Inligting

Wat is die voordeel van indirekte ELISA bo direkte een?

Wat is die voordeel van indirekte ELISA bo direkte een?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ek dink die antwoord gaan oor indirekte een wat minder fout gee as gevolg van selektiwiteit, maar hoe presies gebeur dit?


Jy is korrek, die selektiwiteitsvoordeel van 'n indirekte of toebroodjie-ELISA kom van die feit dat twee teenliggaampies gebruik word - een teen vang die analiet, die ander aan bespeur Dit.

Hier is die klassieke illustrasie van hoe hierdie tipe ELISA werk. Eerste ([1]), word die vasvangteenliggaampie op die plaat bedek en via een van 'n aantal verskillende tipes chemie gebind. Die bord word dan gewas (dit gebeur tussen alle stappe).[2], word die analiet bygevoeg, soms in 'n homogene oplossing (d.w.s. suiwer rekombinante proteïen), ander kere in 'n matriks soos serum, sellysaat, ens. Die plaatgebonde teenliggaam het 'n sekere spesifisiteit vir die analiet - kom ons sê dit bind die verkeerde epitoop een keer in 1000.[3]Die opsporing teenliggaam word bygevoeg, en kom ons sê dit het dieselfde spesifisiteit van 1/1000. Uiteindelik,[4]die sekondêre teenliggaam (met die ensiem daaraan gekoppel) word bygevoeg, en[5]die ensiem se substraat word bygevoeg, wat die kleur of liguitset produseer.

Van Wikimedia

As ons 'n direkte ELISA sou gebruik, sou die foutkoers 1/1000 wees. Deur egter te kombineer twee teenliggaampies, ons foutkoers is nou 1000 keer laer - 1 uit 1 miljoen. Aangesien beide teenliggaampies behoorlik moet bind om 'n sein te kry, maak dit die resultate baie meer betroubaar.


Dit is dikwels nie noodwendig 'n voordele vs nadele-vraag nie, maar een wat bepaal word deur beskikbare reagense en watter vraag gevra word. Byvoorbeeld, as jy 'n toets ontwikkel vir die teenliggaamreaksie op 'n antigeen na immunisering, gebruik jy waarskynlik 'n protokol soos hierdie:

  1. bedek plate met antigeen van belang (aanvaar blok / was soos toepaslik vorentoe)
  2. voeg verdunde serum van proefdiere / proefpersone by
  3. voeg 'n gemerkte sekondêre teenliggaam spesifiek vir hierdie dier/subjek by

    • 'n gemerkte sekondêre teenliggaam moet gebruik word omdat die dier se eie teenliggaam nie (natuurlik) gemerk is nie.

as jy jou eie gemerkte teenliggaam in die laboratorium maak en jy het dit al voorheen gedoen, kan jy beide 'n direkte en indirekte ELISA doen om te verifieer dat jy die teenliggaam gemerk het en om die kwaliteit van die etikettering te bepaal. Gestel jy het 'n gebiotinileerde muis-teenliggaam gemaak.

doen een direkte ELISA (om etiket te kwantifiseer): 1. bedek met teikenantigeen 2. voeg verdunningsreeks van jou teenliggaam-biotien by 3. voeg Streptavadien-Alkaliese fosfatase by om op te spoor

'n tweede indirekte ELISA (om teenliggaampies te kwantifiseer): 1. bedek met teikenantigeen 2. voeg verdunningsreeks van jou teenliggaam-biotien by 3. voeg gebiotinileerde anti-muis-teenliggaam by 4. voeg Streptavadien-Alkaliese fosfatase by om op te spoor

Nou weet jy hoeveel teenliggaampies (van die indirekte ELISA) vir jou sal gee hoeveel sein (van die direkte ELISA) teen bekende hoeveelhede van jou deklaagantigeen sal gee.

Een keer wat jy dalk eintlik die opsie het om 'n direkte of indirekte toets te doen, is wanneer jy al die reagense het wat jy nodig het, maar jy moet jou sein genoegsaam versterk om lae hoeveelhede op te spoor. In daardie geval het 'n direkte ELISA net een teenliggaam se etiket, terwyl inkom met 'n sekondêre (bv. anti-swaar ketting) kan lei tot baie teenliggaampies ter waarde van etiket per teiken.

Thermo het 'n goeie bladsy hieroor.


Ek stem saam met die ander antwoorde en die grootste verskil is inderdaad die spesifisiteit. 'n Indirekte ELISA is inderdaad meer spesifiek, maar ook om 'n rede wat nog nie hier beskryf word nie: Die gebruik van indirekte ELISA beteken dat jou bord met die primêre teenliggaam bedek is. Aangesien hierdie primêre AB met sy swaar ketting aan die putoppervlak geheg is, is die 2 ligte kettings (= die dele wat antigene bind, in hierdie geval die sekondêre ABs ) beskikbaar om die sekondêre AB te bind. Dit beteken dat elke 1 van die primêre AB's die potensiaal het om 2 sekondêre AB's te bind, en sodoende die spesifieke sein aansienlik verhoog.


Voordele van SPR bo ELISA

ELISA, wat staan ​​vir ensiem-gekoppelde immunosorbent assay, is die afgelope 50 jaar die goue standaard vir die kwantifisering en opsporing van teenliggaampies, peptiede, proteïene en ander biomolekules. Daar is 3 hooftipes ELISA-toetse: direk, indirek en toebroodjie. Al hierdie benaderings maak staat op 'n sekondêre reaksie wat 'n meetbare sein genereer wat deur óf 'n standaard absorpsieplaatleser, spektrofotometer, fluorometer of 'n luminometer opgespoor word. Die belangrikste voordele van ELISA is hoë sensitiwiteit en spesifisiteit. Neem byvoorbeeld 'n standaard toebroodjie ELISA-toets. Die gebruik van avidien- of streptavidienchemie laat toe dat veelvuldige ensieme (bv. peperwortelperoksidase) aan die opsporingteenliggaam gebind word, wat lei tot seinversterking van die biomolekule van belang. 'n Toebroodjie-ELISA het egter die volgende nadele:

Het lang was- en inkubasiestappe – neem ure tot dae om resultate te kry

Moet vasvang en opsporing teenliggaampies verstandig kies om kruisreaktiwiteit te voorkom

Behoefte aan etikette of ensieme en substrate vir indirekte opsporing

Verskaf nie kinetiese data nie - dit het 'n eindpuntbespeuring

Kan enige lae-affiniteit interaksies van belang wegspoel

Oppervlakplasmonresonansie (SPR), aan die ander kant, is 'n optiese opsporingstegniek wat ewe sensitief en spesifiek [1-3] is wat hierdie kwessies kan aanspreek. Hierdie blog sal die belangrikste voordele van SPR-tegnologie (Fig. 1) bo toebroodjie-ELISA (Fig. 2) uitlig.

Figuur 1 . Skematika van 'n SPR-eksperiment.

Fig. 2 . Skematika van 'n ELISA-eksperiment.


Pasgemaakte ELISA Kits Dienste

Wat is ELISA? Ensiem-gekoppelde immunosorbent-toets (ELISA) is 'n biochemiese tegniek wat gebruik word om die teenwoordigheid van 'n spesifieke antigeen of teenliggaam in 'n monster op te spoor. Die ELISA het sy gewildheid behou vir meer as 40 jaar as gevolg van sy hoë spesifisiteit, sensitiwiteit en betroubaarheid – eienskappe wat kliënte konsekwent noem vir die gebruik van die metode.

ELISA Dienste en Toetsproses

ELISA Dienste en Toetsmetodes

Direkte ELISA

Die direkte weergawe van die ELISA-toets gebruik monoklonale teenliggaampies om vir 'n spesifieke antigeen te toets. Hierdie vorm van ELISA-toetsing word hoofsaaklik gebruik in die immunohistochemiese kleuring van weefsels en selle.

Direkte ELISA, in vergelyking met ander vorme van ELISA-toetsing, word vinnig uitgevoer omdat slegs een teenliggaam gebruik word. Hierdie toets kan gebruik word om spesifieke teenliggaam-tot-antigeen-reaksies te toets, en help om komplikasies as gevolg van kruisreaktiwiteit tussen ander teenliggaampies te vermy. Nadele Die primêre teenliggaam moet individueel gemerk word, wat tydrowend en moeilik kan wees wanneer verskeie eksperimente uitgevoer word. Die sein is ook nie so versterk in direkte ELISA nie, in vergelyking met die indirekte benadering, wat 'n nadeel kan wees in sommige toepassings wat spooranalietopsporing behels.

Indirekte ELISA-toets

Die indirekte opsporingsmetode gebruik 'n gemerkte sekondêre teenliggaam vir opsporing en is die gewildste formaat vir ELISA. Die sekondêre teenliggaam het spesifisiteit vir die primêre teenliggaam. In 'n toebroodjie-ELISA is dit van kritieke belang dat die sekondêre teenliggaam spesifiek is vir die opsporing van slegs die primêre teenliggaam (en nie die vasvangteenliggaam nie) of die toets sal nie spesifiek vir die antigeen wees nie. Oor die algemeen word dit bereik deur vang- en primêre teenliggaampies van verskillende gasheerspesies te gebruik (bv. muis-IgG en konyn-IgG, onderskeidelik). Vir toebroodjietoetse is dit voordelig om sekondêre teenliggaampies te gebruik wat kruisgeadsorbeer is om enige teenliggaampies wat affiniteit vir die vasvangteenliggaam het, te verwyder. Die kragtigste ELISA-toetsformaat is die toebroodjietoets. Hierdie tipe vangtoets word 'n "toebroodjie"-toets genoem omdat die analiet wat gemeet moet word, gebind word tussen twee primêre teenliggaampies – die vasvangteenliggaam en die opsporingteenliggaam. Die toebroodjieformaat word gebruik omdat dit sensitief en robuust is.

Mededingende ELISA-toets

Die kompeterende ELISA word gebruik om antigeen te kwantifiseer deur gebruik te maak van 'n mededingingsmetode. Kortliks, die vrye antigeen en teenliggaam word geïnkubeer om antigeen-teenliggaamkompleks te vorm en dan word die kompleks by 'n antigeenbedekte oppervlak in die toetsplaat gevoeg. Die ongebonde teenliggaam-antigeenkompleks word afgewas voordat ensiemgekoppelde sekondêre teenliggaampies teen die primêre teenliggaam bygevoeg word. Die substraat word dan bygevoeg en die antigeenkonsentrasie word vervolgens bepaal deur die seinsterkte wat deur die ensiem-substraat reaksie ontlok word. In hierdie toets kompeteer die ensiemgekoppelde sekondêre teenliggaam met die monsterantigeen, wat met die primêre teenliggaam geassosieer word.

Ons Diens

Met 'n professionele ELISA-span en moderne toerusting, sal KareBay ™ Biochem jou van die hoogste gehalte diens voorsien. Dit is maklik om saam met ons te werk. Jy stuur vir ons jou monsters, ons stuur vir jou die toetsresultate terug.

Hoe om te begin

Kontak ons ​​asseblief met jou ELISA Dienste-versoeke by [email protected] en ons sal so gou moontlik antwoord met 'n gedetailleerde kwotasie. Hierdie proses neem gewoonlik tussen 24 en 48 uur en die kwotasie sal 'n beraamde prys insluit asook die tyd wat nodig is om die projek te voltooi. Alle navrae en daaropvolgende projekte word streng vertroulik hanteer en sal gerugsteun word deur 'n vertroulikheidsooreenkoms indien verlang.

KareBay TM voorsien wetenskaplikes en klinici van 'n wye reeks biotegnologiese produkte en wetenskaplaboratoriumvoorrade vir chemiese navorsing en die ontleding van lewensprosesse. KareBay se uitgebreide vermoëns sluit in die kommersialisering van reagense en kits, die vervaardiging van biotegnologieprodukte en die verskaffing van kontraknavorsingsdienste aan organisasies wêreldwyd. Ons talle globale laboratoriums, kantore en sakevennote stel KareBay in staat om sy produkte en dienste uit te brei na sy kliëntebasis regoor die wêreld.

