeer die CD-molekule in die periplasmiese ruimte in.

Eendimensionele vrye energieprofiele (PMF) van die N-terminus langs die kanaal-as bepaal met behulp van goed getemperde metadinamika (14) geïmplementeer in PLUMED 2 (30). Die reaksiekoördinaatafstand word gedefinieer as die COM (massamiddelpunt) verskil tussen die N-terminus (Cα atome van residue 1–13) en die loop (Cα atome van residue 26–324) langs die kanaal-as. Drie verteenwoordigende momentopnames van die proteïen word getoon, insluitend die gekristalliseerde toestand van die N-terminus wat ooreenstem met die laagste energietoestand.

OM-diffusiekanale wat deurdringing van molekules groter as die OM-grootte-uitsluitingslimiet toelaat, is voorheen geïdentifiseer. In alle gevalle het die substrate egter strukture wat hulle toelaat om op 'n lineêre wyse deur die kanaal te beweeg, byvoorbeeld maltooligosakkaried deurgang deur E coli LamB (11). Ons studie toon nou dat lywige molekules soos CD's ook selle doeltreffend kan binnedring deur OM-diffusiekanale. Dit stel dan die vraag oor hoekom selle PMF-afgeleide energie spandeer om lywige substrate op te neem via TonB-afhanklike vervoerders. Soos CymA illustreer, is substraatgrootte nie die deurslaggewende faktor wat aktiewe vervoer noodsaak nie. Dit is eerder waarskynlik die behoefte om substraat baie styf te bind omdat dit skaars en/of waardevol is. Die eksterne energie-insette word benodig om die groot konformasieveranderinge te genereer wat nodig is vir substraatvrystelling. In die geval van TBDT's word substraatvrystelling gekoppel aan die vorming van 'n verbygaande kanaal in die periplasmiese ruimte. Daarenteen word die mobiele N-terminale vernouingsdomein van CymA waarskynlik verplaas deur die inkomende substraat, wat 'n elegante manier bied vir selle om lywige substrate op te neem sonder om die deurlaatbaarheidsversperring van die OM te benadeel.


Gevolgtrekkings

Samevattend kan gesê word dat die swart en wit prentjie van buitemembraanporieë—van bakterieë tot mitochondria en chloroplaste—as algemeen oop nie-selektiewe diffusieporieë met kleur gevul moet word: buitenste membrane behou die potensiaal van growwe beheer oor metabolisme deur die bestaan ​​van spesifieke gereguleerde kanaalvormende proteïene. Alhoewel in vitro eksperimente oor die effek van spanningsveranderinge is nuttig in die bestudering van ioonkanale, sulke hersaamgestelde stelsels bied 'n oorvereenvoudiging van wat werklik in die sel voorkom. Maar in vivo dit blyk dat opgeloste stowwe, metaboliete en proteïenagtige faktore verantwoordelik is vir kanaalpoort - wat opgeloste stowwe inlei of terughou deur die kommunikasieknoppie van die hek te druk. ’n Werkmodel van vervoer oor buitenste membrane word in Figuur 1 getoon.


Metodes

Selkultuur

Muskulus melkklierkankerselle (4 T1) is gekweek by 37 °C 5% CO2, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media aangevul met 10% v/v Fetale Bees Serum, 100 U/mL penisillien en 100 μg/mL streptomisien (ThermoFisher). Die selle is geoes met 0,5 ml/10 cm 2 tripsien deur sentrifugering by 180 x g, gewas met fosfaatbuffer sout (PBS), en getel met 'n NucleoCounter® NC-100™ (chemometect, Kopenhagen) volgens vervaardiger se instruksies. Die selle is gefixeer in 40 ml 4% w/v gebufferde formalien vir 24 uur by kamertemperatuur (RT).

Bakteriese groeitoestande

Escherichia. coli K12 MG1655 wat 'n P16Lux-plasmied [39] dra, is aërobies gekweek by 37 °C tot 'n OD600 van 0,8 in Luria-Bertani (LB) medium aangevul met 300 μg/ml Eritromisien en geoes deur sentrifugering by 3000 xg, vir 10 minute by 4 °C, gesuspendeer tot 'n 2X konsentrasie in 4% w/v gebufferde formalien vir 24 uur by RT.