Ons produkte word vir navorsings-, laboratorium- en verdere evalueringsdoeleindes gebruik. Hulle is nie vir menslike gebruik nie.


Vier tipes ELISA

ELISA, kort vir ensiem-gekoppelde immunosorbent-toets, is 'n baie volwasse metode vir die opsporing van verskeie teikens. Een voordeel van ELISA is dat dit vinnig en maklik is om uit te voer, dus word dit dikwels vir beide diagnostiese en navorsingsdoeleindes gebruik.

Soos die naam aandui, behels ELISA die gebruik van ensieme en die spesifieke binding van teenliggaampies en antigeen. Volgens hoe dit werk, kan ELISA in vier hooftipes verdeel word: direk, indirek, toebroodjie en mededingend. Kom ons sien hulle een vir een.

In direkte ELISA word slegs 'n ensiem-gemerkte primêre teenliggaam gebruik, wat beteken dat sekondêre teenliggaampies nie nodig is nie. Die ensiem-gemerkte primêre teenliggaam bind "direk" aan die teiken (antigeen) wat aan die plaat (soliede oppervlak) geïmmobiliseer is. Vervolgens reageer die ensiem wat aan die primêre teenliggaam gekoppel is met sy substraat om 'n sigbare sein te produseer wat gemeet kan word. Op hierdie manier word die antigeen van belang opgespoor.

In indirekte ELISA word beide 'n primêre teenliggaam en 'n sekondêre teenliggaam gebruik. Maar in hierdie geval is die primêre teenliggaam nie met 'n ensiem gemerk nie. In plaas daarvan word die sekondêre teenliggaam met 'n ensiem gemerk.

Die primêre teenliggaam bind aan die antigeen wat op die plaat geïmmobiliseer is, en dan bind die ensiem-gemerkte sekondêre teenliggaam aan die primêre teenliggaam. Laastens reageer die ensiem wat aan die sekondêre teenliggaam gekoppel is met sy substraat om 'n sigbare sein te produseer wat gemeet kan word.

In direkte en indirekte ELISA is dit die antigeen wat op die plaat geïmmobiliseer word. In toebroodjie-ELISA is dit egter die teenliggaam wat op die plaat geïmmobiliseer word, en hierdie teenliggaam word vang-teenliggaam genoem. Benewens vang-teenliggaampies, behels toebroodjie-ELISA ook die gebruik van opsporing-teenliggaampies, wat gewoonlik die ongemerkte primêre opsporing-teenliggaampie en die ensiem-gemerkte sekondêre opsporing-teenliggaam insluit.

Eerstens bind die antigeen van belang aan die vang-teenliggaam wat aan die plaat geïmmobiliseer is. Tweedens bind die primêre opsporings-teenliggaam aan die antigeen. Derdens bind die sekondêre opsporing-teenliggaam aan die primêre opsporing-teenliggaam, en dan reageer die ensiem met sy substraat om 'n sigbare sein te produseer wat gemeet kan word.

Meer besonderhede oor direkte ELISA-protokol, indirekte ELISA-protokol en toebroodjie-ELISA-protokol, kyk dit asseblief hier.

In vergelyking met die drie ELISA-tipes hierbo, is kompeterende ELISA relatief kompleks omdat dit die gebruik van inhibeerantigeen behels, dus staan ​​kompeterende ELISA ook bekend as inhibisie ELISA. Trouens, elk van die drie formate, direk, indirek en toebroodjie, kan by die mededingende formaat aangepas word. In kompeterende ELISA kompeteer die inhibeerantigeen en die antigeen van belang om binding aan die primêre teenliggaam. Hier is 'n prosedure van mededingende ELISA:

Eerstens word die ongemerkte primêre teenliggaam geïnkubeer met die monster wat die antigeen van belang bevat, wat lei tot die vorming van antigeen-teenliggaamkompleks (Ag-Ab). In hierdie stap is die teenliggaampie oormatig in vergelyking met die antigeen, so daar is vrye teenliggaampies oor.

Tweedens word die Ag-Ab-mengsel by die plaat gevoeg wat bedek is met inhibeerantigeen wat ook aan die primêre teenliggaam kan bind. Die vry primêre teenliggaampie in die mengsel bind aan die inhibeerderantigeen op die plaat, terwyl die Ag-Ab-komplekse in die mengsel dit nie doen nie en dus afgewas word.

Derdens word die ensiem-gemerkte sekondêre teenliggaam by die plaat gevoeg en bind aan die primêre teenliggaam gebind aan die inhibeerderantigeen op die plaat.

Laastens word 'n substraat bygevoeg om met die ensiem te reageer en 'n sigbare sein uit te stuur vir opsporing.

Deur hierdie prosedure kan jy vind dat die finale sein omgekeerd geassosieer word met die hoeveelheid van die antigeen van belang in die monster, wat beteken dat hoe meer antigeen in die monster, hoe swakker die finale sein. Dit is omdat primêre teenliggaampies wat aan monsterantigeen gebind is, afgewas sal word, terwyl vrye primêre teenliggaampies wat oorgebly het, vasgevang sal word deur inhibeerderantigeen wat op die plaat geïmmobiliseer is en deur 'n ensiematiese reaksie gemeet word.

Mededingende ELISA wat hier beskryf word, is gebaseer op teenliggaampiesvang, waarin die plaat met antigeen bedek is. Daar is 'n ander tipe mededingende ELISA wat gebaseer is op antigeenvangs, waarin die plaat met ongemerkte teenliggaampies bedek is. Verder gebruik kompeterende ELISA oor die algemeen 'n gemerkte teenliggaam vir opsporing, maar soms gebruik dit gemerkte antigeen in plaas van 'n gemerkte teenliggaam.

Vergelyking van direkte, indirekte, toebroodjie en mededingende ELISA

Nou weet ons hoe die vier mees algemene tipes ELISA werk, maar hoe om die regte tipe vir jou eksperiment te kies? Om die antwoord te vind, moet jy die voordele en nadele van elke ELISA-tipe verstaan.

Tabel 1. Voor- en nadele van elke ELISA-tipe

  1. Eenvoudige protokol, tydbesparend en reagensbesparend.
  2. Geen kruisreaktiwiteit van sekondêre teenliggaampies nie.
  1. Hoë agtergrond.
  2. Geen seinversterking nie, aangesien slegs 'n primêre teenliggaam gebruik word en 'n sekondêre teenliggaam nie nodig is nie.
  3. Lae buigsaamheid, aangesien die primêre teenliggaam gemerk moet word.
  1. Seinversterking, aangesien een of meer sekondêre teenliggaampies gebruik kan word om aan die primêre teenliggaam te bind.
  2. Hoë buigsaamheid, aangesien dieselfde sekondêre teenliggaampie vir verskeie primêre teenliggaampies gebruik kan word.
  1. Komplekse protokol in vergelyking met direkte ELISA.
  2. Kruisreaktiwiteit van sekondêre teenliggaampies.
  1. Hoë buigsaamheid.
  2. Hoë sensitiwiteit.
  3. Hoë spesifisiteit, aangesien verskillende teenliggaampies aan dieselfde antigeen bind vir opsporing.
  1. Die antigeen van belang moet groot genoeg wees sodat twee verskillende teenliggaampies by verskillende epitope daaraan kan bind.
  2. Dit is soms moeilik om twee verskillende teenliggaampies te vind wat verskillende epitope op die antigeen van belang herken en goed saamwerk in 'n toebroodjie-formaat.
  1. Hoë buigsaamheid.
  2. Hoë sensitiwiteit.
  3. Beste vir die opsporing van klein antigene, selfs wanneer hulle in lae konsentrasies teenwoordig is.
  1. Relatief komplekse protokol.
  2. Benodig die gebruik van inhibeerantigeen.

Benewens die vier mees algemene ELISA-tipes hierbo, is daar ander ELISA-tipes wat help om aan die verskillende vereistes van eksperimente te voldoen. Hier is twee voorbeelde:

ELISPOT, kort vir ensiemgekoppelde immunovlektoets, word gebruik om die frekwensie van proteïenafskeiende selle op enkelselvlak te meet. Die tegniek wat ELISPOT gebruik is baie soortgelyk aan dié van toebroodjie ELISA.

In-sel ELISA word gebruik om die vlakke van die teikenproteïen te meet binne selle wat op die plaat vasgemaak is. Dit behels ook die gebruik van die tegniek wat deur toebroodjie ELISA gebruik word.

Eerstens word selle aan die plaat vasgemaak en deurlaatbaar. Vervolgens word 'n primêre teenliggaam bygevoeg om met die teikenproteïen binne die selle te reageer. Laastens word 'n gemerkte sekondêre teenliggaam bygevoeg om met die primêre teenliggaam te reageer. Op hierdie manier word die teikenproteïen binne selle opgespoor.

Kwantitatiewe en kwalitatiewe ELISA

Op grond van of ELISA die vlak van die teikenmolekule kan kwantifiseer, kan ELISA in twee tipes verdeel word, kwalitatief en kwantitatief. Kwalitatiewe ELISA verskaf 'n eenvoudige positiewe of negatiewe resultaat vir 'n monster, terwyl kwantitatiewe ELISA die konsentrasie van die teikenmolekule in 'n monster via 'n standaardkurwe weerspieël. Dus, as jy die teikenmolekulevlak wil kwantifiseer, kies kwantitatiewe ELISA.

ELISA word vir beide diagnostiese en navorsingsdoeleindes gebruik. Siektes wat deur ELISA opgespoor word, sluit in MIV, HBV, griep, hemolitiese anemie, Lyme-siekte, voedselallergie, ensovoorts. Tans is daar 'n groot aantal ELISA-stelle wat wêreldwyd deur vervaardigers verskaf word. Maar sommige ELISA-stelle word slegs in navorsing gebruik en kan nie in diagnose gebruik word nie. Cusabio is een van die vervaardigers wat ELISA-stelle vir navorsingsgebruik aanbied. Hoe om die regte ELISA-stel vir jou navorsing te kies? Lees asseblief hierdie artikel: 11 wenke om jou regte ELISA-stel te kies.

Jy kan ook jou eie ELISA ontwikkel as daar geen ELISA-stelle kommersieel beskikbaar is vir jou navorsing nie. Tydens ELISA-ontwikkeling is die teenliggaampeleksie van kritieke belang. Baie faktore soos die affiniteit, spesifisiteit en titer van die teenliggaam moet in ag geneem word.

Behalwe dit, hier is 'n paar algemene probleme van ELISA vir jou, en ons hoop dit kan jou help.


Die belangrikste voordele van indirekte opsporing

Selfs al word die direkte opsporingsmetode meer gewild vir immunofluoressensie (IF) en vloeisitometrie-eksperimente, bly die indirekte opsporingsmetode steeds die voorkeurkeuse vir baie ander toepassings. In direkte opsporing is die gemerkte primêre teenliggaam verantwoordelik vir beide binding en opsporing van die antigeen van belang. In indirekte opsporing word hierdie proses in ten minste twee afsonderlike stappe opgebreek - (i) 'n ongekonjugeerde primêre teenliggaam vorm 'n kompleks met die antigeen, (ii) 'n gemerkte sekondêre teenliggaam, wat in wisselwerking met die konstante gebied van die primêre teenliggaam inwerk, vergemaklik opsporing .

HAI-1 is opgespoor in paraffien-ingebedde dele van menslike longkanker deur bok anti-mens HAI te gebruik-1 ektodomein antigeen affiniteit-gesuiwerde poliklonale teenliggaam (Katalogus # AF1048) gevolg deur anti-bok IgG VisUCyte HRP polimeer teenliggaampie (Katalogus # VC004). Weefsel is gekleur met DAB (bruin) en teenkleur met hematoksilien (blou).

Verbeterde Sensitiwiteit
Een van die hoofredes vir die gebruik van die indirekte metode is 'n toename in die onderste limiet van opsporing. Aangesien twee of meer gemerkte sekondêre teenliggaampies in staat is om 'n enkele primêre teenliggaam te bind, is die resultaat 'n versterking in sein en 'n toename in toetssensitiwiteit. Dit is veral belangrik vir 'n lae oorvloed antigene wat addisionele seinversterkingstappe kan vereis om 'n merkbare sein oor agtergrondkleuring te genereer. Een opsie vir seinversterking deur gebruik te maak van chromogeniese opsporing is 'n HRP-polimeer-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam waarin verskeie HRP-molekules met elke sekondêre teenliggaam geassosieer word. Kom meer te wete oor seinversterkingsmetodes op ons IHC Detection-bladsy.

Groter buigsaamheid
Met die indirekte metode word navorsers beperk deur die reeks kommersieel beskikbare gekonjugeerde primêre teenliggaampies en is hulle ook nie beperk tot die gebruik van 'n spesifieke etiket vir 'n eksperiment nie. In plaas daarvan om bekommerd te wees oor die keuse van die beste etiket, bv. FITC of PE, vir die primêre teenliggaam, kan die primêre teenliggaam met verskillende gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies van dieselfde spesie gepaar word. Jy kan ook maklik oorskakel van 'n kolorimetriese na 'n fluoresserende toets wanneer jy met 'n ongekonjugeerde primêre teenliggaam werk.

Die bestudering van 'n nuwe antigeen of die gebruik van 'n nuwe teenliggaam stel 'n aantal onbekendes bekend soos antigeenoorvloed en suksesvolle antigeen-teenliggaambinding. Die indirekte metode van opsporing kan 'n meer geskikte beginpunt vir jou eksperimentele ontwerp wees. Jou laboratorium het dalk reeds 'n inventaris van gekonjugeerde sekondêre reagense wat jy vir voorlopige toetsing kan gebruik.

Gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies verryk die opsporing van lae oorvloed teikenmolekules en laat groter vryheid in die keuse van opsporingsreagense toe. Novus Biologicals het 'n uitgebreide lys van gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies beskikbaar vir jou indirekte opsporingsbehoeftes.


ELISA voordele en nadele

Voordele

  • Hoë sensitiwiteit en spesifisiteit: dit is algemeen dat ELISA's antigene op die pikogramvlak op 'n baie spesifieke wyse opspoor as gevolg van die gebruik van teenliggaampies.
  • Hoë deurset: kommersiële ELISA-stelle is gewoonlik beskikbaar in 'n 96-put plaatformaat. Maar die toets kan maklik by 384-put plate aangepas word.
  • Maklik om uit te voer: protokolle is maklik om te volg en behels min praktiese tyd.
  • Kwantitatief: dit kan die konsentrasie van antigeen in 'n monster bepaal.
  • Moontlikheid om verskeie monstertipes te toets: onder andere serum, plasma, sellulêre en weefselekstrakte, urine en speeksel.

Nadele

  • Tydelike uitlesings: opsporing is gebaseer op ensiem/substraatreaksies en daarom moet uitlees in 'n kort tydsbestek verkry word.
  • Beperkte antigeeninligting: inligting beperk tot die hoeveelheid of teenwoordigheid van die antigeen in die monster.

Wat is die voordeel van indirekte ELISA bo direkte een? - Biologie

Sodra proteïene deur gelelektroforese geskei is en op 'n kladmembraan oorgedra is, kan Western blotting in een of twee stappe uitgevoer word.

Direkte - Een stap metode

In die direkte opsporingsmetode (Figuur 1 (A)), word 'n primêre teenliggaam direk gekonjugeer aan 'n verslaggewer-ensiem of fluoresserende kleurstof gebruik om die proteïenantigeen op die kladmembraan na 'n enkele inkubasiestap op te spoor. Alhoewel hierdie eenstap-metode vinniger is, word dit nie algemeen gebruik nie. Figuur 1(B) illustreer een van die probleme om die primêre teenliggaam direk te konjugeer, waardeur die verslaggewermolekule die antigeenbindingsgebied van die primêre teenliggaam kan afsluit, wat goeie herkenning van die antigeen voorkom en lei tot verminderde sensitiwiteit. Oormaat primêre kan kompenseer vir hierdie effek, maar kan lei tot swak reproduceerbaarheid en verhoogde agtergrond.

Indirekte – Twee-stap metode

Die twee-stap, indirekte opsporing metode van Western blotting vermy sulke inmenging met antigeen opsporing. 'n Ongemerkte primêre teenliggaam vorm 'n kompleks met die antigeen wat aan die kladmembraan gebind is. Na was, word die klad geïnkubeer met 'n sekondêre teenliggaam wat met die verslaggewer-ensiem of fluorofoor gekonjugeer is. Veelvuldige sekondêre teenliggaampies bind aan epitope op die primêre teenliggaam, wat 'n gemerkte antigeen-teenliggaamkompleks skep (Figuur 1(C)). Alhoewel die indirekte metode nog een was- en inkubasiestap vereis, bied dit talle voordele bo die direkte metode, insluitend versterking van sein en buigsaamheid.

Figuur 1: (A) Direk gekonjugeerde primêre teenliggaam bind antigeen gebind aan membraan. (B) Direk gekonjugeerde primêre teenliggaampies bind swak aan antigeen wat aan membraan gebind is, aangesien verslaggewerensiem of fluorofoor in antigeenbindende gebied kan konjugeer en affiniteit van die teenliggaam vir sy teiken kan verminder. Die gebruik van 'n sekondêre skakel dit uit. (C) Indirekte metode – veelvuldige gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies bind aan 'n ongekonjugeerde primêre teenliggaam.

Die voordele en nadele van die direkte en indirekte opsporingsmetodes word in die tabel hieronder uiteengesit. Hulle is van toepassing op Western blotting, maar kan ook relevant wees vir ander tegnieke, soos IHC/ICC, ELISA en vloeisitometrie.

Tabel 1: Voor- en nadele van direkte en indirekte Westerse kladmetodes.

Direkte opsporing metode Indirekte opsporing metode
Nadele Voordele Nadele Voordele
Tyd Die etikettering van individuele primêre teenliggaampies is tydrowend. Een inkubasiestap beteken dat direkte opsporingsmetodes vinnig kan wees. Die byvoeging van die sekondêre teenliggaam veroorsaak ekstra stappe. Baie betroubare kommersieel beskikbare gemerkte sekondêre produkte verminder tydrowende optimaliseringstappe.
Buigsaamheid en beskikbaarheid Die aantal gekonjugeerde primêre teenliggaampies is beperk. Sekondêre teenliggaampies bied 'n wye reeks gekonjugeerde opsies en teenliggaamspesifisiteite.
Sensitiwiteit Die sein van direkte metode kan swakker lyk as indirekte metode. Seinversterking - elke primêre teenliggaam kan veelvuldige sekondêre teenliggaampies akkommodeer, wat die aantal molekules wat beskikbaar is om sein te produseer, verhoog.
Immunoreaktiwiteit Primêre teenliggaampies kan verminderde immunoreaktiwiteit hê as gevolg van gekonjugeerde inmenging met antigeenbinding. Immunoreaktiwiteit van die primêre teenliggaam word bewaar, en sein word verskaf deur die gekonjugeerde sekondêre.
Koste Gekonjugeerde primêre teenliggaampies kan duur wees, en meer teenliggaampies kan nodig wees om verlies aan sensitiwiteit teë te werk. Een sekondêre teenliggaam kan gebruik word om enige primêre teenliggaampie wat in dieselfde gasheerspesie opgewek word op te spoor, wat koste verminder.
Seinverbeteringsopsies Monsterkonsentrasie mag nodig wees vir lae oorvloed proteïene voor laai. Sekondêre teenliggaampies kan gebruik word om sein op talle maniere te verbeter.

Alberts B et al (1994) Molekulêre biologie van die sel. 3de Uitg. Garland pers. Londen


Wat is mededingende ELISA?

Mededingende ELISA meet die antigeenkonsentrasie in 'n monster deur die opsporing van seininterferensie. Hier gebruik die toets 'n inhibeerantigeen. Daarom is dit 'n tipe inhibisie ELISA. Tydens hierdie prosedure kompeteer die antigene teenwoordig in die monster met die geselekteerde verwysingsantigeen vir binding aan 'n spesifieke hoeveelheid gemerkte teenliggaampies. Verder begin hierdie prosedure met die inkubasie van die monster, met die oortollige hoeveelheid gemerkte teenliggaampies. Die verwysingsantigeen moet ook vooraf op 'n meervoudige puttoetsplaat bedek word. Dan moet die monstermengsel by die toetsplaat gevoeg word wat die verwysingsantigeen bevat. Vrye teenliggaampies sal aan die verwysingsantigeen bind, afhangende van die hoeveelheid antigeen in die monster. Dus, as meer monsterantigeen teenwoordig is, sal minder verwysingsantigeen opgespoor word. Dit skep dus 'n swakker sein.

Figuur 01: ELISA

In teenstelling hiermee, wanneer die monster minder hoeveelheid antigeen bevat, sal meer en meer verwysingsantigeen die teenliggaampies beset en 'n sterk sein gee. Aangesien kompeterende ELISA 'n sterker sein gee wanneer die monster 'n lae hoeveelheid antigene bevat, is kompeterende ELISA 'n baie sensitiewe toets, selfs vir monsters met 'n klein aantal antigene.

In sommige mededingende ELISA-stelle word 'n gemerkte antigeen gebruik in plaas van 'n gemerkte teenliggaam. Hier sal die gemerkte antigeen en die monsterantigeen meeding vir binding aan die primêre teenliggaam. Net so, wanneer die hoeveelheid antigeen in die monster laag is, sal die hoeveelheid gemerkte antigeen wat aan teenliggaampies bind hoër wees en 'n sterker sein skep.


Immunofluoressensie protokol (IF protokol)

Immunofluoressensie is een van die wyd gebruikte tegnieke in moderne biologie en medisyne, en dit is ontwikkel deur Coons et al. (1950), en dit is 'n kombinasie van immunofluoressensie tegniek en morfologiese tegnologie om immuun fluoresserende selle (of weefsel) te ontwikkel. Die ontwikkeling van fluoressensie-immunotoetstegnologie is baie vinnig in die afgelope jaar, veral op die gebied van mediese, biologiese en omgewingstudies, dit word wyd gebruik in die bepaling van endokriene hormone, groeifaktore, proteïene, nukleïensure, neurotransmitters, reseptore, in vivo dwelm- en aansteeklike bronne, ensovoorts, is hierdie vakke ontwikkel. Volgens die opsporing van verskillende monsters kan verdeel word in drie hoofkategorieë.
Daar is twee verskillende immunofluoressensietoetsing wat indirekte immunofluoressensietoets en direkte immunofluoressensietoets insluit. Vir indirekte immunofluoressensietoets sluit die protokol hoofsaaklik weefsel- of selvoorbereiding, weefsel- of selfiksasie, serumblokkering, primêre teenliggaaminkubasie, gemerkte tweede teenliggaaminkubasie, kleuring, resultaat in oordeel en beeldvorming. Vir direkte immunofluoressensie-toets is daar slegs gemerkte primêre teenliggaampies wat geïnkubeer is sonder tweede teenliggaampies en ander stappe is dieselfde.
Vir direkte immunofluoressensie-toets is spesifieke fluoresserende teenliggaampies voorberei deur die kombinasie van spesifieke teenliggaampies en fluoressensie. Dit is die eenvoudigste en vinnigste metode vir die ondersoek van sel- of weefselantigeen. Hierdie metode is hoogs spesifiek en word algemeen gebruik in nierbiopsie en patogeenondersoek. Die nadeel daarvan is dat 'n fluoresserende teenliggaam slegs een soort antigeen kan ondersoek, wat minder sensitief is. Vir indirekte immunofluoressensie-toets, spesifieke teenliggaampies teen die ooreenstemmende antigeen, fluoressensie-gemerkte anti-teenliggaam (anti-spesifieke IgG-fluoresserende teenliggaam) en die primêre teenliggaam
Alhoewel die basiese stappe en beginsels van immuunfluoressensie dieselfde is, maar as gevolg van die spesifieke toestande nie dieselfde is nie, sal die gedetailleerde werkingstappe van elke laboratorium nie presies dieselfde wees nie. Byvoorbeeld, die gebruik van die oplossing, die vaste vloeistof en teenliggaamverdunningsvloeistof sal effens verskil. Hier om 'n meer algemene metode te gee, kan die gedetailleerde gebruik van die operasie gebaseer word op die stappe om aan te pas en te verander, en uiteindelik die mees geskikte metode vir jouself te bepaal.