Tel van vaste bakteriële selle

Bakteriële sel suspensies is getel volgens die instruksies van die bakteriese telstel (Invitrogen). In brief, after fixation, a 10% aliquot was taken from this suspension and serially diluted (100X) with filtered sterilised 0.15 M NaCl solution to obtain a cell density of approximately 1 × 10 6 cells in 989 μl of NaCl. Bacterial cells were stained with 1 μl of Syto® BC and 10 μl (1X 10 6 ) of counting beads were added to the suspension. Cells were counted in an LSR II Flow Cytometer (BD Biosciences, NJ, USA). The acquisition trigger was set to side scatter and set to 800.

Membrane permeabilisation assay

After fixation, 8 × 10 7 4 T1 cells were harvested at 180 x g for 10 min, washed once with 20 ml of Tris Buffer Saline (TBS) (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6), and suspended to a final density of 2.5 × 10 6 cells per ml in TBS. Similarly, 5 × 10 9 E coli cells, were harvested at 300 x g for 10 min, washed once with 20 ml of TBS and suspended to a final density of 2.5 × 10 7 cell per ml in TBS. 500 μl of the cell suspensions were aliquoted into 1.5 ml tubes and treated with a permeabilisation agent. Permeabilisation agents tested were: Triton X-100 (0.1% v/v), Tween-20 (0.2% v/v), Saponin (from Quillaia bark) (0.1% w/v) (S4521), Digitonin (D141) (0.5% w/v). All were acquired from Sigma-Aldrich. Concentrations used were derived from several protocols [6].

The cells were permeabilised for 25 min, at 25 °C, shaking at 500 rpm. Permeabilised cells were washed once with TBS (centrifugation speeds as above) and blocked on ice with TBS + 1% w/v Bovine Serum Albumin (BSA) for 30 min. Blocked cells were exposed to 0.75 μg of Cyanine-5 (Cy5) or Phycoerythrin (PE) labelled Streptavidin (SAv-Cy5, MW = 60 KDa or SAv-PE, MW = 360 KDa) (Biolegend, CA, USA) for 30 min at 25 °C, shaking at 280 rpm. Cells were washed with 1 ml of 0.15 M NaCl solution and resuspended in 350 μl of the same solution for analysis. Bacterial cells were also labelled with 1 μl of Syto® BC (Invitrogen) for 5 min and analysed by flow cytometry in a BD LSRII. 4 T1 cells were identified and gated based on their Forward/Side scatter and E coli cells were detected using the 488–1 (Fluorescein isothiocyanate - FITC), 525/50 filter for Syto® BC and gated using the side scatter. Cy5 positive cells were detected with the red 670/14 filter. PE positive cells were detected with the yellow/green 780/60 filter. For each experimental replicate, 3 × 10,000 events were recorded for 4 T1 cells and 3 × 100,000 for bacteria.

DNase screening

A screen to identify the DNase with the highest DNA depleting activity in a reaction buffer containing Qb-Saponin was performed. DNases tested were as follows: Recombinant DNase I [1-2 U, 1 μl] (Sigma-Aldrich), Turbo DNase [2 U, 1 μl] (Thermo-Fisher), Molysis DNase [2 μl] (Molzyme GmbH & Co, Bremen, Germany), RQ1 DNase [20 U, 20 μl] (Promega), Benzonase [75 U, 0.3 μl] (Sigma-Aldrich). 5 × 10 6 4 T1 cells, FF for 48 h were treated with 0.2% w/v Qb-Saponin and the DNases tested. Reactions were set in reaction buffers provided or suggested by the supplier for 20 min at 37 °C. The reaction was stopped by either: the addition of Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) for Benzonase, the supplied reaction Stop Buffer, or by incubating at 75 °C (DNAse I). Cells were then subject to DNA purification with the QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN). DNA yield was measured with Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen). All reactions were performed in triplicate. A no-DNAse control was included. This was incubated under the same conditions with buffer supplied for DNAse I, but without the nuclease.