Indirekte Immunofluoressensie / IF

1. Berei weefsel of kultuurselle voor
2. Berei weefselafdeling of selle deklip voor
3. Was monsters twee keer met PBS
4. Bevestig amples met 4% paraformaldehye in PBS vir 15 min by kamertemperatuur (Let wel: Paraformaldehye is giftig, gebruik slegs in dampkap)
5. Aspireer fikseermiddel, spoel twee keer in PBS vir 5 min elk
6. Permeabiliseer monsters met 0.1-0.5% triton x-100 in PBS vir 10 min (Let wel: Permeabilisering word slegs vereis wanneer die teenliggaam toegang tot die binnekant van die selle benodig om die proteïen op te spoor. Dit sluit intrasellulêre proteïene en transmembraanproteïene waarvan die epitope in is in die sitoplasmiese gebied.
7. Aspireer triton x-100, spoel twee keer in PBS vir 5 min elk
8. Inkubeer monsters in 10% normale bokserum in PBS vir 30 min by kamertemperatuur
9. Aspireer bokserum, inkubeer snitte met primêre teenliggaampies by toepaslike verdunning in PBS oornag by 4°C of 1 uur by 37°C (optimale toestand moet in verskillende laboratoriums bevestig word)
10. Spoel drie keer in PBS vir 5 min elk
11. Inkubeer monsters met fluorochroom-gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies by gepaste verdunning in PBS vir 1 uur by 37°C in donker (optimale toestand moet in verskillende laboratoriums bevestig word)
12. Spoel drie keer in PBS vir 5 min elk in donker
13. Inkubeer monsters met 1 μg/ml DAPI
14. Monteer monsters met 'n druppel monteermedium

Direkte Immunofluoressensie / IF

1. Berei weefsel- of kultuurselle voor
2. Berei weefselafdeling of selle deklip voor
3. Was monsters twee keer met PBS
4. Bevestig amples met 4% paraformaldehye in PBS vir 15 min by kamertemperatuur (Let wel: Paraformaldehye is giftig, gebruik slegs in dampkap)
5. Aspireer fikseermiddel, spoel twee keer in PBS vir 5 min elk
6. Permeabiliseer monsters met 0,1-0,5% triton x-100 in PBS vir 10 min. is in die sitoplasmiese gebied.
7. Aspireer triton x-100, spoel twee keer in PBS vir 5 min elk
8. Inkubeer monsters in 10% normale bokserum in PBS vir 30 min by kamertemperatuur
9. Aspireer bokserum, inkubeer snitte met fluorochroom-gekonjugeerde primêre teenliggaampies by gepaste verdunning in PBS oornag by 4°C of 1 uur by 37°C (optimale toestand moet in verskillende laboratoriums bevestig word)
10. Spoel drie keer in PBS vir 5 min elk in donker
11. Inkubeer monsters met 1 μg/ml DAPI
12. Monteer monsters met 'n druppel monteermedium


ELISA-toetse: indirek, toebroodjie en mededingend

Bron: Whitney Swanson 1,2 , Frances V. Sjaastad 2,3 , en Thomas S. Griffith 1,2,3,4
1 Departement Urologie, Universiteit van Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Sentrum vir Immunologie, Universiteit van Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Mikrobiologie, Immunologie en Kankerbiologie Nagraadse Program, Universiteit van Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Masonic Cancer Center, Universiteit van Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Ensiem-gekoppelde immunosorbent-toets (ELISA) word gereeld gebruik om die teenwoordigheid en/of konsentrasie van 'n antigeen, teenliggaam, peptied, proteïen, hormoon of ander biomolekule in 'n biologiese monster te meet. Dit is uiters sensitief, in staat om lae antigeenkonsentrasies op te spoor. Die sensitiwiteit van ELISA word toegeskryf aan sy vermoë om die interaksies tussen 'n enkele antigeen-teenliggaamkompleks op te spoor (1). Boonop laat die insluiting van 'n ensiemgekonjugeerde antigeenspesifieke teenliggaam die omskakeling van 'n kleurlose substraat in 'n chromogeniese of fluoresserende produk toe wat opgespoor en maklik deur 'n plaatleser gekwantifiseer kan word. Wanneer dit vergelyk word met die waardes wat gegenereer word deur getitreerde hoeveelhede van 'n bekende antigeen van belang, kan die konsentrasie van dieselfde antigeen in die eksperimentele monsters bepaal word. Verskillende ELISA-protokolle is aangepas om antigeenkonsentrasies in 'n verskeidenheid eksperimentele monsters te meet, maar hulle het almal dieselfde basiese konsep (2). Die keuse van die tipe ELISA om uit te voer, indirek, toebroodjie of mededingend, hang af van 'n aantal faktore, insluitend die kompleksiteit van die monsters wat getoets moet word en die antigeen-spesifieke teenliggaampies wat beskikbaar is om te gebruik. Die indirekte ELISA word gereeld gebruik om die uitkoms van 'n immunologiese reaksie te bepaal, soos om die konsentrasie van 'n teenliggaam in 'n monster te meet. Die toebroodjie-ELISA is die beste geskik vir die ontleding van komplekse monsters, soos weefselkultuursupernatante of weefsellisate, waar die analiet, of antigeen van belang, deel van 'n gemengde monster is. Laastens word die kompeterende ELISA meestal gebruik wanneer daar slegs een teenliggaam beskikbaar is om die antigeen van belang op te spoor. Mededingende ELISA's is ook nuttig vir die opsporing van 'n klein antigeen met slegs 'n enkele teenliggaam epitoop wat nie twee verskillende teenliggaampies kan akkommodeer nie as gevolg van steriese verhindering. Die protokol sal die basiese prosedures vir die indirekte, toebroodjie en mededingende ELISA-toetse beskryf.

Die indirekte ELISA-toets word algemeen gebruik om die hoeveelheid teenliggaampies in serum of in die supernatant van 'n hibridoomkultuur te meet. Die algemene prosedure vir die indirekte ELISA-toets is:

  1. Bedek putte met antigene
  2. Voeg serum- of hibridoomkultuursupernatant wat teenliggaampies bevat (primêre of 1°-teenliggaam) by
  3. Inkubeer en was
  4. Voeg sekondêre (of 2°) ensiem-gekonjugeerde teenliggaampies by
  5. Inkubeer en was
  6. Voeg substraat by

Die toebroodjie ELISA-toets verskil van die indirekte ELISA-toets deurdat die metode nie die bedekking van die plate met 'n gesuiwerde antigeen behels nie. In plaas daarvan word 'n "capture"-teenliggaam gebruik om die putte van die plaat te bedek. Die antigeen is tussen die vang-teenliggaam en 'n tweede "detection"-ensiem-gekonjugeerde teenliggaam vasgebind - waar beide teenliggaampies spesifiek is vir dieselfde antigeen, maar by verskillende epitope (3). Deur aan die vang-teenliggaam/antigeenkompleks te bind, bly die opsporingteenliggaam in die plaat. Óf monoklonale teenliggaampies óf poliklonale antisera kan gebruik word as die vasvang en opsporing teenliggaampies. Die grootste voordeel van die toebroodjie-ELISA is dat die monster nie voor ontleding gesuiwer hoef te word nie. Boonop kan die toets redelik sensitief wees (4). Baie kommersieel beskikbare ELISA-stelle is van die toebroodjie-variëteit en gebruik getoetste, ooreenstemmende pare teenliggaampies. Die algemene prosedure vir die toebroodjie ELISA-toets is:

  1. Bedek putte met vang-teenliggaampies
  2. Voeg toetsmonsters by wat antigeen bevat
  3. Inkubeer en was
  4. Voeg ensiem-gekonjugeerde opsporings-teenliggaampie by.
  5. Inkubeer en was
  6. Voeg substraat by

Die meeste kommersieel beskikbare toebroodjie ELISA-stelle kom met ensiem-gekonjugeerde opsporing teenliggaampies. In gevalle waar 'n ensiemgekonjugeerde teenliggaam nie beskikbaar is nie, kan 'n sekondêre ensiemgekonjugeerde teenliggaam spesifiek vir die opsporingteenliggaam gebruik word. Die ensiem op die sekondêre teenliggaam vervul dieselfde rol, wat is om die kleurlose substraat om te skakel na 'n chromogeniese of fluoresserende produk. Die bogenoemde sekondêre ensiem-gekonjugeerde teenliggaampie wil meer graag gebruik word in 'n "tuisgemaakte" toebroodjie ELISA wat ontwikkel is deur 'n ondersoeker wat byvoorbeeld hul eie monoklonale teenliggaampies gegenereer het. Een nadeel aan die gebruik van 'n sekondêre ensiem-gekonjugeerde teenliggaam is om seker te maak dit bind net aan die opsporing-teenliggaam, en nie die vang-teenliggaam wat aan die plaat gebind is nie. Dit sal lei tot 'n meetbare produk in alle putte, ongeag die teenwoordigheid of afwesigheid van antigeen of opsporing teenliggaampies.

Laastens word die mededingende ELISA-toets gebruik om oplosbare antigene op te spoor. Dit is eenvoudig om uit te voer, maar dit is slegs geskik wanneer die gesuiwerde antigeen in 'n relatief groot hoeveelheid beskikbaar is. Die algemene prosedure vir die mededingende ELISA-toets is:

  1. Bedek putte met antigeen
  2. Inkubeer en was
  3. Voorinkubeer toetsmonster met ensiemgekonjugeerde primêre teenliggaampies
  4. Voeg mengsel by goed
  5. Inkubeer en was enige ongebonde ensiemgekonjugeerde primêre teenliggaampie weg
  6. Voeg substraat by

Die "kompetisie" in hierdie toets kom van die feit dat meer antigeen in die toetsmonster wat in stap 3 gebruik word, sal lei tot minder beskikbare teenliggaampies om te bind aan die antigeen wat die put bedek. Dus, die intensiteit van die chromogeniese/fluorogeniese produk in die put aan die einde van die toets is omgekeerd verwant aan die hoeveelheid antigeen teenwoordig in die toetsmonster.

'n Sleutelkomponent in enige tipe ELISA is die getitreerde standaarde van bekende konsentrasies wat die gebruiker in staat sal stel om die antigeenkonsentrasie teenwoordig in die toetsmonsters te bepaal. Tipies word 'n reeks putte aangewys vir die skep van 'n standaardkurwe, waar bekende hoeveelhede van 'n gesuiwerde rekombinante proteïen in afnemende hoeveelhede by die putte gevoeg word. Wanneer hierdie putte op dieselfde tyd as die toetsmonsters verwerk word, kan die gebruiker 'n verwysingstel van absorpsiewaardes verkry vanaf 'n mikroplaatleser vir bekende proteïenkonsentrasies om saam te gaan met die absorpsiewaardes vir die toetsmonsters. Die gebruiker kan dan 'n standaardkurwe bereken waarmee die toetsmonsters vergelyk kan word vir die bepaling van die hoeveelheid proteïen van belang teenwoordig. Die standaardkurwe kan ook die graad van akkuraatheid van die gebruiker se verdunningsmaak bepaal.

Laastens, die laaste stap in elk van die ELISA-tipes wat hierbo gelys word, vereis die byvoeging van 'n substraat. Die mate van omskakeling van die substraat na produk is direk verwant aan die hoeveelheid ensiem wat in die put teenwoordig is. Peperwortelperoksidase (HRP) en alkaliese fosfatase (AP) is die mees algemene ensieme wat aan teenliggaampies gekonjugeer gevind word. Soos verwag, is daar 'n aantal substrate beskikbaar spesifiek vir óf ensiem wat 'n chromogeniese óf fluoresserende produk produseer. Boonop is substrate beskikbaar in 'n reeks sensitiwiteite wat die algehele sensitiwiteit van die toets kan verhoog. Die gebruiker moet ook die tipe instrumentasie wat beskikbaar is vir die lees van die plaat aan die einde van die eksperiment in ag neem wanneer die tipe substraat gekies word om te gebruik, tesame met die ooreenstemmende ensiem-gekonjugeerde teenliggaam.

Algemeen gebruikte chromogeniese substrate vir HRP sluit in 2,2'-Azinobis [3-etielbensotiasolien-6-sulfonsuur]-diammoniumsout (ABTS) en 3,3',5,5'-tetrametielbensidien (TMB), terwyl bl-Nitrofenylfosfaat (PNPP) word vir AP gebruik. ABTS en TMB produseer onderskeidelik wateroplosbare groen en blou gekleurde reaksieprodukte. Die groen ABTS-produk het twee groot absorbansiepieke, 410 en 650 nm, terwyl die blou TMB-produk die beste by 370 en 652 nm opgespoor word. Die kleure van ABTS en TMB verander na geel by die byvoeging van 'n suurstopoplossing, wat die beste by 450 nm gelees word. Kleurontwikkeling vir ABTS is stadig, terwyl dit vinnig is vir TMB. TMB is meer sensitief as ABTS, en kan 'n hoër agtergrondsein produseer as die ensiematiese reaksie te lank voortduur. PNPP produseer 'n geel wateroplosbare produk na AP-omskakeling wat lig by 405 nm absorbeer.

Prosedure

1. Indirekte ELISA

'n Indirekte ELISA is een waar die primêre antigeen-spesifieke teenliggaam deur 'n sekondêre gekonjugeerde teenliggaam herken word. Die volgende protokol is 'n voorbeeld van 'n indirekte ELISA-metode, waar die serummonsters van influenza A-virus (IAV)-geïnfekteerde muise getoets word vir die teenwoordigheid van IAV-spesifieke IgG-teenliggaampies. Een sterkpunt van hierdie voorbeeld is dat verskillende sekondêre teenliggaampies gebruik kan word wat alle teenliggaamisotipes of spesifieke isotipes (bv. IgG) herken.

Bedek antigeen op die mikroplaat

  1. Bedek die putte van 'n 96-put ELISA-plaat met gesuiwerde antigeen deur 50 µL gesuiwerde antigeen (2 mg/ml gesuiwerde A/PR/8 Influenza A-virus in 0.05M Tris-HCl-buffer (pH 9.5)) in te pipet elke put van die bord.
  2. Bedek die plaat met 'n kleefbedekking en inkubeer dit oornag by 4°C om die antigeen aan die plaat te laat bind.
  3. Nadat die inkubasie voltooi is, verwyder die deklaagoplossing deur die plaat oor 'n wasbak te gooi.
  1. Blokkeer die oorblywende proteïenbindingsplekke in die bedekte putte deur 200 µL blokkeerbuffer by te voeg, 5% donkieserum in 1X PBS word hier gebruik, per put. Alternatiewe blokkerende reagense sluit in 5% nie-vet droë melk of BSA in PBS of normale serum van 'n dier waarin die sekondêre teenliggaam gegenereer is.
  2. Inkubeer vir ten minste 2 uur by kamertemperatuur of oornag by 4°C.
  3. Na die inkubasie, verwyder die blokkeerbuffer deur die plaat te tik en was plaat dan met PBS wat 1% Tween-20 bevat.

Inkubasie met die primêre teenliggaam

  1. Berei 'n reeksverdunning van die serummonster, wat die primêre teenliggaam bevat, voor om 'n verdunningsreeks van 1 tot 204 800 te verkry, deur 1X PBS te gebruik. Om dit te doen, verdun eers die serum 1:12,5 en voer dan 'n 4X verdunning uit (verdunningsreeks - 1:12,5 tot 1:204,800).
  2. Voeg 100 µL van die serie-verdunde serummonsters by die putte.
  3. Bedek plaat met kleefmiddel en inkubeer by kamertemperatuur vir 1-2 uur.
  4. Na die inkubasie, gooi die plaat oor 'n wasbak en was plaat met PBS wat 1% Tween-20 bevat.

Inkubasie met die sekondêre teenliggaam

  1. Voeg 100 µL van 'n ensiem-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam, peperwortelperoksidase, HRP-gekonjugeerde donkie-anti-muis sekondêr in hierdie eksperiment, by elke put.
  2. Inkubeer die plaat vir 1 uur by kamertemperatuur.
  3. Na die inkubasie, skuif die plaat oor 'n wasbak en was plaat dan met PBS wat 1% Tween-20 bevat.
  1. Voeg 100 µL van die indikatorsubstraat (3,3',5,5'-tetrametielbenzidien (TMB)) by 'n konsentrasie van 1 mg/ml by elke put.
  2. Inkubeer die plaat met die substraat vir 5-10 minute by kamertemperatuur.
  3. Na 10 min, stop die ensiematiese reaksie deur 100 µL 2N Swaelsuur (H) by te voeg2SO4).
    Binne 30 min nadat die stopoplossing bygevoeg is, lees die plaat met 'n mikroplaatleser by 405 nm om die absorpsie van die putte te bepaal.

2. Toebroodjie ELISA

In hierdie ELISA-weergawe word die eksperimentele monster tussen 'n ongekonjugeerde vang-teenliggaam en 'n gekonjugeerde opsporings-teenliggaam "toegevoeg", wat albei spesifiek is vir dieselfde proteïen maar by verskillende epitope. In die volgende toebroodjie-ELISA-voorbeeld, is konsentrasie van menslike TNFα bepaal in onbekende monster deur gebruik te maak van 'n standaardkurwe wat gegenereer is uit 2.5X reeksverdunning van 'n bekende standaard, rekombinante menslike TNFα (met 'n konsentrasie van 75 pg/mL).

Bedekking vang teenliggaampies teen die mikroplaat vas

  1. Bedek die putte van 'n 96-put ELISA-plaat met gesuiwerde vang-teenliggaampies deur 100 µL vang-teenliggaampie (1-10 µg/mL-reeks) by elke put van die plaat te voeg.
  2. Bedek plaat met 'n kleefplaatbedekking en inkubeer dit oornag by 4°C.
  3. Na inkubasie, verwyder die deklaagoplossing van plaat deur die plaat oor 'n wasbak te skuif.
  1. Blokkeer die oorblywende proteïenbindingsplekke in die teenliggaambedekte putte deur 200 µL blokkeeroplossing, 5% nie-vet droë melk wat PBS bevat, by die putte te voeg.
  2. Inkubeer vir ten minste 2 uur by kamertemperatuur of oornag by 4°C.
  3. Na die inkubasie, verwyder die blokkeerbuffer deur die plaat te tik en was plaat dan met PBS wat 1% Tween-20 bevat.

Voeg antigeenbevattende toetsmonsters by

  1. Voeg 100 µL van die toetsmonster by die putte. Seël die plaat met 'n kleefdeksel.
  2. Inkubeer vir 1-2 uur by kamertemperatuur of oornag by 4°C.
  3. Na inkubasie, verwyder die monsters deur die plaat oor die wasbak te gooi en was dan die putte met 200 µL 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat.

Voeg ensiem-gekonjugeerde opsporings-teenliggaampie by

  1. Voeg 100 µL van ensiem-gekonjugeerde opsporing teenliggaampies by die putte by 'n vooraf geoptimaliseerde konsentrasie.
  2. Seël die plaat met 'n kleefdeksel en inkubeer by kamertemperatuur vir 2 uur.
  3. Verwyder die ongebonde detectie-teenliggaam deur die plaat oor 'n wasbak te gooi en was die putte met 200 µL 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat.
  1. Voeg 100 µL van die indikatorsubstraat by teen 'n konsentrasie van 1 mg/ml. Enige gebonde ensiem-gekonjugeerde opsporing teenliggaam sal die substraat omskakel na 'n waarneembare sein.
  2. Inkubeer die plaat vir 5-10 min by kamertemperatuur.
  3. Na 5-10 min, stop die ensiematiese reaksie deur 100 µL 2N H by te voeg2SO4 na die putte. Binne 30 min nadat die stopoplossing bygevoeg is, lees die plaat met 'n mikroplaatleser om die absorpsie van die putte te bepaal.

3. Mededingende ELISA

Die stappe van 'n kompeterende ELISA verskil van dié wat in indirekte en toebroodjie ELISA gebruik word, met die belangrikste verskil die kompeterende bindingstap tussen die monsterantigeen en die "byvoeging"-antigeen. Die monster-antigeen word met die ongemerkte primêre teenliggaam geïnkubeer. Hierdie teenliggaam-antigeen-komplekse word dan by die ELISA-plaat gevoeg, wat vooraf met dieselfde antigeen bedek is. Na 'n inkubasietydperk word enige ongebonde teenliggaampie weggespoel. Daar is 'n omgekeerde korrelasie tussen die hoeveelheid vrye teenliggaampies wat beskikbaar is om die antigeen in die put te bind en die hoeveelheid antigeen in die oorspronklike monster. Byvoorbeeld, 'n monster met oorvloedige antigeen sal meer antigeen-primêre teenliggaamkomplekse hê, wat min ongebonde teenliggaampies laat om aan die ELISA-plaat te bind. 'n Ensiem-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam spesifiek vir die primêre teenliggaam word dan by die putte gevoeg, gevolg deur die substraat.

Bedek antigeen op die mikroplaat

  1. Bedek die putte van 'n 96-put ELISA-plaat met 100 μL gesuiwerde antigeen teen 'n konsentrasie van 1-10 μg/mL.
  2. Bedek plaat met 'n kleefplaatbedekking en inkubeer die plaat oornag by 4°C.
  3. Na inkubasie, verwyder die ongebonde antigeenoplossing uit die putte deur die plaat oor 'n wasbak te gooi.
  1. Blokkeer die oorblywende proteïenbindingsplekke in die bedekte putte deur 200 μL blokkeerbuffer by elke put te voeg, wat óf 5% nie-vet droë melk óf BSA in PBS kan wees.
  2. Inkubeer die plaat vir ten minste 2 uur by kamertemperatuur of oornag by 4°C.

Inkubasiemonster (antigeen) met die primêre teenliggaam

  1. Terwyl die putte geblokkeer word, berei die antigeen-teenliggaammengsel voor deur 150 μL monsterantigeen en 150 μL primêre teenliggaampie vir elke put in die toets te meng.
  2. Inkubeer hierdie mengsel vir 1 uur by 37°C.

Voeg antigeen-teenliggaammengsel by die put

  1. Verwyder nou die blokkeerbuffer uit die putte deur die plaat oor 'n wasbak te skuif.
  2. Was dan die putte met 1X PBS wat Tween-20 bevat.
  3. Voeg 100 μL van die monster antigeen-primêre teenliggaammengsel by.
  4. Inkubeer die plaat by 37°C vir 1 uur.
  5. Verwyder die monstermengsel deur die plaat oor 'n wasbak te gooi.
  6. Was dan die putte met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat om enige ongebonde teenliggaampies te verwyder.

Voeg die sekondêre teenliggaam by

  1. Voeg 100 μL van 'n ensiemgekonjugeerde sekondêre teenliggaam, wat in hierdie geval AP-gekonjugeerde teenliggaam is, by elke put.
  2. Inkubeer die plaat vir 1 uur by 37°C.
  3. Na inkubasie, was die plaat met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat.
  1. Voeg 100 μL van die substraatoplossing by elke put.
  2. Wag vir 5-10 min.
  3. Na 10 min, stop die ensiematiese reaksie deur 100 μL 2N swaelsuur by die putte te voeg. Meet dan die absorpsie in 'n mikroplaatleser binne 30 minute nadat die stopoplossing bygevoeg is

Ensiem-gekoppelde Immunosorbent Assay, of ELISA is 'n hoogs sensitiewe kwantitatiewe toets wat algemeen gebruik word om die konsentrasie van 'n analiet soos sitokiene en teenliggaampies in 'n biologiese monster te meet. Die algemene beginsel van hierdie toets behels drie stappe: begin met vang, of immobilisering, van die teikenanaliet op 'n mikroplaat, gevolg deur die opsporing van die analiet deur teikenspesifieke opsporingsproteïene, en laastens, ensiemreaksie, waar 'n gekonjugeerde ensiem verander sy substraat na 'n gekleurde produk. Gebaseer op verskillende metodes van vaslegging en opsporing, kan ELISA van vier tipes wees: direk, indirek, toebroodjie en mededingend.