Quillaja bark Saponin titration

Different w/v concentrations (0.1, 0.25, 0.5, 1%) were tested in 1 × 10 6 E. coli cells that were fixed, washed, permeabilised, blocked and imaged as described for membrane permeabilisation assay.

DNA depletion assay

Cells were fixed, washed and permeabilised as described for the membrane permeabilisation assay. 2.5 × 10 5 4 T1 or 2.5 × 10 6 E coli cells were permeabilised, blocked with 500 μl of 1% w/v BSA in TBS+ MgCl2 (20 mM Tris-HCL, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2, pH 8) for 30 min on ice. Blocked cells were treated with 1.5 μl (≥ 375 units) of Benzonase nuclease (Sigma-Aldrich) for 30 min at 37 °C, shaking at 360 rpm. Treatment was stopped by the addition of 100 mM EDTA. The cells were washed once with TBS and suspended in 0.15 M NaCl, where they were stained with 10 μM CytoPhase Violet (Biolegend) for 1 h at RT, shaking at 200 rpm in the dark. Bacterial cells were labelled with 100 μM of BacLight red (Invitrogen) for 15 min at RT, shaking at 200 rpm and analysed by flow cytometry. 4 T1 cells were identified and gated based on their Forward/Side scatter and E coli cells were detected using the 561 laser (Yellow/Green) 660/20 filter for BacLight red and gated using the side scatter. CytoPhase+ cells were detected with the 355 (UV) laser and 450/50 filter.

Confirmation of host depletion (HD) strategy

The efficacy of the combined treatment was verified by qPCR in DNA purified from a mixed cell suspension, consisting of 1 × 10 7 E coli cells and 1 × 10 4 4 T1 cells. Cells were incubated for 30 min at 37 °C, shaking at 360 rpm in TBS or the optimised HD buffer (0.2%w/v Qb-saponin, in TBS + MgCl2 (20 mM Tris-HCL, 20 mM NaCl, 2 mM MgCl2), pH 8) with or without 500 U of Benzonase. The treated cells were then processed for DNA purification following instructions of the QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN) and the purified DNA analysed by qPCR.

Quantitative PCR (qPCR)

Reactions were prepared using LUNA Universal qPCR master mix (NEB, USA) and 0.25 μM of each primer (Table 1). The thermal profile included an initial denaturation of 1 min at 95 °C, followed by 40 cycles of denaturation at 95 °C × 10 s, annealing for 15 s at the temperature specified by NEB’s annealing temperature (Ta) calculator for Hot Start Taq, followed by 20–40 s of extension at 68 °C. For each assay, a 5-point standard curve was made from log10 dilutions of gene blocks corresponding to species-specific genetic regions (Table 1), using an initial concentration of 10 7 copies. Primers and gene-blocks were acquired from IDT (Coralville, USA). Efficiency between 95 and 105% and R-square values > 0.995 were deemed as acceptable. All samples were run in triplicate.

Statistical analyses

Flow cytometry data was exported and analysed in FlowJo (BD, UK) and raw data exported to R. All statistical testing and visualisation were performed in the R environment (v3.6.3). Tests of normality were performed using the Shapiro-Wilk test. Tests of means were performed using paired samples T-Tests and Wilcoxon Signed Rank Tests as appropriate. The false discovery rate was controlled using the Bonferroni procedure. Data visualisation was performed using GGplot2 package (v3.2.1).