Vir direkte ELISA word die teikenantigeen eers aan die plaat gebind, en word dan deur 'n spesifieke opsporingteenliggaam opgespoor. Hierdie metode word algemeen gebruik vir die sifting van teenliggaampies vir 'n spesifieke antigeen. Indirekte ELISA word gebruik om teenliggaampies in 'n monster op te spoor om immuunresponse te kwantifiseer. Die plaat word eers bedek met 'n spesifieke vasvangantigeen, wat die teiken-teenliggaam immobiliseer, en hierdie antigeen-teenliggaamkompleks word dan met 'n tweede teenliggaam opgespoor.

In die geval van toebroodjie-ELISA, is die teikenanaliet 'n antigeen, wat op die plaat vasgevang word met 'n vang-teenliggaam en dan deur die opsporing-teenliggaam opgespoor word, wat dus 'n teenliggaam-antigeen-teenliggaamtoebroodjie vorm. Hierdie metode is nuttig om die konsentrasie van 'n antigeen in 'n gemengde monster te meet.

Mededingende ELISA word gebruik wanneer slegs een teenliggaam beskikbaar is vir 'n teikenantigeen van belang. Die plaat word eers met die gesuiwerde antigeen bedek. Intussen word die monster wat die antigeen bevat vooraf met die teenliggaam geïnkubeer en dan by die plaat gevoeg om enige vrye teenliggaammolekules aan die geïmmobiliseerde antigeen te laat bind. Hoe hoër die sein vanaf die plaat, hoe laer is die antigeenkonsentrasie in die monster. In al die vier tipes ELISA, direk, indirek, toebroodjie en kompeterend, is die opsporings-teenliggaam óf direk aan die ensiem gekonjugeer óf kan indirek daaraan gekoppel word deur 'n ander teenliggaam of proteïen.

Die ensieme wat algemeen vir die reaksie gebruik word, is peperwortelperoksidase of alkaliese fosfatase met hul onderskeie substrate, wat beide 'n oplosbare, gekleurde produk produseer wat met 'n plaatleser gemeet en gekwantifiseer kan word. In hierdie video sal jy sien hoe om indirekte ELISA, toebroodjie ELISA en kompeterende ELISA uit te voer, gevolg deur voorbeelde van kwantifisering van die teikenanaliet vanaf die indirekte en toebroodjie ELISA-metodes.

Die eerste eksperiment sal demonstreer hoe om indirekte ELISA te gebruik om die teenwoordigheid van anti-griepvirus teenliggaampies te bepaal in serum verkry van griep-geïnfekteerde muise.

Om te begin, voeg 50 mikroliter gesuiwerde antigeen - in hierdie geval, 2 milligram per milliliter gesuiwerde A/PR/8 Influenza A-virus - by elke put van 'n 96-put ELISA-plaat. Bedek dan die plaat met 'n kleefbedekking en inkubeer dit oornag by 4 grade celsius om die antigeen aan die plaat te laat bind. Die volgende dag, verwyder die deklaagoplossing deur die plaat oor 'n wasbak te gooi. Blokkeer dan die oorblywende proteïenbindingsplekke in die bedekte putte deur 200 mikroliter van 'n blokkerende buffer-hier, 5% donkieserum in 1X PBS- by elke put te voeg. Laat die plaat vir ten minste 2 uur by kamertemperatuur inkubeer. Na die inkubasie, verwyder die blokkeerbuffer en was dan die plaat deur 200 mikroliter 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat by te voeg. Skuif die bord weer oor die wasbak om die was te verwyder.

Berei dan die toetsmonsters voor deur 460 mikroliter PBS by 'n vars buis te voeg, en voeg dan 40 mikroliter serum by om 'n 1 tot 12.5 verdunning te maak. Voeg dan 300 mikroliter PBS by 'n tweede buis, en voeg dan 100 mikroliter van die eerste verdunning by. Gaan voort met hierdie reeksverdunningsreeks totdat 'n finale monster met 'n verdunning van 1 tot 204 800 verkry word. Voeg die serie-verdunde serummonsters in drievoud by die putte. Bedek die plaat met 'n kleefdeksel en inkubeer by kamertemperatuur vir 'n uur. Verwyder dan die monsters deur die plaat in die wasbak te gooi en was dan die plaat deur 200 mikroliter 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat by te voeg. Weereens, draai die plaat om die was te verwyder.

Voeg nou 100 mikroliter van 'n ensiem-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam, wat in hierdie eksperiment 'n peperwortelperoksidase, of HRP, gekonjugeerde donkie-anti-muis sekondêr is, by elke put. Inkubeer die plaat vir een uur by kamertemperatuur, en draai die plaat om enige oortollige vloeistof te verwyder. Was die plaat met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat en dien dan 100 mikroliter van die indikatorsubstraat toe teen 'n konsentrasie van een milligram per milliliter in elke put. Inkubeer die plaat met die substraat vir 5 tot 10 minute by kamertemperatuur. In hierdie voorbeeld verander die kleurlose 3,3', 5,5' - tetrametielbenzidien, of TMB, substraat 'n blou kleur wanneer HRP teenwoordig is. Na 10 minute, stop die ensiematiese reaksie deur 100 mikroliter 2N swaelsuur by te voeg. Die monsters sal 'n geel kleur kry.

Plaas die plaat binne 30 minute nadat die stopoplossing bygevoeg is in 'n mikroplaatleser en lees die plaat by die toepaslike golflengte vir die substraat om die absorpsie van die putte te bepaal.

Om die toebroodjie-ELISA te begin, moet die plaat bedek word met gesuiwerde vang-teenliggaampies. Om dit te doen, voeg 100 mikroliter van die vasvangteenliggaam by 'n konsentrasie binne die 1-10 mikrogram per milliliter reeks, by elke put van 'n 96-put ELISA-plaat. Bedek dan die plaat met 'n kleefplaatbedekking en inkubeer dan die plaat oornag by 4 grade celsius. Na die inkubasie, verwyder die deklaagoplossing deur die plaat oor 'n wasbak te gooi.

Blokkeer nou die oorblywende proteïenbindingsplekke in die bedekte putte deur 200 mikroliter 5% nie-vet droë melk by die putte te voeg. Inkubeer die plaat by kamertemperatuur vir ten minste 2 uur. Verwyder dan die blokkeerbuffer en was dan die putte met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat. Verwyder die wasgoed deur die bord oor die wasbak te gooi. Voeg nou 100 mikroliter van die toetsmonster by die putte, verseël die plaat met 'n gombedekking en inkubeer dit dan vir 2 uur by kamertemperatuur. Na inkubasie, verwyder die monsters deur die plaat oor die wasbak te gooi en was dan die putte met 200 mikroliter 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat. Skuif die plaat oor die wasbak om die was te verwyder en voeg dan 100 mikroliter ensiem-gekonjugeerde opsporings-teenliggaampies by die putte.

Seël die plaat met 'n kleefdeksel. Laat die plaat vir 2 uur by kamertemperatuur inkubeer. Na die inkubasie, verwyder die ongebonde opsporings-teenliggaam deur die plaat oor 'n wasbak te gooi en was die putte met 200 mikroliter 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat. Voeg dan 100 mikroliter van die aanwysersubstraat by teen 'n konsentrasie van 1 milligram per milliliter, en inkubeer die plaat vir 5 tot 10 minute by kamertemperatuur. Na 10 minute, stop die ensiematiese reaksie deur 100 mikroliter 2N swaelsuur by die putte te voeg en lees dan die plaat binne 30 minute nadat die stopoplossing bygevoeg is in 'n mikroplaatleser.

Om 'n mededingende ELISA uit te voer, bedek eers die putte van 'n 96-put ELISA-plaat met 100 mikroliter gesuiwerde antigeen teen 'n konsentrasie van 1-10 mikrogram per milliliter. Bedek die plaat met 'n kleefplaatbedekking en inkubeer dan oornag by 4 grade celsius. Hierna, verwyder die ongebonde antigeenoplossing uit die putte deur die plaat oor 'n wasbak te gooi.

Blokkeer dan die oorblywende proteïenbindingsplekke in die bedekte putte deur 200 mikroliter blokkeerbuffer by elke put te voeg - hier, 5% nie-vet droë melk in PBS. Inkubeer die plaat vir ten minste 2 uur by kamertemperatuur. Terwyl die putte geblokkeer word, berei die antigeen-teenliggaammengsel in 'n 1,5 milliliter-buis voor deur 150 mikroliter monsterantigeen by 150 mikroliter primêre teenliggaampie vir elke put in die toets by te voeg. Inkubeer hierdie mengsel vir 1 uur by 37 grade celsius. Verwyder nou die blokkeerbuffer uit die putte deur die plaat oor 'n wasbak te skuif. Was dan die putte met 1X PBS wat Tween 20 bevat en voeg dan 100 mikroliter van die monster antigeen-primêre teenliggaammengsel by.

Laat die plaat vir een uur by 37 grade celsius inkubeer. Verwyder dan die monstermengsel deur die plaat oor 'n wasbak te gooi en was dan die putte met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat om enige ongebonde teenliggaampie te verwyder. Voeg 100 mikroliter van 'n ensiem-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam by elke put en inkubeer die plaat vir een uur by 37 grade celsius.Hierna, was die plaat met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat en voeg dan 100 mikroliter van die substraatoplossing by elke put. Wag vir 5-10 minute. Na 10 minute, stop die ensiematiese reaksie deur 100 mikroliter 2N swaelsuur by te voeg en meet dan die absorpsie in 'n mikroplaatleser binne 30 minute nadat die stopoplossing bygevoeg is.

Vir die semi-kwantitatiewe indirekte ELISA-toets is die teenwoordigheid van influensa A-virus-teenliggaampies in serieverdunde monsters van serum van influensa A-besmette muise bepaal deur die absorbansie van elke put by 405 nanometer in 'n plaatleser te lees. Hierdie rou data word vir berekeningsdoeleindes na 'n sigblad uitgevoer. In hierdie eksperiment is die serie-verdunde serummonsters, wat wissel van 1 - 12,5 tot 1 - 204 800, in drievoud herhaal.

Om die data te ontleed, word die gemiddelde absorpsiewaarde dus vir elke stel drievoude bereken deur al die waardes vir elke verdunning by te tel en die som deur 3 te deel. Sodra die gemiddelde vir elke stel drievoude bepaal is, word die gemiddelde OD450-lesings teen geplot die reeksverdunnings. Die OD-lesings neem af soos die serum verdun word, wat aandui dat minder teenliggaampies in die meer verdunde monsters gevind word. In die kwantitatiewe toebroodjie ELISA is verdunnings van bekende standaard, in hierdie geval gerekombineerde Human TNFalpha, by 'n 96-put plaat gevoeg en saam met die onbekende monsters gelees.

Om die standaardkurwe te skep, is die gemiddelde absorpsiewaarde vir elke stel lesings van die bekende konsentrasies bereken. Daarna is die gemiddelde absorpsiewaarde op die y-as geplot teen die bekende proteïenkonsentrasies op die x-as. 'n Beste passingskromme word deur die punte in die grafiek bygevoeg.

Sodra die standaardkurwe gegenereer is, kan die hoeveelheid TNFalfa-proteïen in die toetsmonster bepaal word deur eers die gemiddelde absorpsiewaarde vir die toetsmonster te bereken. In hierdie voorbeeld het die toetsmonsters OD450-lesings van 0.636 en 0. 681 gegee. Deur hierdie waardes by te tel en die som deur 2 te deel gee 'n gemiddeld van 0.659. Vanaf die y-as op die standaardkrommegrafiek, verleng 'n horisontale lyn vanaf hierdie absorpsiewaarde na die standaardkromme. By die snypunt, strek 'n vertikale lyn na die x-as en lees die ooreenstemmende konsentrasie wat, in hierdie toetsmonster, ooreenstem met 'n TNFalfa-konsentrasie van 38.72 pikogram per milliliter.

Intekening vereis. Beveel asseblief JoVE aan by jou bibliotekaris.

Resultate

In die volgende voorbeeld van 'n indirekte ELISA, is die teenwoordigheid van influenza A-virus (IAV)-spesifieke IgG in die serum van IAV-geïnfekteerde muise bepaal. C57Bl/6 muise is geïnfekteer met griep A virus (A/PR/8 10 5 PFU in 100 µL PBS i.p.) en serum is 28 dae later versamel. Om die hoeveelheid IAV-spesifieke IgG in die serum te kwantifiseer, is 96-put ELISA plate bedek met gesuiwerde A/PR/8 Influenza A virus (50 µL/put van 2 mg/ml PBS virus) oornag by 4°C. . Bedekte plate is vir 1 uur by kamertemperatuur geblokkeer met 5% normale donkieserum in PBS, gevolg deur inkubasie met verdunde serummonsters van IAV-uitgedaagde muise oornag by 4°C. Die serum is aanvanklik 1:12.5 verdun, gevolg deur 1:4 verdunnings (verdunningsreeks - 1:12.5 tot 1:204 800). Na was, is plate geïnkubeer met 'n alkaliese fosfatase (AP)-gekonjugeerde donkie anti-muis IgG vir 1 uur. Die borde is gewas, en toe bl-Nitrofenielfosfaat (PNPP 1 mg/mL, 100 µL/put) is bygevoeg. Die kleurlose PNPP-oplossing verander na 'n geel kleur wanneer AP teenwoordig is. Na 5-10 minute is die ensiematiese reaksie gestop deur 100 µL/put 2N H by te voeg2SO4. Die plaat is gelees op 'n mikroplaatleser by 405 nm. Die resultate wat verkry is, word in Tabel 1 en Figuur 1 getoon.

Voorbeeld Wells OD405 Beteken
Serum 1:12.5 A1 2.163 2.194
B1 2.214
C1 2.204
Serum 1:50 A1 1.712 1.894
B1 2.345
C1 1.624
Serum 1:200 A1 1.437 1.541
B1 1.73
C1 1.456
Serum 1:800 A1 1.036 0.957
B1 0.912
C1 0.923
Serum 1:3200 A1 0.579 0.48
B1 0.431
C1 0.429
Serum 1:12800 A1 0.296 0.281
B1 0.312
C1 0.236
Serum 1:51200 A1 0.308 0.283
B1 0.299
C1 0.243
Serum 1:204800 A1 0.315 0.303
B1 0.298
C1 0.297

Tabel 1: Indirekte ELISA-toetsdata. Serumverdunnings (van 1:12,5 tot 1:204 800), van influensa A-virus (IAV)-geïnfekteerde muise wat IAV-spesifieke IgG, optiese digtheid (OD) (405 nm) waardes en gemiddelde OD bevat405 waardes.


Figuur 1: Indirekte ELISA-toetsverspreidingsplot van gemiddelde OD405 waardes (+ S. D.) en serumverdunnings (van 1:12.5 tot 1:204 800), van influensa A-virus (IAV)-spesifieke IgG in die serum van IAV-geïnfekteerde muise. Die OD405 waardes kan omgekeerd gekorreleer word met die serumverdunnings.

In die volgende voorbeeld van 'n toebroodjie-ELISA, is 'n 1:2.5 verdunning van rekombinante menslike TNFα-standaarde (begin by 'n konsentrasie van 75 pg/mL) by die aangeduide putte van 'n 96-put platbodem plaat gevoeg. Hierdie standaarde het gelei tot 'n ooreenstemmende 2,5-voudige verandering in die absorpsielesings.

Voorbeeld Konsentrasie (pg/ml) Wells Waardes Gemiddelde waarde Terug Konsentrasie Berekening Gemiddeld
Standerd 1 75 A1 1.187 1.169 76.376 75.01
A2 1.152 73.644
Standerd 2 30 B1 0.534 0.52 30.827 29.962
B2 0.506 29.098
Standerd 3 12 C1 0.23 0.217 12.838 12.105
C2 0.204 11.372
Standerd 4 4.8 D1 0.09 0.084 5.055 4.726
D2 0.078 4.398
Standerd 5 1.92 E1 0.033 0.031 1.941 1.86
E2 0.03 1.778
Standerd 6 0.768 F1 0.009 0.011 0.626 0.764
F2 0.014 0.901
Standerd 7 0.307 G1 0.002 0.004 0.238 0.377
G2 0.007 0.516

Tabel 2: TNF & # 945 Sandwich ELISA standaard kurwe data. 'n 1:2.5 verdunning van rekombinante menslike TNFα standaarde (75 tot 0.3 pg/mL), OD (450 nm) waardes, gemiddelde OD450 waardes, terugkonsentrasieberekeninge en hul gemiddeldes.


Figuur 2: Standaardkurwe vir TNF & # 945 toebroodjie ELISA. 'n 1:2.5 verdunning van rekombinante menslike TNFα-standaarde (75 tot 0.3 pg/mL) is ontleed met toebroodjie-ELISA. Die OD450 waardes kan direk met die standaard verdunningskonsentrasies gekorreleer word. Die hoeveelheid TNFα-proteïen in die toetsmonster is bepaal met behulp van die standaardkurwe, wat ooreenstem met 'n konsentrasie van 38.72 pg/mL.

Sodra die standaardkurwe gegenereer is, is die hoeveelheid TNFα-proteïen in die toetsmonster bepaal. In hierdie toebroodjie-ELISA-voorbeeld het die toetsmonsters OD gegee450 lesings van 0,636 en 0,681, wat 'n gemiddeld van 0,6585 gee. Wanneer hierdie OD450-lesing op die bostaande grafiek geplot word, stem dit ooreen met 'n TNFα-konsentrasie van 38.72 pg/ml.

Intekening vereis. Beveel asseblief JoVE aan by jou bibliotekaris.

Aansoeke en Opsomming

Soos gedemonstreer, val 'n reeks immunotoetse (met geringe variasie in protokolle) binne die ELISA-tegniekfamilie. Die bepaling van watter weergawe van ELISA om te gebruik hang af van 'n aantal faktore, insluitend watter antigeen opgespoor word, die monoklonale teenliggaampie beskikbaar vir 'n spesifieke antigeen, en die verlangde sensitiwiteit van die toets (5). Sommige sterk- en swakpunte van die verskillende ELISA's wat hierin beskryf word, is:

ELISA Sterkpunte Swakhede
Indirek 1) Hoë sensitiwiteit as gevolg van die feit dat veelvuldige ensiem-gekonjugeerde sekondêre teenliggaampies aan die primêre teenliggaampie kan bind 1) Hoë agtergrondsein kan voorkom omdat die bedekking van die antigeen van belang vir die plaat nie spesifiek is nie (d.w.s. alle proteïene in die monster sal die plaat bedek)
2) Baie verskillende primêre teenliggaampies kan herken word deur 'n enkele ensiem-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam wat die gebruiker die buigsaamheid gee om dieselfde ensiem-gekonjugeerde sekondêre teenliggaampie in baie verskillende ELISA's te gebruik (ongeag die antigeen wat opgespoor word)
3) Beste keuse wanneer slegs 'n enkele teenliggaam vir die antigeen van belang beskikbaar is
Toebroodjie 1) Die gebruik van antigeen-spesifieke vaslegging en opsporing monoklonale teenliggaampies verhoog die sensitiwiteit en spesifisiteit van die toets (in vergelyking met die indirekte ELISA) 1) Die optimalisering van die konsentrasies van die vang en opsporing van monoklonale teenliggaampies kan moeilik wees (veral vir nie-kommersiële kits)
2) Beste keuse vir die opsporing van 'n groot proteïen met veelvuldige epitope (soos 'n sitokien)
Mededingend 1) Onsuiwer monsters kan gebruik word 1) Vereis 'n groot hoeveelheid hoogs suiwer antigeen om gebruik te word om plaat te bedek
2) Minder sensitiwiteit vir reagensverdunningseffekte
3) Ideaal vir die opsporing van klein molekules (soos 'n hapteen)

Tabel 3: Opsomming. 'n Opsomming van die sterk- en swakpunte van die verskillende ELISA-tegnieke.

Alhoewel dit 'n eenvoudige en nuttige tegniek is, is daar ook 'n paar nadele aan enige ELISA. Een daarvan is die onsekerheid van die hoeveelheid van die proteïen van belang in die toetsmonsters. As die hoeveelheid te hoog of te laag is, kan die absorpsiewaardes wat deur die mikroplaatleser verkry word, onderskeidelik bo of onder die grense van die standaardkurwe val. Dit sal dit moeilik maak om die hoeveelheid proteïen wat in die toetsmonsters teenwoordig is akkuraat te bepaal. As die waardes te hoog is, kan die toetsmonster verdun word voordat dit by die putte van die plaat gevoeg word. Die finale waardes sal dan aangepas moet word volgens die verdunningsfaktor. Soos genoem, vereis tuisgemaakte kits dikwels noukeurige optimalisering van die teenliggaamkonsentrasies wat gebruik word om 'n hoë sein-tot-geraas-verhouding te lewer.

Intekening vereis. Beveel asseblief JoVE aan by jou bibliotekaris.

Verwysings

  1. Porstmann, T. en Kiessig S.T. Ensiem immunotoets tegnieke. 'n Oorsig. Tydskrif vir Immunologiese Metodes.150 (1-2), 5-21 (1992).
  2. Suleyman Aydin. 'n Kort geskiedenis, beginsels en tipes ELISA, en ons laboratorium-ervaring met peptied-/proteïenontledings met behulp van ELISA. Peptiede, 72, 4-15 (2015).
  3. Gan. S. D. en Patel K. R. Ensiem Immunoassay en Ensiem-gekoppelde Immunosorbent Assay. Tydskrif vir Ondersoekende Dermatologie, 133 (9), 1-3 (2013).
  4. Kohl, T. O. en Ascoli C.A. Immunometriese teenliggaamtoebroodjie-ensiemgekoppelde immunosorbenttoets. Cold Spring Harbor-protokolle, 1 (6), (2017).
  5. Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka, H., en Morimoto S. Ensiem-gekoppelde immunosorbent-toets vir die kwantitatiewe/kwalitatiewe analise van plant sekondêre metaboliete. Tydskrif vir natuurlike medisyne, 72 (1), 32-42 (2018).

Transkripsie

Neem asseblief kennis dat alle vertalings outomaties gegenereer word.

Ensiem-gekoppelde Immunosorbent Assay, of ELISA is 'n hoogs sensitiewe kwantitatiewe toets wat algemeen gebruik word om die konsentrasie van 'n analiet soos sitokiene en teenliggaampies in 'n biologiese monster te meet. Die algemene beginsel van hierdie toets behels drie stappe: begin met vang, of immobilisering, van die teikenanaliet op 'n mikroplaat, gevolg deur die opsporing van die analiet deur teikenspesifieke opsporingsproteïene, en laastens, ensiemreaksie, waar 'n gekonjugeerde ensiem verander sy substraat na 'n gekleurde produk. Gebaseer op verskillende metodes van vaslegging en opsporing, kan ELISA van vier tipes wees: direk, indirek, toebroodjie en mededingend.

Vir direkte ELISA word die teikenantigeen eers aan die plaat gebind, en word dan deur 'n spesifieke opsporingteenliggaam opgespoor. Hierdie metode word algemeen gebruik vir die sifting van teenliggaampies vir 'n spesifieke antigeen. Indirekte ELISA word gebruik om teenliggaampies in 'n monster op te spoor om immuunresponse te kwantifiseer. Die plaat word eers bedek met 'n spesifieke vasvangantigeen, wat die teiken-teenliggaam immobiliseer, en hierdie antigeen-teenliggaamkompleks word dan met 'n tweede teenliggaam opgespoor.