Structural basis for maintenance of bacterial outer membrane lipid asymmetry

The Gram-negative bacterial outer membrane (OM) is a unique bilayer that forms an efficient permeation barrier to protect the cell from noxious compounds 1 , 2 . The defining characteristic of the OM is lipid asymmetry, with phospholipids comprising the inner leaflet and lipopolysaccharides comprising the outer leaflet 1,2,3 . This asymmetry is maintained by the Mla pathway, a six-component system that is widespread in Gram-negative bacteria and is thought to mediate retrograde transport of misplaced phospholipids from the outer leaflet of the OM to the cytoplasmic membrane 4 . The OM lipoprotein MlaA performs the first step in this process via an unknown mechanism that does not require external energy input. Here we show, using X-ray crystallography, molecular dynamics simulations and in vitro and in vivo functional assays, that MlaA is a monomeric α-helical OM protein that functions as a phospholipid translocation channel, forming a

20-Å-thick doughnut embedded in the inner leaflet of the OM with a central, amphipathic pore. This architecture prevents access of inner leaflet phospholipids to the pore, but allows outer leaflet phospholipids to bind to a pronounced ridge surrounding the channel, followed by diffusion towards the periplasmic space. Enterobacterial MlaA proteins form stable complexes with OmpF/C 5,6 , but the porins do not appear to play an active role in phospholipid transport. MlaA represents a lipid transport protein that selectively removes outer leaflet phospholipids to help maintain the essential barrier function of the bacterial OM.

Three systems are known to maintain OM lipid asymmetry: the OM phospholipase A2 PldA 7 , the lipopolysaccharide (LPS) palmitoyl transferase PagP 8 and the Mla (maintenance of outer membrane lipid asymmetry) system. Only the Mla system maintains asymmetry directly via phospholipid extraction, while PldA and PagP both generate lysophospholipids in the outer leaflet that still require removal. The Mla system is conserved in Gram-negative bacteria and plant chloroplasts 9,10 , consisting of the inner membrane (IM) ABC transporter MlaBDEF, the periplasmic protein MlaC and the OM lipoprotein MlaA 4,6,11 . Phenotypes from defects in the Mla system are mild under laboratory conditions and require small-molecule OM stressors such as SDS/EDTA or antibiotics 4,5,6,11 . However, MlaA has been identified as a virulence factor in various bacteria 12,13,14,15 . In addition, the Mla system was recently shown to regulate outer membrane vesicle formation 16 . The deleterious effects of Mla knockouts probably result from phospholipid accumulation in the OM outer leaflet, forming bilayer patches that are portals for entry of lipophilic small molecules 17 . So far, structural information on Mla components is available only for MlaC and MlaD 5 . MlaC probably accepts a phospholipid from MlaA and shuttles it to the ABC transporter for ATP-dependent plasma membrane insertion 5 . MlaA is the most enigmatic Mla component, particularly since its identity as a periplasmically exposed lipoprotein appears hard to reconcile with its proposed activity on outer leaflet phospholipids.


Specific callose enzymes modulate plasmodesmal callose levels

Key genes that regulate callose levels specifically at plasmodesmata include members of the A. thaliana β-1,3-glucanase, AtBG_ppap (Levy et al., 2007) and PdBGs, as well as the A. thaliana callose synthase (CalS) family, encoded by CalS10/GSL8/CHORUS, CalS3/GSL12, CalS1/GSL6 of CalS8/GSL4. Mutasies in die PdBG1 of PdBG2 genes increase callose accumulation and perturb normal lateral root formation (Benitez-Alfonso et al., 2013). In cals10 mutants, callose deposition at the cell plate is abolished, causing seedling lethality and pleiotropic phenotypes that range from defects in cell division and guard cell patterning, to alterations in phototropic response and plasmodesmal permeability (Guseman et al., 2010 Han et al., 2014). Gain-of-function mutations in CalS3 increase callose levels and alter root development (Vatén et al., 2011). Mutations in CalS1 abolish the hyperaccumulation of callose induced by salicylic acid or pathogenic bacterial infection, while those in CalS8 eliminate the callose deposition induced by mechanical wounding or reactive oxygen species. Verder, cals8 mutants show an increase in basal plasmodesmal permeability compared to that found in wild-type plants (Cui and Lee, 2016). These data, together with the observations on additional proteins that are found at plasmodesmata (see below, Box 2 and poster), suggest that a network of callose-regulating factors control the permeability of plasmodesmal channels.