In die geval van toebroodjie-ELISA, is die teikenanaliet 'n antigeen, wat op die plaat vasgevang word met 'n vang-teenliggaam en dan deur die opsporing-teenliggaam opgespoor word, wat dus 'n teenliggaam-antigeen-teenliggaamtoebroodjie vorm. Hierdie metode is nuttig om die konsentrasie van 'n antigeen in 'n gemengde monster te meet.

Mededingende ELISA word gebruik wanneer slegs een teenliggaam beskikbaar is vir 'n teikenantigeen van belang. Die plaat word eers met die gesuiwerde antigeen bedek. Intussen word die monster wat die antigeen bevat vooraf met die teenliggaam geïnkubeer en dan by die plaat gevoeg om enige vrye teenliggaammolekules aan die geïmmobiliseerde antigeen te laat bind. Hoe hoër die sein vanaf die plaat, hoe laer is die antigeenkonsentrasie in die monster. In al die vier tipes ELISA, direk, indirek, toebroodjie en kompeterend, is die opsporings-teenliggaam óf direk aan die ensiem gekonjugeer óf kan indirek daaraan gekoppel word deur 'n ander teenliggaam of proteïen.

Die ensieme wat algemeen vir die reaksie gebruik word, is peperwortelperoksidase of alkaliese fosfatase met hul onderskeie substrate, wat beide 'n oplosbare, gekleurde produk produseer wat met 'n plaatleser gemeet en gekwantifiseer kan word. In hierdie video sal jy sien hoe om indirekte ELISA, toebroodjie ELISA en kompeterende ELISA uit te voer, gevolg deur voorbeelde van kwantifisering van die teikenanaliet vanaf die indirekte en toebroodjie ELISA-metodes.

Die eerste eksperiment sal demonstreer hoe om indirekte ELISA te gebruik om die teenwoordigheid van anti-griepvirus teenliggaampies te bepaal in serum verkry van griep-geïnfekteerde muise.

Om te begin, voeg 50 mikroliter gesuiwerde antigeen - in hierdie geval, 2 milligram per milliliter gesuiwerde A/PR/8 Influenza A-virus - by elke put van 'n 96-put ELISA-plaat. Bedek dan die plaat met 'n kleefbedekking en inkubeer dit oornag by 4 grade celsius om die antigeen aan die plaat te laat bind. Die volgende dag, verwyder die deklaagoplossing deur die plaat oor 'n wasbak te gooi. Blokkeer dan die oorblywende proteïenbindingsplekke in die bedekte putte deur 200 mikroliter van 'n blokkerende buffer-hier, 5% donkieserum in 1X PBS- by elke put te voeg. Laat die plaat vir ten minste 2 uur by kamertemperatuur inkubeer. Na die inkubasie, verwyder die blokkeerbuffer en was dan die plaat deur 200 mikroliter 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat by te voeg. Skuif die bord weer oor die wasbak om die was te verwyder.

Berei dan die toetsmonsters voor deur 460 mikroliter PBS by 'n vars buis te voeg, en voeg dan 40 mikroliter serum by om 'n 1 tot 12.5 verdunning te maak. Voeg dan 300 mikroliter PBS by 'n tweede buis, en voeg dan 100 mikroliter van die eerste verdunning by. Gaan voort met hierdie reeksverdunningsreeks totdat 'n finale monster met 'n verdunning van 1 tot 204 800 verkry word. Voeg die serie-verdunde serummonsters in drievoud by die putte. Bedek die plaat met 'n kleefdeksel en inkubeer by kamertemperatuur vir 'n uur. Verwyder dan die monsters deur die plaat in die wasbak te gooi en was dan die plaat deur 200 mikroliter 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat by te voeg. Weereens, draai die plaat om die was te verwyder.

Voeg nou 100 mikroliter van 'n ensiem-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam, wat in hierdie eksperiment 'n peperwortelperoksidase, of HRP, gekonjugeerde donkie-anti-muis sekondêr is, by elke put. Inkubeer die plaat vir een uur by kamertemperatuur, en draai die plaat om enige oortollige vloeistof te verwyder. Was die plaat met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat en dien dan 100 mikroliter van die indikatorsubstraat toe teen 'n konsentrasie van een milligram per milliliter in elke put. Inkubeer die plaat met die substraat vir 5 tot 10 minute by kamertemperatuur. In hierdie voorbeeld word die kleurlose 3,3', 5,5'-tetrametielbenzidien, of TMB, substraat 'n blou kleur wanneer HRP teenwoordig is. Na 10 minute, stop die ensiematiese reaksie deur 100 mikroliter 2N swaelsuur by te voeg. Die monsters sal 'n geel kleur kry.

Plaas die plaat binne 30 minute nadat die stopoplossing bygevoeg is in 'n mikroplaatleser en lees die plaat by die toepaslike golflengte vir die substraat om die absorpsie van die putte te bepaal.

Om die toebroodjie-ELISA te begin, moet die plaat bedek word met gesuiwerde vang-teenliggaampies. Om dit te doen, voeg 100 mikroliter van die vasvangteenliggaam by 'n konsentrasie binne die 1-10 mikrogram per milliliter reeks, by elke put van 'n 96-put ELISA-plaat. Bedek dan die plaat met 'n kleefplaatbedekking en inkubeer dan die plaat oornag by 4 grade celsius. Na die inkubasie, verwyder die deklaagoplossing deur die plaat oor 'n wasbak te gooi.

Blokkeer nou die oorblywende proteïenbindingsplekke in die bedekte putte deur 200 mikroliter 5% nie-vet droë melk by die putte te voeg. Inkubeer die plaat by kamertemperatuur vir ten minste 2 uur. Verwyder dan die blokkeerbuffer en was dan die putte met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat. Verwyder die wasgoed deur die bord oor die wasbak te gooi. Voeg nou 100 mikroliter van die toetsmonster by die putte, verseël die plaat met 'n gombedekking en inkubeer dit dan vir 2 uur by kamertemperatuur. Na inkubasie, verwyder die monsters deur die plaat oor die wasbak te gooi en was dan die putte met 200 mikroliter 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat. Skuif die plaat oor die wasbak om die was te verwyder en voeg dan 100 mikroliter ensiem-gekonjugeerde opsporings-teenliggaampies by die putte.

Seël die plaat met 'n kleefdeksel. Laat die plaat vir 2 uur by kamertemperatuur inkubeer. Na die inkubasie, verwyder die ongebonde opsporings-teenliggaam deur die plaat oor 'n wasbak te gooi en was die putte met 200 mikroliter 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat. Voeg dan 100 mikroliter van die aanwysersubstraat by teen 'n konsentrasie van 1 milligram per milliliter, en inkubeer die plaat vir 5 tot 10 minute by kamertemperatuur. Na 10 minute, stop die ensiematiese reaksie deur 100 mikroliter 2N swaelsuur by die putte te voeg en lees dan die plaat binne 30 minute nadat die stopoplossing bygevoeg is in 'n mikroplaatleser.

Om 'n mededingende ELISA uit te voer, bedek eers die putte van 'n 96-put ELISA-plaat met 100 mikroliter gesuiwerde antigeen teen 'n konsentrasie van 1-10 mikrogram per milliliter. Bedek die plaat met 'n kleefplaatbedekking en inkubeer dan oornag by 4 grade celsius. Hierna, verwyder die ongebonde antigeenoplossing uit die putte deur die plaat oor 'n wasbak te gooi.

Blokkeer dan die oorblywende proteïenbindingsplekke in die bedekte putte deur 200 mikroliter blokkeerbuffer by elke put te voeg - hier, 5% nie-vet droë melk in PBS. Inkubeer die plaat vir ten minste 2 uur by kamertemperatuur. Terwyl die putte geblokkeer word, berei die antigeen-teenliggaammengsel in 'n 1,5 milliliter-buis voor deur 150 mikroliter monsterantigeen by 150 mikroliter primêre teenliggaampie vir elke put in die toets by te voeg. Inkubeer hierdie mengsel vir 1 uur by 37 grade celsius. Verwyder nou die blokkeerbuffer uit die putte deur die plaat oor 'n wasbak te skuif. Was dan die putte met 1X PBS wat Tween 20 bevat en voeg dan 100 mikroliter van die monster antigeen-primêre teenliggaammengsel by.

Laat die plaat vir een uur by 37 grade celsius inkubeer. Verwyder dan die monstermengsel deur die plaat oor 'n wasbak te gooi en was dan die putte met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat om enige ongebonde teenliggaampie te verwyder. Voeg 100 mikroliter van 'n ensiem-gekonjugeerde sekondêre teenliggaam by elke put en inkubeer die plaat vir een uur by 37 grade celsius. Hierna, was die plaat met 1X PBS wat 1% Tween-20 bevat en voeg dan 100 mikroliter van die substraatoplossing by elke put. Wag vir 5-10 minute. Na 10 minute, stop die ensiematiese reaksie deur 100 mikroliter 2N swaelsuur by te voeg en meet dan die absorpsie in 'n mikroplaatleser binne 30 minute nadat die stopoplossing bygevoeg is.

Vir die semi-kwantitatiewe indirekte ELISA-toets is die teenwoordigheid van influensa A-virus-teenliggaampies in serieverdunde monsters van serum van influensa A-besmette muise bepaal deur die absorbansie van elke put by 405 nanometer in 'n plaatleser te lees. Hierdie rou data word vir berekeningsdoeleindes na 'n sigblad uitgevoer. In hierdie eksperiment is die serie-verdunde serummonsters, wat wissel van 1 - 12,5 tot 1 - 204 800, in drievoud herhaal.

Om die data te ontleed, word die gemiddelde absorpsiewaarde dus vir elke stel drievoude bereken deur al die waardes vir elke verdunning by te tel en die som deur 3 te deel.Sodra die gemiddelde vir elke stel drievoude bepaal is, word die gemiddelde OD450-lesings teen die reeksverdunnings geplot. Die OD-lesings neem af soos die serum verdun word, wat aandui dat minder teenliggaampies in die meer verdunde monsters gevind word. In die kwantitatiewe toebroodjie ELISA is verdunnings van bekende standaard, in hierdie geval gerekombineerde Human TNFalpha, by 'n 96-put plaat gevoeg en saam met die onbekende monsters gelees.

Om die standaardkurwe te skep, is die gemiddelde absorpsiewaarde vir elke stel lesings van die bekende konsentrasies bereken. Daarna is die gemiddelde absorpsiewaarde op die y-as geplot teen die bekende proteïenkonsentrasies op die x-as. 'n Beste passingskromme word deur die punte in die grafiek bygevoeg.

Sodra die standaardkurwe gegenereer is, kan die hoeveelheid TNFalfa-proteïen in die toetsmonster bepaal word deur eers die gemiddelde absorpsiewaarde vir die toetsmonster te bereken. In hierdie voorbeeld het die toetsmonsters OD450-lesings van 0.636 en 0. 681 gegee. Deur hierdie waardes by te tel en die som deur 2 te deel gee 'n gemiddeld van 0.659. Vanaf die y-as op die standaardkrommegrafiek, verleng 'n horisontale lyn vanaf hierdie absorpsiewaarde na die standaardkromme. By die snypunt, strek 'n vertikale lyn na die x-as en lees die ooreenstemmende konsentrasie wat, in hierdie toetsmonster, ooreenstem met 'n TNFalfa-konsentrasie van 38.72 pikogram per milliliter.


Kyk die video: ELISA Test direkt, indirekt, SANDWICH-ELISA - Biologie, Immunbiologie (September 2022).


Kommentaar:

  1. Kajilkree

    Ek bied u aan om die webwerf te besoek, wat baie artikels oor u belangstel.

  2. Ammi

    I apologize, but in my opinion you admit the mistake. Ek kan dit bewys. Skryf vir my in PM, sal ons bespreek.

  3. Kazrakazahn

    Na my mening is u verkeerd. Ek kan die posisie verdedig.



Skryf 'n boodskap