Receptor-like protein kinases that are important for controlling growth and developmental processes are partially associated with plasmodesmata (see poster). For example, the receptor-like kinase STRUBBELIG (SUB) and C2-domain-containing receptor-like protein QUIRKY (QKY) interact at plasmodesmata, which is thought to promote movement of unidentified intercellular factors needed for tissue morphogenesis (Vaddepalli et al., 2014). Similarly, the receptor kinases ARABIDOPSIS CRINKLY 4 (ACR4) and CLAVATA 1 (CLV1) interact at plasmodesmata in the root meristem to restrict root meristematic activity to only a few designated cells (Stahl et al., 2013).

A number of transcription factors move from cell to cell through plasmodesmata, including those that play important roles in cell type specification (see poster). KNOTTED 1 (KN1) moves from inner shoot apical meristem (SAM) tissue layers into overlying layers to establish meristematic cell identity and maintain the stemness of this tissue (Kim et al., 2002). LEAFY moves from the outermost SAM layer into inner layers to control the differentiation of vegetative cells into floral meristem cells (Sessions et al., 2000). WUSCHEL (WUS) moves from the SAM-organizing center into the central zone, where it maintains stem cell fate and number (Yadav et al., 2011). CAPRICE (CPC) is expressed in all non-hair root epidermal cells, but moves into the cells that will become root hairs to promote their differentiation (Kurata et al., 2005). SHORT ROOT (SHR) moves from root stele into neighboring endodermal cells to promote differentiation of the ground tissues (Nakajima et al., 2001). Signaling molecules that move through plasmodesmata also include those involved in defense signal propagation (see poster). For example, the lipid transfer protein AZELAIC ACID INDUCED 1 (AZI1) not only interacts with the plasmodesmal regulators PDLP5 and PDLP1, but also triggers systemic acquired resistance (SAR) in response to pathogen exposure. This in turn leads to symplasmic transport of the SAR signaling molecules azelaic acid (AzA) and glycerol-3-phosphate (G3P) (Lim et al., 2016). Another lipid transfer protein, DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1 (DIR1), has been found to move symplasmically into systemic tissue (Champigny et al., 2013). Taken together, these factors exemplify the variety of cellular signaling events that employ plasmodesmal communication.


Transport Across the Membrane

Alle stowwe wat deur die membraan beweeg, doen dit deur een van twee algemene metodes, wat gekategoriseer word op grond van of energie benodig word of nie. Passive (non-energy requiring) transport is the movement of substances across the membrane without the expenditure of cellular energy. During this type of transport, materials move by simple diffusion or by facilitated diffusion through the membrane, down their concentration gradient. Water gaan deur die membraan in 'n diffusieproses wat osmose genoem word. Osmosis is the diffusion of water through a semi-permeable membrane down its concentration gradient. It occurs when there is an imbalance of solutes outside of a cell versus inside the cell. The solution that has the higher concentration of solutes is said to be hypertonic and the solution that has the lower concentration of solutes is said to be hypotonic. Water molecules will diffuse out of the hypotonic solution and into the hypertonic solution (unless acted upon by hydrostatic forces).

Figuur (PageIndex<1>): Osmose: Osmosis is the diffusion of water through a semipermeable membrane down its concentration gradient. As 'n membraan deurlaatbaar is vir water, maar nie vir 'n opgeloste stof nie, sal water sy eie konsentrasie gelykmaak deur te diffundeer na die kant van laer waterkonsentrasie (en dus die kant van hoër opgeloste stofkonsentrasie). In die beker aan die linkerkant is die oplossing aan die regterkant van die membraan hipertonies.

In contrast to passive transport, active (energy-requiring) transport is the movement of substances across the membrane using energy from adenosine triphosphate (ATP). The energy is expended to assist material movement across the membrane in a direction against their concentration gradient. Aktiewe vervoer kan plaasvind met behulp van proteïenpompe of deur die gebruik van vesikels. Another form of this type of transport is endocytosis, where a cell envelopes extracellular materials using its cell membrane. The opposite process is known as exocytosis. This is where a cell exports material using vesicular transport.